专题笔谈│儿童脓毒症的免疫炎症损伤评价与干预

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专题笔谈│儿童脓毒症的免疫炎症损伤评价与干预

刘婷彦1， 陆国平1，2

脓毒症的免疫反应最初通过细胞膜和细胞内模式识别受体感应病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）和内源的损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMP）来激活。模式识别受体的激活会启动固有免疫，中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞大量释放肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6 和 γ 干扰素 （interferon-γ，IFN-γ） 等促炎细胞因子，触发细胞因子级联反应。在感染的局部形成炎症反应，当治疗不及时或无效时，激活的固有免疫系统持续产生促炎细胞因子，炎症反应扩散到全身，即广泛的全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS） ［4］。SIRS过程中释放的促炎细胞因子可以刺激白细胞（主要是巨噬细胞）产生大量一氧化氮，同时促进了白细胞黏附到内皮细胞，然后将其迁移到炎症位置。上述促炎因子可进一步激活T淋巴细胞和NK细胞，刺激其产生IFN-γ，与IL-12一起，在单核巨噬系统、树突状细胞等的参与下，诱导CD4+淋巴细胞向Th1表型分化，而Th1淋巴细胞开始产生IFN-γ、IL-2、IL-3、TNF-β促进炎症反应。此外，INF-γ抑制CD4+淋巴细胞向Th2表型（产生IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β等）的分化。此外，从骨髓中释放的活化粒细胞会产生中性粒细胞外陷阱来捕获微生物，这可能会加剧炎症和组织损伤。脓毒症的炎症反应还以神经内分泌改变、补体和凝血系统的激活以及脂质介质的改变为特征，所有这些都具有增强的协同作用来增强炎症。内皮的激活表现为促凝血和屏障渗漏，并促进了部分患儿发展为脓毒症休克、器官功能障碍和最终死亡 ［5］。

然而，免疫过度激活引起的代偿性抗炎反应综合征（compensatory anti-inflammatory response syndrome，CARS）可能占主导地位。例如，早期发现表示脓毒症患者的循环单核细胞因暴露于PAMP而受损引起促炎细胞因子分泌。固有免疫细胞（如树突状细胞、自然杀伤细胞和中性粒细胞）也表现出分泌更多的抗炎或免疫调节分子，如IL-10，从而抑免疫效应机制。这些固有免疫反应归咎于最初的炎症性或高炎症引发的代谢和表观遗传重新编程和骨髓中的白细胞分化或生成的改变 ［6］。脓毒症也可引起适应性免疫反应障碍。固有免疫细胞表面模式识别受体识别不同的PAMP后会产生不同的炎症因子谱，诱导初始T细胞分化为不同的亚群，从而决定特异性免疫应答类型。胞内菌和病毒主要由Th1细胞介导的细胞免疫发挥杀伤作用，Th2细胞通过激活B细胞抵抗细胞外的病原体。Th17通过分泌IL-17，促进中性粒细胞募集、抗菌肽产生和增强屏障功能，介导抗真菌和细菌的保护性免疫。调节性 T细胞（regulatory T cells，Treg）分泌IL-10和转化生长因子β （transfo-rming growth factor beta，TGF-β），确保宿主自身反应性淋巴细胞不会对宿主组织或无害抗原产生反应 ［7］。

