Nature Communications最新发文：纳米抗体抑制HIV-1感染

第三次和第四次免疫获得的高滴度抗血清表明在第四次免疫后CD4-rFc能够在羊驼中诱导出强烈的免疫反应（图1a-c）。为了评估抗血清对HIV-1感染的中和活性，选择一组代表不同亚型的多种HIV-1假病毒株进行中和试验。在第四次免疫后获得的抗血清对所有13种代表性的HIV-1假病毒表现出强大的中和活性，平均50%抑制稀释值为9165，并且中和了13种假病毒中的12种，平均90%抑制稀释值为931（图1d，e）。结果表明，CD4诱导的抗血清具有广谱且强大的中和HIV-1感染的能力，从而为后续分离抗CD4中和纳米抗体奠定了基础。

为了分离抗CD4纳米抗体，利用从最后一次免疫获得的外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC）构建了展示纳米抗体的噬菌体文库。随后基于富集的噬菌体文库构建了细菌文库，以获得分泌的纳米抗体进行特征描述。在挑取的1920个单个克隆中，有429个在酶联免疫吸附测定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）上为阳性结合物（图2a），其中47个结合物对HIV-1感染具有中和活性（图2b）。对429个阳性结合物和47个中和剂进行序列比对，发现阳性结合物具有高度多样性（图2c）。

为了进一步表征抗CD4纳米抗体，在293 F细胞中以VHH-融合人Fc4形式进行表达（图2d）。47个细胞上清液中有29个能够结合CD4并有效中和超过50%的人HIV-1感染（图2e）。此外检测它们与CD4的结合亲和力，31个纳米抗体表现出纳摩尔范围内的亲和力（图2f）。基于该结果和序列分析，纯化了五个具有不同序列的纳米抗体（Nb₃₁₉-Fc、Nb₄₃₄-Fc、Nb₄₅₇-Fc、Nb₅₀₅-Fc和Nb₆₀₆-Fc），以进一步评估它们对代表性HIV-1假病毒的中和活性，其中Nb₄₃₄-Fc和Nb₄₅₇-Fc根据其中和曲线被发现是最有效的（图2g）。

为了评估抗CD4纳米抗体Nb₄₃₄-Fc和Nb₄₅₇-Fc的中和活性，使用一组包含35种HIV-1假病毒的面板进行分析。结果显示Nb₄₃₄-Fc（中位IC₅₀和IC₉₀值分别为0.11nM和0.8nM）和Nb₄₅₇-Fc（中位IC₅₀和IC₉₀值分别为0.05nM和0.33nM）都明显比伊巴利珠单抗更有效（中位IC₅₀和IC₉₀值分别为0.15nM和26.145nM）（图3a，b）。总体而言，三种抗体都表现出显著的抑制活性，在所有测试的假病毒中达到50%的中和效果（图3a）。与伊巴利珠单抗相比，Nb₄₃₄-Fc和Nb₄₅₇-Fc分别在100%和91.4%的测试假病毒中实现了90%的感染抑制，而伊巴利珠单抗仅在54.2%的测试假病毒中实现了90%的感染抑制（图3b）。发现所有17种对伊巴利珠单抗耐药的假病毒都可以被Nb₄₃₄-Fc中和，14种对伊巴利珠单抗耐药的假病毒可以被Nb₄₅₇-Fc中和（图3c）。此外观察到这三种抗体对不同亚型的HIV-1假病毒表现出不同的效力（图3d-f）。研究结果表明，Nb₄₃₄-Fc和Nb₄₅₇-Fc比伊巴利珠单抗表现出更强和更广泛的中和能力。

为了阐明Nb457对HIV-1强效中和作用的分子机制，确定了Nb457-D1D2与CD4复合物的晶体结构，Nb457与CD4周围的埋藏表面积（Buried Surface Area，BSA）约为700Å2（图 4a、b）。Nb457主要通过CDR2和CDR3与CD4的D1和D2结构域相互作用，CDR1不参与识别CD4（图4a-e）。CDR2与CD4上的特定区域形成核心相互作用界面，有多个氢键和疏水相互作用，CDR3也提供了两个氢键贡献（图4d、e）。除了氢键之外，一组16个残基还通过额外的疏水相互作用进一步加强了Nb457与CD4的结合（图4c）。

