VLP前沿 | 可改善阿糖胞苷对急性髓性白血病的治疗

AML的发展特征为未分化髓系前体细胞的克隆扩增。AML受其遗传、表观遗传和表型等因素影响，具有高度异质性。目前的治疗方案通常包括核苷类药物Ara-C和蒽环类药物Daunorubicin，个性化治疗选择也在逐渐增多，并已识别出新的临床前靶点，但老年患者的反应和生存率仍然较低。

在病毒与宿主细胞的相互作用中，宿主细胞会演化出一些机制来限制病毒的复制，以保护自己免受病毒感染，而病毒也会演化出对策来反制宿主的防御机制。SAMHD1就是这样一种宿主限制因子，它是一种脱氧核苷酸三磷酸水解酶，能将dNTPs裂解成脱氧核苷酸和无机三磷酸，降解病毒复制所需的核苷酸，从而抑制病毒的复制。HIV-2和某些猴免疫缺陷病毒（Simian Immunodeficiency Virus，SIV）表达Vpx，通过蛋白酶体降解降低细胞内SAMHD1水平，帮助病毒逃避宿主的免疫防御。存在于所有灵长类慢病毒中的Vpr与Vpx同源，通常不阻断SAMHD1介导的病毒限制，但德布拉扎猴（Cercopithecus neglectus，SIVdeb株）和长须猴（Cercopithecus cephus，SIVmus株）的Vpr可降解SAMHD1。

之前的研究表明，SAMHD1是AML患者对Ara-C耐药的生物标志物。SAMHD1水解Ara-C的活性形式Ara-CTP，大幅降低Ara-C的细胞毒性。基于SAMHD1在dNTP稳态中的关键作用，研究人员进行了概念验证研究，旨在基因上最小化基于SIV的VLPs，以创建更安全、更简单的VLPs，并测试其在AML细胞系和原代AML细胞中降解SAMHD1并增强Ara-C细胞毒性的功能有效性。

基于之前的研究，SAMHD1表达和Ara-C细胞毒性呈负相关，含有Vpx的VLPs可短暂地降解SAMHD1，在体外和体内改善Ara-C的细胞毒性，研究人员设计了一种最小化的第二代VLPs，不含辅助和调节蛋白（图1A）。由于原代静息CD4⁺T细胞与原代髓系细胞的SAMHD1表达水平相当，且更易操作，因此电转将带有3xFLAG标签的Vpx/Vpr表达质粒和pMAX GFP共转染到CD4⁺T细胞中，并染色检测胞内SAMHD1水平，发现SIVmac239 Vpx能够降解SAMHD1，而SIVmnd-2 Vpx则不能，SIVdeb Vpr和SIVmus Vpr引起轻微的SAMHD1降解，程度与HIV-2 Vpx相当（图1B）。将所有Vpx/Vpr亚克隆到第二代VLPs中，保留自然的Vpx/Vpr定位，从而实现LTR驱动表达和复杂剪接，并通过SG-PERT测定逆转录酶（Reverse Transcriptase，RT），发现第一代和第二代VLPs之间观察到约270倍的RT活性差异（图1C），这与Western blotting（WB）检测到Gag和p27结果一致（图1D）。第二代VLPs保留了Rev响应元件（Rev Response Element，RRE），介导未剪接SIV转录本的核输出，推测添加Rev可能会增加VLPs产量，结果显示，添加一定比列的HIV-1 Rev可提高VLPs产量和p27衣壳水平（图1E、G），达到了第一代的水平，而这与Vpx/Vpr的插入无关（图1F）。WB检测FLAG标签，测量Vpx/Vpr在第二代VLPs中的结合情况，包装效率方面观察到了差异（图1H），因此，后续实验使用具有良好结合水平的VLPs。特定的Vpx/Vpr能够有效降解SAMHD1，而HIV-1 Rev的添加可以显著提高VLPs的产量，以上成功生成基于SIV的最小化VLPs，并对其进行了优化，以用于Vpx蛋白的输送。