在促炎和抗炎的免疫失平衡状态下，脓毒症疾病后期最终进入到持续炎症-免疫抑制-分解代谢综合征阶段（persistent inflammation-immunosu-ppression catabolism syndrome，PICS）。这种免疫功能低下的状态可能会产生严重后果，例如潜在病毒感染的重新激活，以及宿主非常容易受到继发感染，通常伴有机会性、难以治疗的病原体。脓毒症患者的免疫抑制涉及不同的细胞类型和特征，与免疫细胞凋亡增强、T 细胞耗竭、细胞通过表观遗传变化重新编程以及活化细胞表面分子表达减少有关［8］。细胞凋亡主要发生在 CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞、B 细胞、自然杀伤 （NK） 细胞和滤泡树突细胞中，并且涉及死亡受体和线粒体介导的途径。脓毒症患者的血液以及脾脏和肺中的 T 细胞产生细胞因子的能力降低。CD8+ T 细胞显示出细胞增殖减弱、细胞毒性功能受损以及 IL-2 和IFN-γ 生成减弱［9］。脓毒症免疫麻痹状态中，两种免疫抑制细胞，调节性 T （Treg） 细胞和髓源性抑制细胞 （myeloid-derived suppressor cells，MDSCs） 数量增加，MDSCs可通过多种机制阻碍免疫功能，包括剥夺 L-精氨酸（T 细胞功能所必需的）、刺激 Treg 细胞扩增以及抑制巨噬细胞和树突细胞功能。MDSCs的扩增与脓毒症危重患者继发感染的风险增加有关［10］。免疫检查点也参与了脓毒症诱导的免疫抑制。在脓毒症领域广泛研究的检查点是程序性细胞死亡-1 （PD-1）。T 细胞上 PD-1 的触发导致免疫抑制分子的释放，并可能导致细胞凋亡。PD-1在外周血T细胞表达增强与T细胞增殖能力减弱、医院感染发生率增加以及脓毒症患者死亡率增加有关［11］。脓毒症患者的血液单核细胞和粒细胞上的 PD-1 也表达增强。免疫抑制的另一个关键特征是单核细胞和巨噬细胞的重编程，表现为产生促炎细胞因子的能力受损（也称为LPS 耐受性）和 MHC II类的表面表达减少。脓毒症患者的血白细胞在体外刺激后释放促炎细胞因子（如 TNF、IL-1α、IL-6 和 IL-12）的能力减弱，而其释放抗炎介质如IL-1受体拮抗剂和IL-10的能力则没有影响或增强［12］。

儿童脓毒症免疫炎症损伤的评价有赖于传统评价指标例如疾病急性相释放的大量细胞因子，临床炎症指标CRP、PCT、SAA，免疫功能包括免疫球蛋白、补体、淋巴细胞亚群等［13］。同时，一些具有临床转化潜力的新型生物标志物的开发可以联合临床指标提高对疾病发展和预后的评估。新近关注的代表性免疫相关生物学标志物包括：（1）MDSCs，一种在脓毒症免疫抑制期急剧增加的未成熟髓系细胞 ；（2）TREM-1，与炎症级联反应相关的可溶性蛋白；（3）CD64，表达在中性粒细胞表面并在感染数小时可显著升高；（4）高迁移率族蛋白（high-mobility group box 1，HMGB-1），先天性免疫细胞在应对感染时分泌的一种核蛋白，为晚期炎症因子，可导致炎症细胞激活［14］。

儿童脓毒症免疫功能受损机制复杂，免疫指标之间互相关联，需要全面评估脓毒症的免疫炎症损伤需要联合分析多个免疫学指标，此外还需要考虑生物标志物的动态变化，动态评价和动态监测更能指导临床诊疗。

脓毒症的免疫反应呈高度动态，促炎和抗炎可同时存在，不断变化，对于某个体病例多数难以评价，但总体上是早期以炎症反应为主，导致器官功能受损，后期以抗炎症因子增高和淋巴细胞凋亡，表现免疫抑制和继发感染。调节紊乱的免疫系统，重建机体免疫平衡状态，恢复正常免疫功能，对改善患儿预后起到关键作用。基于脓毒症和系统性炎症的免疫反应病理生理学，目前改善转脓毒症相关免疫紊乱的具体疗法一方面是降低抗炎和抑炎因子水平，促使炎症-抗炎达到低水平稳态；另一方面是从细胞水平改善免疫功能。