为了进一步探究Nb457抑制HIV-1进入CD4细胞的机制，将CD4-Nb457复合物与HIV-1的CD4-gp120复合物进行了叠加。分析表明Nb457的结合位点与gp120的结合位点不同。Nb457的结合导致CD4的D1结构域界面发生了实质性的构象变化（图4f）。为了验证该结构变化，分别使用CD4的D1D2和含有gp140三聚体进行了结合实验。结果显示Nb457阻碍了D1D2与gp140的结合（图4g）。值得注意的是，D1D2预先与gp140结合并没有显著影响Nb457随后与CD4的结合（图4h）。总的来说，这些发现证实Nb457通过诱导D1对gp120识别界面的构象变化，破坏了CD4与gp120之间的相互作用。

为了减轻与Fc融合标签相关的潜在副作用，并延长Nb457的体内半衰期，构建了基于Nb457的三聚体纳米抗体Nb₄₅₇-Nb_HSA-Nb₄₅₇（约40kDa）（图5a），其对CD4蛋白和人血清白蛋白（Human Serum Albumin，HSA）具有较高的结合亲和力。

为了评估Nb₄₅₇-Nb_HSA-Nb₄₅₇对抗HIV-1变异体的广度和效力，利用全球范围内的12种特征明确的HIV-1假病毒进行了中和分析，结果表明Nb457在该面板中成功中和了11种HIV-1假病毒。此外组装了一个广泛耐药的HIV-1假病毒面板进行耐药病毒评估，Nb₄₅₇-Fc和Nb₄₅₇-Nb_HSA-Nb₄₅₇都有效地中和了所有测试的广泛耐药病毒，这表明Nb457产生耐药性的可能性较低。为了进一步评估Nb457的中和潜力使用了活的HIV-1。与Nb₄₅₇-Fc和伊巴利珠单抗相比，Nb₄₅₇-Nb_HSA-Nb₄₅₇对活的HIV-1感染表现出显著增强的中和活性。Nb₄₅₇-NbHSA-Nb457中和了所有五种测试的HIV-1活病毒株，包括不同层级的变体（图5b-g）。在90%抑制水平下Nb457-NbHSA-Nb457、Nb457-Fc和伊巴利珠单抗对抗活的HIV-1感染分别实现了100%、80%和40%的抑制率。总之，Nb457-NbHSA-Nb457的独特结构排列显示出在所有测试的HIV-1活病毒株范围内卓越的中和效力，其最大抑制百分比值（Maximum Percent Inhibition,MPI）达到了100%的最佳阈值，显著降低了病毒逃逸的可能性。

为了评估Nb457在治疗HIV-1感染中的体内疗效，建立了感染HIV-1的人源化小鼠模型（NDG-HuPBL）。在感染后第1 天、第3天、第5天和第7天，通过腹腔内加皮下途径向感染HIV-1的NDG-HuPBL小鼠（n=4）给予每只小鼠400μg的纳米抗体（图6a）。每周检测血液中的病毒载量，结果显示对照组呈逐渐增加趋势，而治疗组的病毒载量明显低于对照组。伊巴利珠单抗和Nb457-NbHSA-Nb457组在感染后第3周和第4周病毒载量降低了2到5个对数（图6b）。为了进一步验证病毒载量，从处死的小鼠中分离脾细胞，进行体外培养两天，然后对细胞上清液中的病毒RNA进行定量。接受Nb457或伊巴利珠单抗治疗的小鼠的细胞上清液中的病毒RNA水平明显低于对照组（图6c）。Nb457-NbHSA-Nb457治疗组的2/4个细胞上清液中未检测到病毒RNA，这与血液中的病毒RNA水平一致（图6b，c）。脾脏中P24的免疫荧光染色也显示Nb457-Fc或伊巴利珠单抗治疗组的P24 +阳性细胞减少，而接受Nb457-NbHSA-Nb457治疗的小鼠中，P24 +阳性细胞仅呈零星且有限的分布（图6d）。研究表明，Nb457-NbHSA-Nb457与Nb457-Fc和伊巴利珠单抗一样，对体内HIV-1复制具有强大的抑制作用。通过病毒中和试验和脾脏的免疫染色证实Nb457-NbHSA-Nb457表现出较高的疗效。

本研究从CD4免疫的羊驼中分离出抗CD4纳米抗体，其中Nb457对HIV-1具有高效力和广谱活性，工程化的三聚体Nb457纳米抗体（Nb457-NbHSA-Nb457）对活HIV-1有完全抑制作用。其结构分析揭示Nb457诱导CD4构象变化阻碍病毒进入，且Nb457在人源化雌性小鼠模型中显示出治疗效果。这些发现突出了抗CD4纳米抗体作为有前景的HIV-1治疗药物的潜力，为临床治疗HIV-1这一全球健康挑战提供了新的思路和潜在的治疗方法。后续的研究需要更深入地探索Nb457的抗性特征，以及在临床应用中的免疫原性问题，监测和评估其在临床试验中的表现。