导读
重组蛋白（Recombinant protein，RP）表达系统的出现使生物技术发生了革命性的变化，单克隆抗体（Monoclonal antibodies，mAbs）、重组疫苗和激素等蛋白质药物的上市，表明RP已经在生物制药领域发挥了重要作用。大肠杆菌作为一种常用的表达宿主，在重组蛋白生产中发挥着关键作用。然而，要实现重组蛋白的高效生产，需要解决一系列挑战，包括减轻宿主负担和优化蛋白质活性等。
今天，我们一起了解一下大肠杆菌中高效生产重组蛋白的最新策略。
图1 基于蛋白质特性的
表达优化的常规工作流程
一、优化靶蛋白表达率
大量研究表明，RP产生过程中的生长抑制主要是由于基因转录过强，而翻译进一步加重了宿主负担。因此，精确平衡RP转录强度和翻译水平的能力是减轻宿主负担和增加产量的关键。如图2所示，研究人员通常从T7 RNAP和pET质粒两方面进行优化。
T7 RNAP的调控
控制重组蛋白表达强度的关键在于调节T7 RNAP的数量和活性，这通常通过优化转录或翻译水平来实现。例如，通过减少T7 RNAP的转录水平来增加有毒蛋白的产量，替换诱导型启动子来调节转录水平（图2B），通过突变lac阻遏基因来增强阻断蛋白的能力，以及构建核糖体结合位点（Rribosome binding site，RBS）库来调节翻译水平等。
由于T7 RNAP是一种酶，因此它的催化活性也是影响转录速率和效率的关键因素，通过突变关键氨基酸残基或添加抑制剂可以调节其活性。其机制包括削弱与PT7的结合能力或产生移码突变以降低催化活性。此外，添加T7 RNAP抑制剂是调节其活性的另一种方式，基于此原理开发了多种衍生宿主，如BL21(DE3)-pLysS、BL21(DE3)-pLysE和Lemo21(DE3)（图2C）[1]。随着合成生物学的发展，研究人员开发了多种由光诱导调节的T7 RNAP表达系统，以实现对重组蛋白生产的动态调节。例如，Opto-T7RNAPs系统将T7 RNAP拆分为两个片段，并与光敏感二聚化结构域串联表达，在特定波长光的照射下，T7 RNAP可恢复转录活性，活性变化可达80倍。
pET质粒的调控
pET质粒上不同功能区域的序列组合会影响重组蛋白的表达率。可以通过结合更严格的诱导系统来解决泄漏表达问题，并通过组合简并引物和MEGAWHOP PCR或酶切连接以及使用抗性标记来灵活、快速的筛选各种重组蛋白的合适表达强度（图2D）。
复制子决定了载体的拷贝数和与其他质粒的兼容性。高质粒剂量通常被视作会带来更高的重组蛋白产量，然而这一情况并非适用于所有的重组蛋白，高拷贝数的质粒可能会加重宿主的代谢负担。因此，调节拷贝数对于平衡生长和生产至关重要。最近，动态拷贝数调节系统的出现为减少宿主负担和提高重组蛋白产量提供了有力工具[2]。
图2 T7 RNAP和pET质粒的优化表达策略
二、生长和生产的双重优化
研究显示，RPs的表达强度和分子量与宿主负担成正比，同时高负担条件下RP产量显著降低。因此，提高RP产量的另一个关键是实现生长和生产的双重优化。
平衡细胞生长和重组蛋白生产
外源补充能有效补偿RP生产过程中消耗的养分。对于宿主来说，减少不必要的能量消耗或阻断副产物的形成可以有效减轻宿主负担，例如阻断乙酸盐的积累、敲除鞭毛形成相关基因等。除了资源竞争引起的宿主负担外，RP的产生还经常引发细胞应激反应（Cellular stress response，CSR）。因此，阻断CSR的出现可以防止大量生长相关基因的下调，缓解其对宿主的负面影响。此外，大多数异源RP的天然基因含有稀有密码子，这往往会影响它们的翻译和折叠速率。通过异源基因密码子优化和补充稀有tRNAs可以缓解宿主负担。过表达稀有tRNAs是一种更经济的优化方式，一些商业表达菌株就是基于此原理开发的。
解耦细胞生长和重组蛋白生产
诱导宿主负担的机制因RP的种类而异，将细胞生长与RP生产解耦可以有效降低资源分配的难度，例如在工业生产中常用的自动诱导系统。传统的自动诱导培养基通常补充有葡萄糖、乳糖或甘油。当葡萄糖存在时，它会抑制细菌对乳糖的摄取，防止RP生产。当葡萄糖耗尽时，乳糖被运输到细胞中诱导RP生产为了扩大应用范围和减少泄漏表达，基于不同原理，如群体感应、磷酸盐诱导或分子伴侣解除分解代谢物阻遏等，开发了几种类型的自动诱导系统。
抑制或阻断生长关键基因的表达可以中断细胞生长，更有效地将资源分配给重组蛋白生产，例如通过控制或抑制内源RNAP的表达（图3A）、阻断染色体的正常复制或利用CRISPRi抑制生长相关基因的表达等（图3B）[3]。此外，由于细胞翻译机制的普遍性和复杂性，大肠杆菌中没有独特的核糖体能够识别特定的mRNA来实现正交翻译。如图3C所示，通过对16S rRNA进行定制化开发更高效的o-核糖体可以在不影响宿主正常代谢的情况下，优先翻译正交mRNA，从而提高毒性蛋白的表达效率 [4]。因此，利用正交核糖体来特异性翻译靶蛋白可以减少对宿主核糖体的竞争，从而实现生长和生产的解耦。
