纳米抗体联合CAR-T，改变癌症治疗的未来

CAR-T疗法的概念最早在20世纪80年代提出，最初的设计仅包含一个CD3-ζ链信号转导结构域，称为第一代CAR。尽管第一代CAR-T细胞在体内外表现出特异性的抗肿瘤活性，但在细胞毒性和长期持久性方面的临床表现较差，因而被认为在临床上无效。

为了克服这一局限，研究者在第一代CAR中引入共刺激结构域，开发了第二代CAR，显著增强了T细胞的增殖、存活和抗肿瘤能力。随后，第三代CAR通过结合两个共刺激信号域，进一步增强了T细胞的活化和抗肿瘤效果。近年来，第四代CAR通过将CAR-T的直接肿瘤杀伤功能和肿瘤部位递送细胞因子的免疫调节能力相结合，展现了在血液恶性肿瘤治疗中的巨大潜力。此外，基于第二代CAR，在其细胞内结构域上增加一种相关细胞因子受体，即获得第五代CAR（图1）[1]。

CAR的基本结构由四个部分组成：细胞外靶抗原结合结构域（简称靶向域）、铰链区、跨膜结构域和一个或多个细胞内信号结构域。靶向域是CAR的核心部分，负责识别肿瘤细胞表面抗原并与之结合。目前，CAR-T的靶向域主要基于单链抗体（Single Chain Fragment Variable，scFv）。由于scFv分子质量小且特异性高，它广泛用于CAR靶向域设计和双特异性T细胞抗体的开发。然而，scFv的高自聚集倾向易导致CAR-T细胞耗竭（图2A），同时还可能引发免疫原性反应，从而影响其临床效果。

相较之下，纳米抗体，即一种发现于驼科动物及软骨鱼类中的重链单域抗体（Variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH），正在成为CAR靶向域的潜在替代方案（图2B）。VHH因其低免疫原性、高稳定性及无聚集倾向，且避免了靶抗原非依赖性效应细胞激活等问题，正在成为一种有潜力的CAR靶向域替代选择。

血管内皮细胞生长因子受体2（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2，VEGFR2）是一种位于内皮细胞表面上的一种受体，参与血管生成与肿瘤发生，常在头颈部鳞状细胞癌中常有过度表达。近年来，VEGFR2作为CAR-T疗法的潜在靶点受到了广泛关注。

研究表明，基于纳米抗体的第二代VEGFR2靶向CAR-T细胞在与VEGFR2阳性靶细胞共培养时，能够在其表面表达活化标志物CD69和CD25，并表现出靶抗原依赖性，诱导IL-2和IFN-γ的产生和分泌。此外，这些CAR-T细胞还展示出靶向肿瘤血管系统中过表达VEGFR2的潜力。

人表皮生长因子受体-2（Human Epidermal Growth Factor Receptor 2，HER2）是表皮生长因子受体家族的成员，具备酪氨酸激酶活性，且在多种恶性肿瘤中通过调控细胞增殖与肿瘤发生的信号通路发挥重要作用，因此成为CAR-T疗法的理想靶点。

通过基因编辑技术，研究者成功使Jurkat细胞表达基于纳米抗体的HER2靶向CAR-T细胞，这些细胞在体外表现出更强的增殖能力、细胞因子分泌及抗肿瘤活性，优于传统的CAR-T细胞。此外，结合纳米抗体的增强靶向能力与第三代CAR设计，能够显著提高T细胞的肿瘤杀伤效果。

肿瘤相关糖蛋白72（Tumor-Associated Glycoprotein 72，TAG-72）是一种跨膜抗原，具有粘蛋白特性，在胰腺癌、乳腺癌、结直肠癌和卵巢癌等多种恶性肿瘤中常有过度表达。2013年，Sharifzadeh等人开发了基于纳米抗体的TAG-72靶向CAR-T细胞。这些CAR-T细胞不仅能降低免疫原性，还能够在单个肿瘤细胞上靶向多个位点。即使在TAG-72抗原浓度超出正常生理水平的情况下，这些CAR-T细胞依然保持其抗肿瘤活性。

