导读
如何有效治疗传染病是目前研究人员正在努力的方向。将纳米抗体作为中和剂，从而穿透大分子无法到达的狭窄缝隙而与病毒关键位点进行结合和阻断。苏丹巴赫里大学研究人员在Biotechnology Reports上发表题目为《Revolutionizing Antiviral Therapy with Nanobodies: Generation and Prospects》的文章。文章中讨论了纳米抗体的构建方法，和一些增加纳米抗体半衰期的方法，以及纳米抗体对感染性病原体的治疗潜力。
今天，由小编带大家详细解读这篇文献。
一、抗体治疗的发展
工程化抗体通过靶向特定的病毒或结构，经过大量生产可以治疗某些高危人群。但是，如单克隆抗体一样，因为生产成本过高且体积过大（分子量一般为150 kDa），而导致广泛应用的限制[1]。
在20世纪90年代初，Hamers-Casterman团队在骆驼科中发现了一种新型抗体，这些“仅重链抗体”缺乏轻链，由两个恒定结构域组成，一个铰链区和一个称为纳米抗体(Nanobody,
Nb)的可变重链结构域(Variable Heavy Chain Domain, VHH)[2]。VHH由围绕三个高可变互补决定区(Complementarity-determining Regions, CDR)的四个保守序列片段组成，可以保留完整的抗原结合能力，其中至少60-80%的抗原接触是通过CDR3进行的[3]。Nbs体积很小（15 kDa），有一个长而突出的CDR3环，能够进入常规抗体无法进入的受体间隙或结合袋，并到达隐藏的表位。Nbs体积小，特异性高，半衰期长，成为在流行病或疫情等紧急情况下使用的理想候选者。
图1 传统抗体（左）和仅重链抗体（右）示意图
二、Nbs的产生
Nb文库是通过用目标抗原对动物进行免疫，从动物身上分离外周血单核细胞，并提取编码重链抗体可变结构域的DNA来构建的[4]。如图2所示[5]，该过程首先是用目标蛋白对骆驼科动物进行免疫，以产生多种重链抗体，使用聚合酶链反应扩增编码这些抗体的基因，并将其克隆到噬菌体展示载体中。文库将目标蛋白固定在固体载体(如微滴板)上孵育，Nbs与靶蛋白结合的噬菌体被捕获在载体上，而非结合的噬菌体被冲走。之后将捕获的噬菌体洗脱，用于感染细菌进行扩增。这个过程重复几次，以富集与目标蛋白强结合的Nbs。最后，选择单个克隆进行测序，鉴定出独特的Nb序列。
一旦确定序列后，通过诱变或亲和成熟技术进一步优化，以提高它们的结合亲和性或特异性，由此产生的Nbs可以通过细菌表达系统或其他重组技术大量生产。
图2 纳米抗体的生产
三、更简单的Nbs生产方法
利用来自预先存在的抗体的CDR开发纳米抗体，在规避动物免疫和在所需框架内直接生产结合剂方面是非常有价值的。
但是，重链可变结构域(Heavy Chain Variable Domains, VH)和轻链可变结构域(Light Chain Variable Domains, VL)可能会形成抗原结合位点，而且特定的框架残基也会直接参与抗原结合。为了克服需要大量文库和复杂的选择程序，Hanna等人[6]提出了一种生成Nbs的两步法（图3）。
首先，将CDR从传统抗体格式中移植到Nb框架中，导致产生抗原结合力减弱。然后，将这些次优结合物作为构建靶向合成噬菌体文库的模板，以提高亲和力。这种方法有利的是，大量预先存在的抗体提供了广泛的CDR集合，可用于构建靶向合成VHH文库。加速了具有所需特异性和框架的VHH的创建，对推进基于纳米抗体的研究和增强基于VHH的治疗潜力非常有益。
图3 Nbs的两步生成方法
四、延长Nbs半衰期的方法
药物的半衰期是指从体内消除一半给药剂量所需要的时间。就Nbs而言，体积小和缺乏Fc区使得其容易被肾脏快速清除，导致循环半衰期短，因此限制了它们的疗效，并且需要频繁给药，而且可能因在非靶组织或器官中积累而导致脱靶效应。
目前，克服这一挑战并提高其功效和药代动力学特性的策略有：①与Fc区融合: Fc区与内皮细胞上的新生Fc受体结合，通过将Nbs回收再循环来阻止Nbs的降解和清除，是目前增加Nbs的半衰期最有效的方式。②聚乙二醇化：将聚乙二醇链共价到Nbs上，可以增加流体动力学尺寸并降低肾脏清除率。③与白蛋白结合：人血清白蛋白是血浆中的一种主要蛋白质，结合后肾脏清除率降低且对蛋白水解降解的保护作用增强。④位点特异性偶联：将分子连接到Nbs表面的特定氨基酸残基上，并与循环蛋白结合，可改善药代动力学。⑤糖基化：将糖分子添加到Nbs上的特定位点，通过增加Nbs的亲水性来提高其稳定性并减少清除。
五、Nbs的治疗方法
Nbs靶向病毒糖蛋白
病毒糖蛋白是存在于病毒表面的蛋白质，用Nbs靶向这些糖蛋白可以阻断病毒的进入和复制，从而实现有效的抗病毒治疗。
一个成功案例是Nbs靶向SARS-CoV-2的刺突蛋白，而且已经分离出与刺突蛋白不同区域结合并抑制其功能的强效Nbs，这些Nbs在临床前研究中显示出令人鼓舞的结果，可能被用作治疗SARS-CoV-2的药物[7]。
Nbs防止宿主与病毒相互作用
