细菌包涵体:生物活性蛋白质的宝库

学术   2024-12-09 16:55   江苏  

导读

以细菌包涵体(Inclusion bodies, IBs)形式表达的重组蛋白目前在工业和医学生物技术领域的许多不同应用中受到极大关注[1]。了解IBs中蛋白质的结构-功能关系最近为开发创新的分离、溶解、复性和纯化工艺创造了新的可能性,从而可以从细菌IBs中高通量回收生物活性蛋白。


在此,我们分析了目前每个处理步骤相关的优缺点和主要挑战,总结了每个步骤的可能解决方案以及基础和转化研究的未来方向,以实现IBs聚集体的最大效益。

一、IBs的主要优势


重组DNA技术最早由Cohen和Boyer于1974年引入(图1),大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)已被广泛用作生产重组蛋白的宿主[2]。IBs是细胞内形成的大分子聚集物,主要由蛋白质组成,它们的形成通常是由于蛋白质折叠、聚集和降解过程之间的失衡所致。因此IBs一直被认为是生产活性和可溶性重组蛋白的主要障碍,即使过去采用多种分子和生化策略来避免包涵体形成,E.coli中过表达的重组蛋白中仍有约80%形成IBs。将无生物活性、错误折叠的IBs转变成有活性的可溶蛋白将对生物制药及工业发展产生重要影响。研究发现IBs的主要优势是:(1)大小和密度与宿主蛋白不同,易于分离;(2)能抵抗蛋白降解;(3)蛋白质聚集体特异性、机械稳定性高、过表达蛋白质量高;(4)毒性蛋白质表达;(5)其二级结构类似于天然蛋白质并具有生物活性。

图1 IBs领域基础和转化研究重大突破的时间表


二、开发的IBs的策略及挑战


IBs的处理一般包括四个步骤:分离IBs、溶解IBs、溶解蛋白、复性蛋白纯化(图2)。


图2 处理IBs的四个主要步骤



2.1

分离IBs的策略及挑战

目前根据IBs中生物活性蛋白的结构和功能特性开发多种从细菌中分离IBs的方法,有些方法在实验室规模下经济且省时,但在工业规模下却不可行(表1)。方法的选择必须基于对IBs中蛋白质的结构-功能关系的理解,以及其下游应用和生产规模。

表1 目前使用的分离IBs的方法


每种方法都有各自的优点和缺点,与结合酶法相比,物理方法可以有效破坏细胞,但更大程度地损害IBs中蛋白质的质量,理想的工艺是将两种方式相结合以获得纯度较高的IBs。由于IBs中的蛋白质聚集体密度较高且带电荷,较难与DNA、蛋白质和细胞碎片分离,非常有必要从此类细胞污染物中纯化IBs。而温和洗涤剂或低浓度离液剂清洗IBs会导致非经典IBs (Nonclassical IBs,ncIBs)中目标蛋白质的损失,因此只能用于处理经典IBs。洗涤剂pH在清洗IBs中也起着至关重要的作用,在酸性pH下IBs会收缩,而在碱性pH下,蛋白质将会溶解。
此外,使用脱氧核糖核酸酶(Deoxyribonuclease,DNase)和去污剂清洗的方法可以减少细胞污染,DNase可去除细胞碎片和膜蛋白,但因为它在下游工艺中难以去除且成本高昂很少使用。电泳沉积法能简单、快速且经济有效的将胞浆从细胞碎片和残留细胞中分离出来,但目前尚未用于从胞浆中大规模回收生物活性蛋白。

2.2

溶解IBs的策略及挑战

使用的溶解方法不当是IBs中回收生物活性蛋白效率低的主要原因之一(表2)。使用强变性剂会使IBs中具有生物活性蛋白质的天然二级结构完全丧失,并导致其在复性过程中形成可溶或不溶性蛋白质聚集体。因此开发了无需复性的非变性剂,能高效、快速且经济地从IBs中回收生物活性蛋白,但其不能溶解经典的IBs。第三类增溶剂由此而生,它主要优点是足够温和,可以溶解经典IBs和ncIBs,保护蛋白质现有的天然二级结构的,比强变性剂更能高效回收生物活性蛋白质,但它无法溶解所有蛋白质,而目前没有算法可以预测哪种温和增溶剂最适合特定的IBs蛋白。

在特定实验设计的情况下,使用合适温和增溶剂至关重要。首先,将不同细菌IBs与温和增溶剂的广泛溶解曲线进行生物信息学分析,建立增溶剂和细菌IBs特性之间的相关性,预测适合单个细菌IBs的正确增溶剂。另一种策略是开发多功能温和增溶剂,既能溶解各种细菌IBs,又能保护蛋白质现有的天然样二级结构。这两种策略均减少在实验室和工业规模上优化从细菌IBs产生物活性蛋白所需的时间和成本。

表2 各种IBs溶解方法的比较分析



2.3

复性策略及挑战


根据安芬森的理论,蛋白质具有从变性状态折叠回其天然构象的内在能力,但与易于聚集的物种存在着显著的竞争。蛋白质复性是蛋白质获得其功能性结构和天然活性的过程,包括通过共表达分子伴侣体内复性和降低变性剂浓度的体外复性两种形式,体外复性是目前首选方式(表3)。

