导读
疟疾是由疟原虫感染引发的寄生虫性疾病。尽管经过几十年的研究探索，疟疾仍是全球健康的重大威胁，特别是在非洲，每年造成数十万例死亡。目前，药物治疗是疟疾治疗的主要手段，而疫苗作为预防和控制传染病的有效方式，也备受关注。恶性疟原虫网织红细胞结合蛋白同源物5（The Plasmodium falciparum reticulocyte binding protein homologue 5，PfRH5）是疟疾疫苗研发中的重要候选抗原，能够有效阻止疟原虫侵入人体红细胞。然而，PfRH5复杂的结构使大规模生产成为一大难题。
最近，Sanjay Singh等研究者发表题目为《Development of a process for large scale production of PfRH5 in E. coli expression system》的文章，提出了一种基于大肠杆菌表达系统的大规模高效生产PfRH5的方法，该方法不仅降低了生产成本，还提高了产量和纯度，为未来的疫苗产业化奠定了基础。
下面，本文将为您详细解读这篇文献。
一、PfRH5与疟疾治疗
疟疾由疟原虫感染引起，其中恶性疟原虫是导致疟疾高致死率的主要原因。疟原虫的生命周期分为红外期、红内期和蚊期。当前的疫苗研发主要针对这三个阶段，以期通过多个环节阻断疟原虫的传播和感染。
PfRH5因其小尺寸、保守性以及跨毒株诱导抗体的能力，成为最有希望的红内期疫苗靶抗原。研究表明，PfRH5在多种疟原虫种类中高度保守，能够在动物模型中诱导出对所有恶性疟原虫株的高水平抗体，并且近期的临床试验（VAC057、VAC063）初步数据进一步验证了PfRH5的潜力。因此，开发一个能够稳定生产PfRH5的扩展平台是至关重要的。由于PfRH5结构复杂、表达量低且稳定性差，作者利用大肠杆菌表达系统开发了一种高效、可大规模生产PfRH5的工艺。
二、PfRH5的克隆和表达
作者将PfRH5的基因序列克隆至多种pET载体中，包括pET303、pET45和pET24a，分别构建了四种不同的载体：pET303-PfRH5-Opt、pET24a-PfRH5-Opt、pET303-PfRH5-Har和pET45b(+)-PfRH5-Har。其中，前两种载体经过密码子优化，以增强表达效率，而后两种载体保留了原始密码子序列。这些构建体均携带6x His标签以便于后续的纯化和检测。
实验选用BL21 (λDE3)、BL21 Star (λDE3)、BL21-codonplus (λDE3)-RIPL和BL21-codonplus (λDE3)-RP四种大肠杆菌菌株以及LB、SOB和TB三种培养基来筛选最优的表达条件。结果显示，pET303-PfRH5-Har和pET45b(+)-PfRH5-Har未显示表达，pET303-PfRH5-Opt和pET24a-PfRH5-Opt在包涵体中表达良好，主要蛋白条带出现在约63 kDa处。与LB和SOB培养基相比，TB培养基促进了更快的细胞生长。根据筛选结果，最终选择了BL21(λDE3)菌株和pET303载体用于后续的高密度发酵研究，因该组合具有较高的目标蛋白表达量且降解产物较少。
图1 PfRH5在大肠杆菌中表达结果分析
三、高细胞密度培养技术优化PfRH5生产条件
为实现PfRH5的大规模生产，采用高细胞密度培养技术，并通过1 L、5 L和30 L发酵罐优化了生产条件。使用BioXpert-V2软件控制发酵过程，对搅拌速度、曝气率、pH值和温度进行了精确控制，以最大化细胞生长和蛋白表达。
在1 L发酵实验中，研究不同的诱导温度和诱导剂浓度对PfRH5表达量的影响（表1）。结果表明，37℃下的表达量显著高于30℃，且0.5 mM 诱导剂诱导时表达效果最佳（图2）。SDS-PAGE分析显示，PfRH5表达量约为400-500 mg/L。优化后的发酵条件随后在5 L规模的实验中进行了验证，结果与1 L规模的表达水平一致，均在400-500 mg/L范围内。在30 L发酵罐中的放大实验进一步证实了工艺的可扩展性，PfRH5的表达量与较小规模的发酵实验相一致，维持在400-500 mg/L。
表1 1 L发酵罐规模下不同诱导剂浓度和诱导温度参数
图2 PfRH5的1 L发酵运行曲线以及
SDS-PAGE和蛋白质印迹分析
四、对变性的PfRH5预折叠纯化
对变性的PfRH5进行预折叠纯化。首先通过高速离心收集发酵液中的菌体，然后使用含苯甲基磺酰氟和β-巯基乙醇的裂解缓冲液处理后，高速离心得到沉淀的包涵体。将包涵体溶解于6 M Gn-HCl、1 M尿素和10 mM β-巯基乙醇的缓冲液中，使用固定化金属离子亲和色谱柱对溶解后的包涵体进行初步纯化，去除非特异性结合的杂质（Wash-I步骤）。然后用含250 mM咪唑的缓冲液洗脱目标蛋白。进一步通过Superdex-200树脂柱进行精细纯化，最终通过尺寸排阻色谱去除剩余杂质（Wash-II步骤）。
