用于生产质粒DNA的细菌菌株和载体的工程设计

许多研究人员采用图2中的策略来开发用于生产pDNA的特性良好的菌株，旨在保持质粒和宿主基因组的序列保真度，并解决上下游过程问题。与这些工作相辅相成的是对载体骨架的改造，目的是提高拷贝数、遗传保真度和分离稳定性等特性。今天，我们一起走进生产基于pDNA的疗法的菌株和载体工程的最新进展。

近年来，裸DNA（如pDNA）作为一种治疗方法备受关注。与其他疗法相比，pDNA在多项临床试验中展现出了极强的安全性，给药后表现出高水平的耐受性和极小的毒性[2]。而腺相关病毒载体（adeno associated virus，AAV）治疗在许多物种中存在遗传毒性以及意外整合到基因组中的情况，但在递送 pDNA时尚未出现这些问题。与AAV不同的是，pDNA不会引发免疫反应，因此可以重复给药。使用pDNA的另一个优点在于其在载体设计方面具有极大的灵活性。与AAV疗法相比，AAV疗法存在较为严格的序列长度限制，而pDNA则具有更大的容量，能够更好地递送更长的转基因，这使得基于pDNA的治疗可以靶向更大范围的适应症。另一方面，如图3所示pDNA的生产过程相对便宜、可扩展且快速。此外，pDNA在更宽的温度范围内比AAV更稳定。因此，pDNA疗法不会受到适用于AAV递送系统的一些冷链要求和稳定性问题的困扰。

用于基因治疗的典型质粒骨架的共同特征可分为两类：第一类包括细菌复制起源（如 ColE1 起源）和选择性标记（如卡那霉素抗性基因），第二类包括治疗基因及其在体内表达所需的相关序列（如真核启动子和多聚腺苷酸化信号）。如图4所示，许多载体工程工作都集中在对骨架的改造上，旨在通过提高产量、改善产品均一性和质量以及确保最终产品的序列保真度来改进生产过程。

质粒载体的序列完整性对产品安全、产量和质量有巨大影响，因此必须在生产过程中加以控制。为了解决插入序列（insertion sequence，IS）介导的遗传不稳定性问题，研究人员构建了大肠杆菌的多缺失系列（multiple-deletion series，MDS）菌株，其生长速度和重组蛋白的生产能力都没有受到基因组减少的影响。在没有插入序列的情况下，MDS菌株能够稳定地维持编码重组异位融合蛋白的质粒和含有锤头二级结构的腺相关病毒质粒[3]。为了解决插入序列对基因治疗的污染问题，研究人员在隐性启动子位点附近插入了一个减少了有毒基因产物表达的内含子，从而大大提高了质粒的稳定性，减少了IS1元件的污染。这些研究表明，通过技术手段，对用于生产pDNA的菌株和载体进行修饰能够有效控制质粒载体的序列完整性，确保产品的高效与稳定生产。

此外，质粒序列的变化也可能受到IS元件以外的因素影响。例如，含有直接序列重复的载体特别容易发生再循环依赖性重组，并且形成失去一个直接重复和中间序列的单体，以及两个或三个重组单体的头尾组合。这些质粒结构的变化和抗生素抗性基因异常表达具有明显的安全隐患，因此对治疗载体进行详细序列分析至关重要。基于此，Oliveira等人开发了一种算法来预测含有给定直接重复序列的质粒的重组频率[4]。