此外，TAG-72阳性细胞系（如LS-174T和MCF7）的刺激可促使CAR-T细胞进行靶向抗原依赖性增殖，并诱导IL-2分泌以及肿瘤细胞的特异性细胞毒性反应[2]。

前列腺特异性膜抗原（Prostate-Specific Membrane Antigen，PSMA）是一种在前列腺组织中高表达的抗原，尤其在前列腺癌中表达更为显著，因此成为前列腺癌诊断与治疗的重要靶点。传统基于scFv的CAR-T疗法已应用于局部及晚期前列腺癌的治疗。

近年来，纳米抗体逐渐被引入PSMA靶向CAR-T的开发。研究人员成功开发了基于纳米抗体的PSMA靶向CAR-T细胞，结果表明，这些细胞在与PSMA阳性LNCaP细胞共培养时，表现出显著的抗原依赖性扩增、细胞因子分泌以及CD69活化标志物的上调。

磷脂酰基醇蛋白聚糖2（Glypican 2，GPC2）是一种跨膜蛋白，主要参与神经细胞的黏附和信号传导，在约50%的神经母细胞瘤患者中呈现高表达。研究表明，抑制GPC2的表达可抑制肿瘤细胞生长，因此GPC2成为神经母细胞瘤的潜在靶点。有研究人员通过噬菌体展示技术筛选出针对GPC2的纳米抗体，并开发了基于该纳米抗体的GPC2靶向CAR-T细胞。体外实验显示，这些CAR-T细胞能显著抑制神经母细胞瘤的生长，并在动物模型中有效降低肿瘤负担。

CD38是一种在多种免疫细胞上表达的跨膜糖蛋白，尤其在多发性骨髓瘤中表达显著，因此成为靶向治疗的重要候选靶点。2018年，An等人开发了针对CD38的特异性纳米抗体，并生成了基于该纳米抗体的CD38靶向CAR-T细胞。研究结果表明，这些CAR-T细胞在与CD38阳性肿瘤细胞接触后能产生显著的抗肿瘤活性和细胞因子分泌，并在小鼠模型中有效抑制肿瘤生长。然而，这些CAR-T细胞对正常表达CD38的免疫细胞也表现出一定的细胞毒性，提示需要进一步研究以确保其安全性[3]。

CD33是一种在急性髓系白血病细胞中高表达的抗原。2020年，研究者通过免疫骆驼生成了针对CD33的纳米抗体，并用于开发基于纳米抗体的CD33靶向CAR-T细胞。这些CAR-T细胞能够特异性杀伤急性髓系白血病肿瘤细胞系（如U937、HL60、MOLM13和Thp1），并在与这些细胞共培养时显著分泌细胞因子。在动物模型中，这些CAR-T细胞能够显著延长小鼠的生存时间。然而，研究还指出，这些CAR-T细胞对表达CD34的造血前体细胞也具有细胞毒性，表明其可能对正常造血系统产生不良影响。

CD7是一种在自然杀伤细胞和T淋巴细胞表面表达的糖蛋白，在T细胞急性淋巴细胞白血病和T细胞淋巴瘤中常见高表达，因此成为T细胞恶性肿瘤的潜在免疫治疗靶点。然而，CD7也在CAR-T细胞本身上表达，导致“自相残杀”现象，即CAR-T细胞攻击自身，从而显著减少其在体内的持久性和抗肿瘤活性。最近的一项I期临床试验中，评估了基于纳米抗体的CD7重定向CAR-T细胞在治疗T细胞恶性肿瘤中的安全性和有效性。结果表明，这种CAR-T细胞耐受性良好，并展现出显著的治疗潜力。

黏蛋白1（Mucin 1，MUC1）是一种在乳腺癌中过度表达的蛋白，通常与癌细胞中的基因突变和转录失调相关，成为乳腺癌免疫治疗的理想靶点。2009年，研究人员首次开发了基于纳米抗体的MUC1重定向CAR-T细胞，这些细胞能够特异性靶向表达MUC1的乳腺癌细胞。随后的多项研究进一步证实了该CAR-T细胞在体外和体内实验中对乳腺癌细胞的有效杀伤效果。

