导读
寨卡病毒（Zika Virus，ZIKV）是一种通过蚊虫进行传播的虫媒病毒，可引起发热性疾病，并与吉兰-巴雷综合征及新生儿小头畸形有关。考虑到ZIKV的传播及感染后的神经系统并发症，该病毒仍然是人类群体，特别是孕妇的严重问题。因此，迫切需要开发新的有效候选疫苗。目前虽然已经研究了不同类型的疫苗抗原，但仍然没有批准的疫苗可以预防ZIKV。
病毒样颗粒（Virus-Like Particles，VLPs）是最有效的抗原之一，但要使用VLPs必须在配方中添加佐剂，并进行适当的给药。波兰研究人员曾在Microbiology Spectrum上发表题目为《Influence of Dosing Regimen and Adjuvant Type on the Immunogenicity of Novel Recombinant Zika Virus-Like Particles》的文章。文章基于哺乳动物细胞中的病毒样颗粒制备了一种潜在的抗寨卡病毒候选疫苗，并首次分析了疫苗接种方案和佐剂类型对重组ZIKV VLPs免疫原性的影响。
一、重组F2A VLPs的设计、表达和纯化
为了提高哺乳动物细胞中ZIKV VLPs的产量，通过将天然的prM蛋白信号序列与人工优化的信号序列交换，并在prM和E蛋白之间引入来自猪捷申病毒-1的自切割肽2A来设计新的重组VLPs（F2A）（图1A和B）。在哺乳动物细胞中表达野生型VLPs（F）和F2A VLPs以比较prM和E蛋白的表达，并用编码两种类型VLPs的质粒载体（pcDNA3.1）转染293 T细胞，分别在转染72h和96h后收集细胞培养上清液，并通过蛋白质印迹评估prM/M和E蛋白表达（图1C）。F2A VLPs显示出更高水平的E蛋白单体形式（55 kDa），E二聚体（110 kDa）比F VLPs中更丰富。两种类型的VLPs显示出相似水平的pr片段（17 kDa）和M蛋白（9 kDa）。
选择F2A VLPs用于进一步的实验，生产的F2A VLPs用色谱方法纯化。收集细胞培养基并通过离心和过滤澄清，然后使用阴离子交换和多模式色谱的两步色谱法纯化F2A VLPs。第一步使用HiTrap Capto Q柱捕获F2A VLPs，然后将其洗脱并直接上样到第二个HiScreen Capto Core 700柱上。使用该柱F2A VLPs从树脂壳中排除并回收，而细胞培养蛋白仍与树脂结合。分别使用考马斯染色和免疫印迹对纯化过程中收集的F2A VLPs的纯度以及prM/M和E蛋白的含量进行评估（图1D和E）。采用该两步法有效纯化F2A VLPs，观察到E蛋白的两种形式（单体和二聚体），并检测到pr片段和M蛋白。
图1 重组F2A VLPs的设计、表达和纯化
二、F2A VLPs形态学特性和抗原性分析
使用动态光散射（Dynamic Light Scattering，DLS）和透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy，TEM）评价最终制剂中F2A VLPs的存在（图2）。通过强度进行的DLS分析显示了两种颗粒群，平均流体动力学直径为35nm和260nm，较大颗粒的峰显示出较低的强度（图2A）。通过数字进行的DLS分析显示一个峰，平均流体动力学直径为40nm（图2B）。透射电子显微镜分析证实了VLPs的存在（图2C）。在铀酰负染色后还观察到不同大小（60nm和30nm）的颗粒。此外通过免疫金标记方法，使用ZV67抗体确认了最终制剂中VLPs的存在，该抗体针对E蛋白结构域III的表位（图2D）。
将遗传修饰引入prME糖蛋白基因盒，因此分析了F2A VLPs的蛋白质N-糖基化和抗原性。使用以下糖苷酶处理评估prM/M和E糖蛋白的N-糖基化谱：PNGase F（切割所有N-聚糖）和Endo Hf（切割不成熟的高甘露糖N-聚糖）（图2 E）。用F2A VLPs处理PNGase F导致蛋白印迹凝胶中E蛋白迁移（单体和二聚体形式）及pr片段迁移，证实了两种蛋白的N-糖基化。F2A VLPs的Endo Hf消化不影响糖蛋白的迁移率，这表明N-聚糖不含高甘露糖结构。此外用以下中和抗体分析了产生的F2A VLPs的抗原性，所述中和抗体针对E蛋白中的构象表位：结构域II中的融合环（4G 2）、DIII中的C-C'环（ZV 48）、成熟颗粒的DIII中的侧脊（ZV 67）和DI/ DII中的表位（ZKA 78）（图2F）。ZV 48和ZV 67表现出高中和活性，与其他黄病毒无交叉反应性。4G 2和ZKA 78抗体显示出中和潜力，但它们在体外研究中也增强了ZIKV感染。与其他抗体相比4G 2抗体与颗粒的结合最弱。总之，F2A VLPs保留了prM/M和E蛋白的N-糖基化，并且4种针对E蛋白的单克隆抗体与颗粒相互作用。