随着脓毒症血液净化技术的发展，新的吸附膜材和滤过材料可显著清除脓毒症患儿血液循环中异常的细胞因子、内毒素等炎症介质，为脓毒症炎症-抗炎水平，逆向稳定细胞水平，可能有助于实现免疫反应水平降低，保护器官功能。血液净化治疗调节脓毒症免疫反应的主要假说包括“细胞因子峰值假说”、“阈值免疫调节假说”及“白细胞趋化动力学模型”［15］。鉴于此脓毒症患儿血液净化潜在治疗靶点包括：清除血液循环中的病原体（细菌、真菌及病毒等）、降低血液中细胞因子水平、清除血液循环中的内毒素和其他损伤相关模式分子、清除被异常激活的白细胞或重组白细胞等。但不同的血液净化滤器和模式对不同分子的清除能力不一。目前传统合成滤器（多数分子质量30ku以下）和模式（透析和滤过技术）的清除炎症因子和改善临床疗效的效能并未得到循证的支持。血浆置换技术、血液吸附技术（包括血液灌流器Cytosorb和HA330/CA330，和滤器吸附技术包括Oxiris和PMX）获得了一定的疗效，但多中心、前瞻性研究的结果还不足以支持其价值。血液吸附通过表面经过特殊处理的高吸附膜材，降低炎症介质负荷，抑制上下游炎症瀑布反应。HA-330由苯乙烯二乙烯基苯共聚物组成，是专用于改善危重症患儿细胞因子风暴的一次性树脂血液灌流器，可吸附多种中分子质量的炎性细胞因子（IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、HMGB1）。CytoSorb滤器由生物相容性的聚苯乙烯二乙烯苯共聚物珠组成，在脓毒症早期显示出较好的细胞因子清除效果，还可以吸附活化的单核细胞和中性粒细胞。以AN69为基础的oXiris膜带正电的聚亚胺乙烯层修饰，能够吸附带负电的内毒素分子，降低循环内毒素和细胞因子水平［16］。目前有关脓毒症血液净化治疗的临床证据多来自证据强度欠佳的队列研究，仍需要更多随机对照研究来炎症血液净化对脓毒症患儿紊乱的免疫反应的调节作用。

脓毒症早期免疫调节的尝试专注于减少促炎反应，却较少关注对免疫细胞功能的影响 ［17］。目前改善免疫细胞功能的药物包括：粒巨噬细胞菌落刺激因子（granulocyte-macrophage colong-stimulating factor，GM-CSF）、INF-γ、胸腺肽（Tα1）、IL-7和PD-1拮抗剂等。其中GM-CSF具有较多的临床实验证据。一项在患有MODS的脓毒症患儿中进行的单中心RCT发现接受GM-CSF的儿童体外刺激全血细胞诱导TNF-α产生能力恢复到正常水平，且没有出现任何继发医院感染的受试者［18］。INF-γ由活化T细胞分泌，是促进单核、巨噬细胞活化的关键性细胞因子，并能上调其表面HLA-DR的表达。但仅适用于脓毒症免疫抑制患者，尤其是明确有HLA-DR水平降低患者。目前小样本临床研究发现INF-γ治疗脓毒症有效。胸腺肽能够刺激淋巴细胞的增殖、分化，激活树突状细胞，增强人体免疫细胞功能的作用。IL-7是多效应的细胞因子，能够诱导幼稚的记忆性T细胞增殖。抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体可逆转T细胞功能障碍，促进病原体的清除［19］。脓毒症免疫治疗见图1。

几种在逆转脓毒症的免疫抑制期方面具有前景的免疫治疗药物：包括IL-7、PD-1、重组IFN-γ、重组GM-CSF；GM-CSF和IFN-γ主要影响单核细胞和巨噬细胞增加HLA-DR表达和诱导活化。IL-7和PD-1特异性抗体具有靶向CD4+和CD8+ T细胞的优势，可恢复适应性免疫系统的功能；通过与CD4+ T细胞重新结合，重组IL-7和PD-1特异性抗体不仅对适应性免疫细胞产生作用，而且间接对单核细胞和巨噬细胞产生作用；PD-1和PD-L1特异性抗体将预防和（或）逆转T细胞耗竭。因此，这些抗体的净作用将是防止IFN-γ产生减少，T细胞凋亡和CD8+ T细胞的细胞毒性降低。IL-7通过增加淋巴细胞功能相关抗原1 （lymphocyte function-associated antigen-1，LFA1）等细胞整合素的表达，阻断T细胞凋亡，诱导T细胞增殖，增加T细胞产生IFN-γ，增加T细胞受体（TCR）多样性，增加T细胞运输。免疫治疗药物的应用将依赖于使用各种生物标志物或免疫功能检测来证明患者已经进入脓毒症的免疫抑制阶段。