研究人员使用天然高表达内源性SAMHD1的THP-1细胞系，测试了第二代VLPs降解SAMHD1的能力。使用不同量的第一代和第二代VLPs进行转导，24小时后通过流式细胞术分析细胞内SAMHD1的水平，SIVmac239 Vpx和HIV-2 7312a Vpx能够与第一代含Vpx的VLPs（ΔVpr VLPs）一样降解SAMHD1，HIV-2 ROD9 Vpx和SIVmnd-2 Vpx不能诱导SAMHD1降解（图2A）。Vpx介导的SAMHD1降解应导致Ara-CTP（SAMHD1底物）水平的增加，图2B未观察到一代VLPs与二代SIVmac239 Vpx VLPs在Ara-CTP水平的显著差异，HIV-2 7312a Vpx降低了Ara-CTP水平，而HIV-2 Rod9 Vpx和空的对照第二代VLPs则无法检测到Ara-CTP。使用天然高表达SAMHD1（THP-1、OCI-AML2、OCI-AML3、MonoMac6）、低表达SAMHD1（HEL、HL-60）、稳定过表达SAMHD1（HEL）、敲除SAMHD1（THP-1（SAMHD1-/-））的细胞系，测定在不同浓度的Ara-C处理后存活细胞的百分比，并计算IC₅₀值（图2C、D）。在没有Ara-C的情况下，一代VLPs诱导轻微细胞毒性，而二代VLPs则没有这种效应；在低表达SAMHD1细胞系中，VLPs处理对Ara-C细胞毒性没有影响；第一代VLPs与第二代标记的SIVmac239 3xFLAG-Vpx VLPs在高表达SAMHD1细胞系中未观察到统计学显著差异，在稳定过表达SAMHD1的HEL细胞系中（图2灰色条与红色条对比）观察到显著性差异；HIV-2 7312a的效率低于SIVmac239 Vpx，而HIV-2 Rod9无法增强Ara-C的细胞毒性，效果与SIVmnd-2 Vpx和空对照（ΔVpx ΔVpr VLPs）相当。

综上，第二代VLPs在降解SAMHD1和增强Ara-C细胞毒性方面与第一代VLPs相当，本身不具有细胞毒性，这可使它们成为更安全的治疗选择。

在SAMHD1降解和提高Ara-C细胞毒性方面，第二代3xFLAG标记的SIVmac239 Vpx VLPs与第一代VLPs最为接近，但第一代VLPs的性能略好（图2D），研究人员试图探究这两者之间的差异。这两种Vpx相差两个氨基酸（SIVmac239的P64和I75，SIVmac251的Q64和M75）和3xFLAG标签（图3A、B）。分析第二代不同突变体的Ara-C IC₅₀值发现，在自然低表达SAMHD1的HEL细胞中IC₅₀没有差异；在THP-1细胞中，与SIVmac239 FLAG-Vpx相比，单独突变P64Q和I75M导致Ara-C细胞毒性的效果分别降低6倍和11倍，3xFLAG标签并不影响Ara-C细胞毒性（图3C、D）。综上，特定氨基酸的突变对Vpx功能有显著影响，可通过调整氨基酸序列来恢复，添加3xFLAG标签不影响Vpx功能，表明第二代VLPs在简化结构后仍能保持有效性。

研究人员用VSV-G伪型的第一代和第二代VLPs转导AML患者（确诊后未治疗）的骨髓样本，24小时后通过流式细胞术分析细胞内SAMHD1的水平。在五位患者中，第一代VLPs对C和D患者的SAMHD1具有降解效果，而第二代SIVmac239 Vpx VLPs只在患者C身上有效果，效率大约降低了两倍（图4A）。转导24小时后，用Ara-C处理细胞，分析活细胞百分比并计算Ara-C IC₅₀值，发现第一代VLPs在患者B和C中具有轻微的细胞毒性；第二代SIVmac239 Vpx VLPs只在患者C身上观察到Ara-C IC₅₀大约三倍的改善（图4B、C）。研究人员推测VLPs的VSV-G驱动进入细胞造成AML细胞系和AML原代细胞之间的差异，于是进行了病毒融合测定，发现原代AML细胞中只有12%到45%的病毒进入（图4D），相比之下，AML细胞系中高达96%的进入率，这解释了在原代AML细胞中效果较差的原因。综上，第一代和第二代VLPs在原代AML细胞中的效率降低，可能是由于使用的VSV-G转导性较低导致的。

本研究针对AML的新型Vpx-VLPs进行了设计和测试，旨在通过降解SAMHD1蛋白，提高Ara-C的治疗效果。研究团队发现，简化的第二代VLPs能够高效降解SAMHD1，从而增强Ara-C的细胞毒性。与第一代VLPs相比，第二代VLPs在不降低功效的情况下，减少了细胞毒性，且在AML细胞系中显示出良好的效果。然而，在原代AML细胞中，第二代VLPs的效果较差，这可能与VLPs对VSV-G的低敏感性有关。研究还发现，VLPs的转导效率可能与LDLR受体的表达水平有关。本研究成功地最小化了VLPs，将Vpx传递到AML细胞中，这会减少由于辅助和调节蛋白引起的不良反应。

该项研究证实了第二代VLPs在降解SAMHD1和增强Ara-C细胞毒性方面的潜力，未来的研究需要探索更有效的靶向AML细胞的策略，以提高VLPs在原代AML细胞中的转导效率。