实验结果显示，Wash-I步骤去除了未结合杂质，Wash-II（含30 mM咪唑）有效去除宿主蛋白。通过梯度洗脱去除大部分杂质，并用含250 mM咪唑缓冲液洗脱部分纯化的靶蛋白。最后，通过尺寸排阻色谱以去除高分子量和低分子量杂质，确保了PfRH5的高纯度（图3）。综上所述，变性的PfRH5经过预折叠和纯化过程能够有效地去除杂质，为后续研究提供了高纯度的PfRH5。
图3 变性PfRH5经纯化后的色谱图以及
SDS-PAGE和蛋白质印迹分析
五、采用DoE对PfRH5的复性进行优化
在PfRH5的复性过程中，使用实验设计（Design of Experiments，DoE）优化参数，以提高产率和纯度。首先通过全因子DoE设计，对样品进行复性筛选，采用两因子四水平筛选出复性过程中最佳参数（表2），确定pH值、辅料种类及浓度和氧化还原剂等关键影响因素，然后，进一步通过实验验证DoE提出的最佳折叠条件可靠性。
表2 PfRH5复性参数优化的两因子四水平实验设计
实验结果显示，pH值、辅料种类及浓度和氧化还原剂等参数往往会对复性产率产生重大影响（表3）。实验结果表明，精氨酸作为辅料显著提高了复性的产率和纯度，而pH从7.4增加到9.4时，复性产率呈正相关，PfRH5聚集也随之增加，导致稳定性下降，复性产率和纯度的重复图显示其响应值分别在20-45%和60-80%之间（图4A）。
表3 PfRH5复性参数优化实验设计及结果
在pH 7.4条件下，半胱氨酸-胱氨酸作为氧化还原剂，辅料为1 M精氨酸的条件下，PfRH5的复性产率可达到45%。复性后的PfRH5可通过纯化分离出聚集体和错误折叠的多聚体。其结果显示，通过SEC纯化可分离出二硫键连接的多聚体和单体PfRH5，并且单体PfRH5已被纯化至均一状态，表明其折叠构象正确（图4B）。以上结果说明优化复性参数有效提高了PfRH5的复性效率和纯度。
图4 （A）DoE对PfRH5的复性参数优化结果；
（B）经SEC纯化的复性PfRH5分析结果
六、复性和纯化PfRH5的分析表征
在PfRH5的复性和纯化过程中，采用多种分析方法对其进行表征。通过体积排阻高效液相色谱法分析PfRH5的聚集状态，通过反相高效液相色谱法评估PfRH5纯度与折叠情况，采用差示扫描量热法分析其热稳定性，最后，使用荧光光谱分析研究PfRH5的折叠状态。
结果如图5所示，PfRH5在体积排阻高效液相色谱中的主要峰出现在15.5分钟，纯度达96.91%，且96.6%的PfRH5以单体形式存在，这与以往的研究结果一致。反相高效液相色谱显示其纯度为99.42%，保留时间为17.16分钟，表明其具有良好的均质性。差示扫描量热分析结果显示，热转变中点为55.4℃，折叠状态良好。此外，当温度降低至20°C时，荧光信号增加，表明PfRH5的折叠状态得到改善。这些分析结果表明，纯化后的PfRH5具有高纯度和稳定的折叠状态，为后续研究奠定了基础。
图5 复性和纯化后的PfRH5的分析表征结果
七、稳定性研究
对复性和纯化后的PfRH5进行30天的短期稳定性评估，研究了其在-80℃、4℃和37℃不同储存温度下的稳定性。将样品在玻璃瓶中无菌灌装至1 mL，并标记储存条件、浓度及提取日期，样品在第7天、第15天和第30天分别取样。
研究结果显示，在37°C下，产品在第7天、第15天和第30天均降解较少。在4°C下，在第15天和第30天出现了少量降解条带。反相高效液相色谱分析显示，在37°C下，主要峰的纯度有所下降，而在4°C下，第15天和第30天的PfRH5纯度分别为82.90%和80.87%。然而，在-80°C下，PfRH5在30天内能够保持稳定，没有明显降解，说明纯化后的PfRH5在-80°C下表现出最佳稳定性。因此，建议PfRH5的最佳储存温度为-80°C，以避免在较高温度下的降解。
八、免疫原性研究
在6-8周龄的BALB/c雌性小鼠中进行PfRH5的免疫原性研究，评估不同佐剂对抗PfRH5抗体产生的影响。PfRH5抗原（600μg/mL）被配制成6种不同的佐剂组合，分别为吡喃葡萄糖脂质佐剂-乳剂组（I组）、吡喃葡萄糖脂质佐剂-水制剂组（II组）、含氢氧化铝凝胶的吡喃葡萄糖脂质佐剂-水制剂组（III组）、乳液组（IV组）、氢氧化铝凝胶佐剂组（V组）、磷酸盐缓冲液稀释剂组（VI组）。每组通过腹腔注射给药3次，间隔28天。结果如图6所示，所有PfRH5给药组的抗体滴度均显著高于对照组（VI组），其中I组显著提高了PfRH5抗原的免疫原性，表现出增强抗原特异性抗体反应的潜力。这些结果与其他疟疾疫苗研究中的表现一致，进一步证明PfRH5的有效性。
图6 PfRH5的免疫原性研究结果分析
重组PfRH5对疟疾的治疗在早期临床试验中表现出良好效果，但开发符合cGMP标准的可规模化生产工艺仍然是挑战。
本研究中，作者通过优化PfRH5的表达和纯化工艺，成功实现了大肠杆菌系统中高效生产PfRH5蛋白，产量达400-500 mg/L。并通过两步纯化工艺提高了蛋白纯度，获得了高纯度、高稳定的PfRH5蛋白。并且结合免疫实验表明，PfRH5与吡喃葡萄糖脂质佐剂结合后，在小鼠体内产生了显著的抗体反应，展示出其作为疟疾疫苗候选抗原的潜力，这为未来疟疾疫苗的开发提供了重要支持。
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