提高复性蛋白质质量和数量的关键在于减少中间体或部分物种之间的分子间相互作用,其中增溶剂的选择、复性过程中的蛋白质浓度、复性缓冲液中的复性条件(小分子添加剂、pH、离子强度和温度)以及复性方法的选择四个因素发挥重要作用。(1)增溶剂的选择。使用温和的增溶剂保护IBs蛋白质现有的天然二级结构,提高复性蛋白质的质量和数;(2)复性过程中的蛋白质浓度。蛋白质浓度与白质聚集成正比,然而蛋白质浓度高度稀释需要消耗大量缓冲液,因此需要适中的蛋白质浓度促进复性;(3)复性条件。根据目标蛋白的热力学稳定性筛选复性条件的差示扫描荧光法能在短时间内确定最佳复性条件,它在筛选不同缓冲液时考虑了包括添加剂、pH 值和离子强度在内的所有必要的因素;(4)复性方法。

不同的工艺策略具有不同的优势。透析和稀释法使用广泛但成本较高,传统的柱上复性工业成本低但耗时长。基于整体基质的柱上复性方法具有更高的纯度、高纯化产率、更易扩展以及更短的处理时间。深入了解蛋白质不同重复性条件在化学、生化和生物物理水平的方法,开发通用的复性叠缓冲液,进而降低筛选缓冲的操作成本、时间和劳动力。

表3 用于从IBs中回收生物活性蛋白的复性方法



2.4

复性蛋白纯化策略及挑战


细菌IBs溶解后的复性蛋白质通有:可溶性聚集体;不溶性聚集体;以及正确折叠、错误折叠、寡聚或降解的蛋白质,根据密度可将不溶性聚集体与其余种类分离(图2)。在实验室规模下,也可以通过尺寸排阻色谱法分离可溶性聚集体、寡聚和降解蛋白质,在工业规模下,因为其色谱柱上的蛋白质样品量少,流而不适用。纯化蛋白质中错误折叠不仅会降低蛋白质的比活性,还会影响蛋白质的免疫原性,因此分离错误折叠和正确折叠至关重要,二者的物理化学相似性使得使用传统色谱法很难将它们分离[3]。


目前的方法主要有:基于疏水性差异的疏水相互作用色谱法;根据蛋白质的内在特性分离错误折叠变体,减少下游工艺的工艺时间和操作成本的多模色谱法;成本低且耗时少的膜色谱和整体色谱法;结合容量较高的基于树脂的色谱法;具有高流速和高动态结合容量的基于纤维素纳米纤维的色谱。




结语

由于IBs易于分离纯化,具有较高的机械稳定性和热稳定性,并且获得的重组蛋白产量高、纯度高,溶解细菌IBs的温和增溶剂在开发方面取得了进展。同时,目前在生物制药行业中,使用分离、溶解、复性和纯化的组合方法取得了巨大进展(图3),并且可以作为一种通用方法用于从细菌IBs中回收生物活性蛋白,最终减少新生物制药研发的成本和时间。在未来,我们期待会有更加快速的流程开发和更有吸引力的策略出现。

图3 从细菌IBs中有效回收生物活性蛋白的不同方法


耀海生物,作为一家专业领先的微生物表达体系合同研发与生产组织(CRDMO)服务提供商,致力于为广大客户提供专业、高效的生物技术服务。公司专注于以大肠杆菌和酵母菌表达体系,开展一系列生物制药的发酵、纯化、制剂工艺开发和生产的一站式外包服务。我们的服务范围涵盖了多肽药物、重组蛋白药物、病毒样颗粒(VLP)、质粒DNA、纳米抗体等多种生物药的开发与生产。


此外,耀海生物还提供科研级别的mRNA、CircRNA和SaRNA等前沿技术的定制服务,以满足不断发展的生物科研和制药需求。我们以严格的质量管理体系、先进的实验设施和丰富的行业经验,确保为客户提供高品质的产品和一站式解决方案,助力客户在生物医药领域的创新与发展。

(如需相关CRDMO服务,请随时联系199 5298 1076)



参考文献
[1] de Marco, Ario et al. Bacterial inclusion bodies are industrially exploitable amyloids. FEMS microbiology reviews vol. 43,1 (2019): 53-72.
[2] Dong W, Sun H, Chen Q, et al. SpyTag/Catcher chemistry induces the formation of active inclusion bodies in E. coli. International journal of biological macromolecules vol. 199 (2022): 358-371.
[3] Cheng X, Wang Y, Liu J, et al. Super enhanced purification of denatured-refolded ubiquitinated proteins by ThUBD revealed ubiquitinome dysfunction in liver fibrosis [J]. Mol Cell Proteomics, 2024: 100852.

江苏耀海生物制药有限公司
耀海生物,专注微生物表达体系CRDMO服务提供商,业务聚焦在“重组蛋白/多肽、纳米抗体、重组新型疫苗和重组质粒、及RNA药物”等领域,致力于打造CRO/CDMO/MAH开放式、一体化的产研服务平台。
 最新文章