表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）是一种在多种癌症（如乳腺癌、头颈癌和前列腺癌）中高表达的受体酪氨酸激酶。尽管基于scFv的EGFR靶向CAR-T细胞已有广泛研究，基于纳米抗体的EGFR靶向CAR-T细胞研究仍相对较少。Albert等人通过纳米抗体设计了EGFR的靶向模块，用于重定向表达UniCAR的T细胞（UniCAR-T细胞）。这些UniCAR-T细胞在靶向EGFR阳性肿瘤细胞时表现出良好的抗肿瘤活性，特别二价纳米抗体重定向模块时，针对低水平EGFR表达的肿瘤细胞展现出更强的杀伤效果[3]。

CD20是B细胞分化过程中的跨膜标志物，常在B细胞恶性肿瘤中高表达。研究显示，基于纳米抗体的CD20靶向CAR-T细胞在体外和体内实验中表现出显著的抗肿瘤活性。此外，研究还开发了基于纳米抗体的双特异性CAR-T细胞，能够同时靶向CD20和HER2。这些双特异性CAR-T细胞展示了对两种抗原同时表达的肿瘤细胞的有效杀伤作用，展现出极具前景的抗肿瘤效果[5]。

细胞程序性死亡配体1（Programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1）和纤维连接蛋白的剪接变体EIIIB是肿瘤微环境中的两个关键靶点。PD-L1的过表达导致免疫抑制，阻止T细胞对肿瘤细胞的攻击；EIIIB则特异性表达于肿瘤的细胞外基质和新生血管中，而在健康组织中几乎不表达，使其成为理想的抗肿瘤靶点。研究者开发了一种基于纳米抗体的CAR-T细胞，双重靶向PD-L1和EIIIB。在体内外实验中展示了其强大的抗肿瘤活性，显著延缓了肿瘤生长并延长了小鼠的生存期。这种双重靶向策略不仅提升了CAR-T细胞在实体瘤中的抗肿瘤效果，还激活了肿瘤部位的免疫反应，显示出较大的临床应用潜力。

CD105是一种跨膜糖蛋白，作为转化生长因子β的共受体，参与血管生成，特别是在肿瘤新生血管中高度表达。CD105已被提议作为实体瘤靶向治疗的有效抗原。研究人员开发了基于纳米抗体的CD105靶向CAR-T细胞。体外实验显示，这些CAR-T细胞能够特异性识别并激活表达CD105的肿瘤细胞，诱导T细胞表面活化标志物（如CD25和CD69）的过表达。在多种肝癌细胞系和小鼠异种移植模型中，这些CAR-T细胞有效抑制了肿瘤生长，显著延长小鼠的生存期。

B细胞成熟抗原（B-cell maturation antigen，BCMA）是一种膜跨越蛋白，主要参与B细胞的成熟与分化，尤其在浆细胞中高度表达。在多发性骨髓瘤中，恶性浆细胞对BCMA的高度表达，使其成为CAR-T疗法的理想靶点。多项临床研究表明，基于纳米抗体的BCMA靶向CAR-T细胞在治疗复发/难治性多发性骨髓瘤中展现了显著疗效。在一项I期临床试验中，开发了一种名为LCAR-B38M的双表位纳米抗体CAR-T，靶向BCMA的两个不同表位。研究结果显示，57名接受治疗的患者中，有88%的患者产生了临床反应，其中68%达到了完全缓解。这些结果表明，基于纳米抗体的BCMA靶向CAR-T细胞疗法在血液肿瘤治疗中具有巨大潜力。

CAR-T细胞疗法在治疗难治性血液肿瘤中展现了巨大的潜力。然而，传统的scFv靶向结构域在疗效和安全性方面存在局限性，尤其是在实体瘤中的应用。纳米抗体的引入为克服这些问题提供了新的途径。与scFv相比，纳米抗体结构更稳定，免疫原性更低，同时减少了CAR-T细胞治疗过程中免疫衰竭的风险。2022年，首个基于纳米抗体的CAR-T产品——Ciltacabtagene Autoleucel——获得了美国FDA的批准，用于治疗复发/难治性多发性骨髓瘤，这标志着纳米抗体CAR-T疗法进入了临床应用的新时代。未来，随着研究的深入和技术的进步，纳米抗体CAR-T疗法有望在癌症免疫治疗中发挥更大的作用。