图2 F2A VLPs的形态及抗原性分析
三、给药方案对重组F2A VLPs免疫原性的影响
两组 BALB/c 小鼠（n = 6），通过皮下途径（s.c.）用含 AddaVax 佐剂（角鲨烯油包水纳米乳液，类似于MF59佐剂）的 F2A VLPs 进行三次免疫，间隔2周，分别采用增加（5μg、10μg、15μg）或减少（15μg、10μg、5μg）剂量的给药方案。阴性对照组（n = 3）接受磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Saline，PBS）加佐剂。在每次免疫后2周收集血清样本以评估抗体反应（图3A）。为了评估抗体随时间的产生，在酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISA）中使用E糖蛋白的胞外域作为抗原（图3B）。两种疫苗制剂均产生抗E抗体，对于每种测试的疫苗制剂，第一次给药后抗体水平非常低，并且在每次加强给药后如预期增加。在用递增给药方案免疫的小鼠组的血清中观察到抗体滴度的增长更高。在第二次加强剂量后收集的血清中增加剂量组的抗E抗体水平比其他测试疫苗方案高约100倍。
使用两种菌株-属于亚洲谱系的大流行菌株H/PAN/2016/BEI-259634和来自非洲谱系的参考菌株MR 766-进行空斑减少中和试验（图3D）。尽管MR 766的PRNT 90值之间的差异不显著，但使用递增给药方案免疫的小鼠血清显示出比使用递减给药方案免疫的小鼠血清针对两种寨卡病毒株有更高的中和活性。此外还使用酶联免疫斑点法（Enzyme-Linked Immunospot Assay，ELISpot）对肽刺激的鼠脾细胞评价细胞应答，未观察到IFNγ分泌。因此评估了完整IgG抗体级分和两个亚类IgG 1（Th 2相关）和IgG 2a（Th 1相关）针对E蛋白DIII的终点滴度（图3C）。用增加剂量的F2 A VLP免疫小鼠导致针对E糖蛋白的DIII的IgG应答的更高，并且其增加IgG 1和IgG 2a的水平。然而无论测试的给药方案如何，IgG 2a的水平均远低于IgG 1的水平，因此可得出结论，对VLPs的抗体应答可能显示Th 2极化特征。
图3 给药方案对VLPs免疫原性的影响
四、佐剂类型对F2A VLPs的免疫原性潜力的影响
比较AddaVax与另一种佐剂系统Alhydrogel/MPLA（氢氧化铝/单磷酰脂质A）对 F2A VLPs 免疫原性的影响。该系统基于氢氧化铝，其刺激强烈的抗体应答（Th 2型应答）和合成的单磷酰脂质A（MPLA）toll样受体4（TLR 4）激动剂，有助于细胞（Th 1型）应答。F2A VLPs分别与这两种佐剂配制，并根据增加的给药方案用于小鼠免疫（图4A），并检测细胞和抗体应答。在ELISpot测定中未观察到T细胞应答。两种佐剂类型免疫组抗DIII的IgG、IgG 1和IgG 2a的水平是相同的（图4B）。两种佐剂的血清对ZIKV的中和活性相当，免疫反应均呈Th2极化（图4C）。
图4 佐剂类型对VLPs免疫原性的影响
本文成功设计了新型重组寨卡病毒样颗粒（F2A VLPs），通过改变prM蛋白的信号序列为优化的人工信号序列，并在prM和E蛋白间引入自切割肽2A，提高了E蛋白单体和二聚体的水平，有利于VLPs的分泌和形成；并优化了F2A VLPs的生产条件，采用28℃结合丁酸钠处理转染细胞，使E和M蛋白的分泌量提高了约3倍；建立了F2A VLPs的两步色谱纯化方法，包括阴离子交换色谱和多模式色谱，有效去除了宿主细胞蛋白，获得了较高纯度的F2A VLPs。之后的免疫原性研究表明，给药方案对F2A VLPs的免疫原性有重要影响，而佐剂类型（AddaVax和Alhydrogel/MPLA）对其免疫原性影响不显著。
该研究建立了一种新的ZIKV VLPs的设计策略和在哺乳动物表达系统中的生产方案，并首次揭示了给药方案和佐剂类型对重组ZIKV VLPs免疫原性的影响。后续可对F2A VLPs在临床前感染模型中的保护效力进行评价，以进一步推动抗寨卡病毒疫苗的研发。
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