使用抗生素选择质粒和治疗载体转移到环境中其他生物体的可能性也是会严重影响 pDNA 生产工艺设计的产品安全问题。

在抗生素抗性病原体的出现变得越来越普遍的情况下，从成本和安全的角度来看，开发无抗生素选择系统是有必要的。一些研究人员通过修改载体、宿主来开发替代质粒选择系统，从而解决了这些问题。Cranenburgh等人以 dapD（二氨基苯甲酸盐和赖氨酸生物合成的必需基因）为靶基因破坏了内源性dapD位点，用含有lac操作子的高拷贝质粒转化该菌株，结果只有含有lac操作序列的pDNA的细胞在培养中存活[5]，该方法已成功应用于一种HIV DNA候选疫苗的质粒DNA生产过程。此外，Soubrier等人开发的一种载体/宿主系统将无抗生素选择与依赖于特定工程宿主进行复制的质粒复制子相结合，通过限制质粒宿主范围来提高质粒载体的安全性，从而显著降低质粒传播到环境中的机会[6]。这类质粒称为pCOR，是目前唯一已知已发表的、含有非 ColE1 复制起点且用于基因治疗或 DNA 疫苗应用的质粒研究成果。

解决质粒生物制药中细菌元件安全问题的另一种方法是使用微环DNA。微环仅包含治疗基因表达所需的转录单元，通过位点特异性分子内重组去除了在大肠杆菌中繁殖所需的细菌骨架序列。然而，在微环DNA的生产可以扩大和简化之前，质粒DNA很可能仍然是非病毒基因治疗的首选载体。

为了设计一种更适合生产质粒DNA的生物体，研究人员研究了大肠杆菌B和K-12菌株。两种菌株在基因上相似，但对特定B菌株中的可移动元件的分析显示了插入序列的非常不同的特征。

虽然具有更活跃的乙醛酸分流的BL21菌株（一种B菌株衍生物）在高密度细胞培养中表现更好，并且比K-12菌株产生更多的pDNA，但还有研究发现破坏乙醛酸分流的正调节因子，即全局转录调节因子fruR，也会导致pDNA产生增加。基于此，Ow等人选择破坏DH5α中的fruR基因，增加了携带质粒的细胞的生长速度和糖酵解酶活性，同时减少了糖异生[7]。该方法降低了对携带质粒的细胞的选择压力，从而提高了质粒的稳定性，同时增加了特定pDNA的产量。

由于pDNA的复杂动态结构、粘性工艺流以及与所需产物具有相似性质的杂质（如RNA、基因组DNA）的存在，使得pDNA的大规模纯化尤为困难。提高下游纯化产量的一种方法是开发具有高特异性pDNA产量的发酵工艺，通过增加质粒DNA与污染生物质的比例来提高整体工艺产量。

研究人员试图通过改造大肠杆菌宿主菌株来减少细胞裂解物中污染的基因组DNA和RNA的量，从而改善下游纯化。Cooke等人通过在IPTG诱导型启动子的控制下将编码RNase A的基因整合到大肠杆菌JM107的染色体中，诱导后，pre-RNase A被靶向到外周质折叠成活性形式并与宿主核酸隔离[8]。在细胞裂解后，酶被释放并有效地降解宿主RNA。该方法非常成功的解决了RNA与DNA分离困难的问题，因为RNase A酶可以承受碱性裂解过程中遇到的高pH条件。此外，Nature Technology Corporation公司开发了表达周质嵌合蛋白的大肠杆菌宿主，该嵌合蛋白可以在通过内膜渗透技术裂解之前重新引入细胞质，或者在细胞裂解释放后立即开始降解宿主核酸[9]。这两种方案都显著降低了裂解物的粘度，简化了后期的纯化过程。

基于 pDNA 的疗法是另一种受到关注的基于 DNA 的方法。pDNA 表现出很强的安全性，并且具有低免疫原性。在基因治疗和DNA疫苗的质粒DNA生产过程中面临着诸多问题，研究人员通过许多创新的菌株和载体工程，成功地将这些问题一一解决。在菌株工程方面，可以提高产量的研究领域包括去除现有高pDNA生产菌株的营养缺陷型，以及设计一种可以保持高浓度超螺旋pDNA的菌株。设计细菌外膜的结构以减少内毒素污染也可能对简化pDNA的下游纯化产生重大影响。随着这些技术的成熟，它们可能会继续对基于基因的疗法的生产方式产生积极影响。在产品开发的基础研究阶段重新评估现有技术和考虑工艺问题可以改进工艺。