Nbs靶向在病毒附着和进入过程中起关键作用的细胞蛋白，可阻止病毒进入宿主细胞或在宿主细胞内复制。Siqi H.等人[8]开发了能结合血管紧张素I-转换酶-2 (Angiotensin I-converting Enzyme-2, ACE2)蛋白的Nb，通过与ACE2结合，阻止了病毒感染细胞。
Nbs起免疫调节剂的作用
不同于传统抗病毒药物针对病毒特定的蛋白质或酶，Nbs通过结合病毒表面蛋白或其他复制和传染性所必需的结构来靶向病毒本身，对不同病毒株提供了更广泛的的活性，而且还降低了耐药性的风险。纳米抗体调节免疫反应的方式：①通过增强抗体依赖性细胞毒性，一种抗体与受感染细胞结合并招募免疫细胞杀死受感染细胞的过程。纳米抗体可以通过增加抗体对感染细胞的亲和力或招募更多免疫细胞到感染部位来增强这一过程。②与参与抗病毒反应的免疫细胞或分子结合并增强其活性。③与其他免疫疗法(如检查点抑制剂或细胞因子)联合使用，以增强抗病毒免疫。④通过靶向聚合酶或蛋白酶等病毒蛋白，抑制病毒复制。⑤可以被设计成阻断特定的细胞因子或细胞因子受体，防止过度炎症和减少组织损伤。
Nbs因为其优越性，在日常临床实践中有机会将其作为药物使用。为了使候选药物进入临床试验，必须考虑三个关键因素:(a)药物是否有效地到达目标器官并产生足够的量以产生期望的结果，(b)药物与目标的结合是否足够特异性以引发生物活性，以及(c)化合物是否可以有效调节目标的功能。
但是Nbs基于治疗的挑战之一是确定合适的靶点。虽然许多病原体已经在分子水平上得到了很好的表征，但确定纳米抗体可以靶向的特定表位可能具有挑战性。另一个挑战是优化Nbs在体内的药代动力学和生物分布。虽然Nbs高度稳定，可以使用重组DNA技术大规模生产，但它们可以迅速被肾脏从循环中清除。
尽管如此，很明显，Nbs代表了药物开发的一个新领域，具有改善人类健康的巨大潜力。它们的低免疫原性只是难题的一部分，但它可能是确保这些小蛋白质在未来几年能够安全有效地使用的关键因素。
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[2]G. Van Heeke, K. Allosery, V. De Brabandere, T. De Smedt, L. Detalle, A. deFougerolles, Nanobodies® as inhaled biotherapeutics for lung diseases,Pharmacol. Ther. 169 (2017) 47–56.
[3]T.T.T. Truong, V.Q. Huynh, N.T. Vo, H.D. Nguyen, Studying the characteristicsof nanobody CDR regions based on sequence analysis in combination with 3Dstructures, J. Genetic Eng. Biotechnol. 20 (2022) 157.
[4] B. Liu, D. Yang, Easilyestablished and multifunctional synthetic nanobody libraries as research tools,Int. J. Mol. Sci. 23 (2022) 1482.
[5] Y. Mei, Y. Chen, J.P. Sivaccumar, Z. An, N. Xia, W. Luo, Researchprogress and applications of nanobody in human infectious diseases, Front.Pharmacol. 13 (2022), 963978.
[6]H.J. Wagner, S. Wehrle, E. Weiss, M. Cavallari, W. Weber, A two-step approachfor the design and generation of nanobodies, Int. J. Mol. Sci. 19 (2018). Nov2.
[7]M. Bhattacharya, S. Chatterjee, S.S. Lee, C. Chakraborty, Therapeuticapplications of nanobodies against SARS-CoV-2 and other viral infections:current update, Int. J. Biol. Macromol. (2022).
[8] S. He, J. Wang, H. Chen, Z. Qian, K. Hu, B. Shi, et al., Acompetitive panning method reveals an anti-SARS-CoV-2 nanobody specific for anRBD-ACE2 binding site, Vaccines (Basel) 11 (2023) 371.