随着神经-内分泌-免疫网络在脓毒症炎症免疫中的作用逐渐被揭示，外源性应用糖皮质激素在免疫调节中的理论基础逐渐增强。临床短期应用糖皮质激素虽然可降低感染能力，但抑制髓系细胞的炎症反应，包括抑制中性粒细胞的模式识别受体并抑制其吞噬和杀菌作用，及促进MDSCs的氧化磷酸化，增强其免疫抑制功能。同时，激素可以通过神经内分泌系统对免疫功能进行调节，包括交感神经、副交感神经神经，通过下丘脑、肾上腺、髓质系统调节机体的免疫反应。交感神经可通过直接刺激α1和β1肾上腺素受体，刺激cAMP的形成，反过来诱发信号级联瀑布，减少促炎因子的表达，增加抗炎因子如IL-10的水平，还可引起淋巴细胞的凋亡，进一步抑制炎症反应［21］。

部分患儿可能需要组合疗法，兼顾固有免疫和适应性免疫，以实现免疫功能的及时和持久恢复。开发多中心、前瞻性免疫功能监测和对脓毒症患儿的免疫调节研究对于安全地将这些疗法带入儿科重症监护病房（pediatric intensive care unit，PICU）并改善这一弱势人群的临床预后至关重要。

儿童脓毒症具有较大的异质性，将“正确的治疗策略”与“正确的患者群体”相匹配，可使患儿在临床治疗中获益更多。在既往大多数的脓毒症免疫治疗试验中，参与者是采用“一刀切 ”的方法招募的，忽略了脓毒症患儿免疫状态的动态改变和宿主免疫反应，期望一种药物能够调节整个疾病谱中异常的免疫反应是不现实的［23］。事实上，一部分患儿处于严重的炎症反应中，可能得益于抗炎治疗，但另一部分患儿可能处于免疫抑制状态，应用免疫刺激剂治疗，是否存在其他具有更复杂的脓毒症免疫反应表型尚未得到详细的研究。可借助一些生物标志物和临床表型对脓毒症患儿进行免疫分型。这种表型可分为“高炎症”或“低炎症”，并且往往对治疗有不同的反应。几种循环生物标志物包括CRP、铁蛋白、IL-6已经用来识别脓毒症中的高炎症，而淋巴细胞减少、细胞因子产生能力缺陷和单核细胞HLA-DR低表达的患者被描述为具有免疫麻痹性脓毒症内型。这些内型的特异性疗法包括主要是针对高炎症表型的抗IL-1疗法（如rIL-1Ra/anakinra），以及针对免疫麻痹的rIFN-γ、IL-12、GM-CSF、rIL-7和位点抑制剂［24］。

高通量组学技术的引入为临床转化和脓毒症研究开辟了新的机会。目前，最常用的方法是循环免疫细胞的转录组学，该方法已经确定了脓毒症患者的脓毒症反应特征（SRS1和SRS2）。SRS1内型与免疫抑制和更高的病死率相关。一项大型流行病学研究提出了4种脓毒症转录组内型，称为Mars1-Mars4。在不同的队列中，Mars1与免疫缺陷和较高的病死率相关，而Mars3患者几乎没有免疫失调，死亡风险相对较低。另一项基于全血转录组的研究提出了3种内型：“炎性”（高炎症和高病死率）、“适应性”（高适应性免疫激活和较低病死率）和“凝血病”（血小板脱颗粒和凝血功能障碍，主要是病死率较高的老年人）。最近的研究提出了5种内型，分别为“嗜中性粒细胞抑制性”（与中性粒细胞活化和免疫抑制相关）、“炎性”（炎症前反应增加）、“先天宿主防御”（白细胞介素信号传导）、“干扰素”（IFN-α、IFN-β和IFN-γ增加）和“适应性”（适应性免疫增加）。这些分型的出现使得免疫治疗在临床实践中更具有靶向性且更易实施［25］。

综上所述，免疫炎症反应在儿童脓毒症的发病机制中具有重要作用。儿童宿主免疫特点使得儿童脓毒症的免疫功能紊乱相较于成人更为复杂。目前尚缺乏对儿童脓毒症免疫炎症反应的全面认识和个体化治疗，应重视儿童脓毒症的免疫动态评价，以达到提高儿童脓毒症诊疗水平，改善疾病预后、减轻医疗负担的目的。

利益冲突    所有作者均声明不存在利益冲突

（2024-07-11收稿）