图3 细胞生长与RP产生
解耦的优化表达策略
三、优化蛋白质活性
除了保证RP的数量外，高产蛋白的功能活性也是RP生产的重点。当RPs的表达率或数量超过宿主细胞的能力时，会导致大量蛋白质错误折叠聚集，最终产生包涵体（Inclusion bodies，IBs）。17这一现象极大地阻碍了大肠杆菌在各个领域的应用，尤其是蛋白类药物的表达。
增强翻译后修饰
大多数结构复杂的蛋白质含有多个二硫键以维持其正常构象，常见的蛋白质转运途径包括SecB依赖型、SRP介导型和TAT转运途径。通过遗传融合信号肽到重组蛋白，可使其利用这些途径进行转运，不同的信号肽触发的机制不同，会极大地影响重组蛋白转运的效果。通过阻断ΔGor/ΔtrxB菌株中的自然还原途径，可使细胞质环境变为氧化环境，促进二硫键的形成，基于此原理开发了商业化的大肠杆菌菌株Origami和CyDisCo（图4A）[5]。
除了二硫键的形成，其他翻译后修饰的效率也会影响重组蛋白的功能活性，例如磷酸化、乙酰化（图4B）和糖基化（如4C）等。值得一提的是，通过引入特定的非经典氨基酸可以更直接、精确地引入翻译后修饰，使大肠杆菌有望再次成为生物制药的“明星宿主”。如图4D所示，通过正交配对SepRS/tRNASep，成功将磷酸丝氨酸残基引入重组蛋白的特定位点。
图4 提高翻译后修饰的优化策略
消除包涵体
除了有限的翻译后修饰外，错误折叠、低溶解度和宿主负荷也有助于IB的形成。通常采用提高溶解度、提高正确折叠效率、优化合适的表达强度来解决这一问题。
使用肽标签是增强重组蛋白溶解度的最直接有效的方法，近年来多种低分子量蛋白质标签有助于各种重组蛋白的溶解和产量提高。此外，分子伴侣是一类辅助蛋白质，有助于肽结构的折叠和组装，确保正确折叠并防止新翻译肽的聚集。因此，通过过表达分子伴侣可以有效提高折叠效率。
不同来源的不同类型重组蛋白具有高度特异性，没有一种优化策略适用于所有蛋白质。随着合成生物学、系统生物学和各种基因编辑工具的不断发展，快速开发定制宿主将变得越来越容易，例如通过体内诱变策略、构建人工细胞器等。此外，研究人员正在更新BL21(DE3)的基因组注释，并结合数学建模、统计分析和计算机辅助设计来实现精确优化。我们有理由相信，大肠杆菌将继续在重组蛋白生产宿主中发挥重要作用。
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参考文献
[1] Schlegel S, Löfblom J, Lee C, Hjelm A, Klepsch M, Strous M, Drew D, Slotboom DJ, de Gier J-W. Optimizing membrane protein overexpression in the Escherichia coli strain Lemo21(DE3). J Mol Biol. 2012, 423: 648-659.
[2] Rouches MV, Xu Y, Cortes LBG, Lambert G. A plasmid system with tunable copy number. Nat Commun. 2022, 13: 1-12.
[3] Li S, Jendresen CB, Grünberger A, Ronda C, Jensen SI, Noack S, Nielsen AT. Enhanced protein and biochemical production using CRISPRi-based growth switches. Metab Eng. 2016, 38: 274-284.
[4] Liu F, Bratulić S, Costello A, Miettinen TP, Badran AH. Directed evolution of rRNA improves translation kinetics and recombinant protein yield. Nat Commun. 2021, 12: 1-14.
[5] Matos CF, Robinson C, Alanen HI, Prus P, Uchida Y, Ruddock LW, Freedman RB, Keshavarz-Moore E. Efficient export of prefolded, disulfidebonded recombinant proteins to the periplasm by the Tat pathway in Escherichia coli CyDisCo strains. Biotechnol Prog. 2014, 30: 281-290.
