导读
在医学科学的前沿领域，血栓形成和炎症一直是研究的热点和难点，这两种病理过程紧密交织，在众多血管疾病的发生发展中起着关键作用。近年来，随着对凝血因子和炎症机制的深入探索，因子XII（Factor XII，FXII）逐渐成为了极具潜力的治疗靶点。而纳米抗体由于其小巧的尺寸，更容易进行工程改造，并且具有较高的稳定性，在药物研发中具有很大的优势，例如更容易穿透组织、在体内具有更好的分布和药代动力学特性等。中国医学科学院阜外医院的徐鹏飞课题组在Nature Communications（IF:14.7）上发表了题为“A single-domain antibody targeting factor XII inhibits both thrombosis and inflammation”的文章，他们发现了一种靶向FXII的纳米抗体（Nb-Fc），为血栓形成和炎症相关疾病的治疗带来了新的曙光。
一、FXII的多面角色：从血栓形成到炎症反应
FXII作为血浆蛋白酶FXIIa的酶原，启动血浆接触激活途径，促使凝血酶和缓激肽生成，从而在血栓形成中扮演重要角色。它通过触发内源性凝血级联反应，推动血栓的形成过程。当接触带负电荷表面时，它被激活转化为FXIIa。FXIIa的结构包含重链和轻链，重链由纤维连接蛋白1型和2型（Fibronectin type 1 and 2，FnI和FnII）结构域、两个表皮生长因子（Epidermal growth factor 1 and 2，EGF1和EGF2）结构域、一个Kringle结构域以及富含脯氨酸区域组成，轻链则具有蛋白酶的催化三联体。
此外，FXII在炎症反应中也有涉及，在神经炎症中，FXII通过调节树突状细胞夸大了CD4 T效应细胞的反应；在中性粒细胞中，FXII也参与了相关信号通路的调节，影响伤口愈合等过程。
二、靶向FXII的纳米抗体的研发过程
纳米抗体的筛选与鉴定
研究人员首先用人类FXII免疫羊驼（图1a），然后从羊驼的外周血淋巴细胞中构建了一个包含约2.4×10⁸个克隆的VHH免疫文库。经过对随机选取的克隆进行测序和分析，发现它们具有较大的CDR序列多样性。通过噬菌体展示技术，经过五轮针对人类FXII的生物筛选（图1b），获得了26个能够特异性识别FXII的克隆。对这些克隆进行进一步筛选和表达分析，最终选择了一个具有高结合亲和力和对FXII激活具有中和活性的纳米抗体Nb（图1c）进行深入研究。
图1 Nb的筛选与鉴定
纳米抗体及其二价构建体的表征
（1）结合亲和力测定
（2）表位映射与热稳定性分析
通过Dot blot杂交、Western blotting以及对FXII单个结构域的重组表达和分析，发现Nb的结合表位具有构象依赖性，且主要识别FXII的FnII和Kringle结构域（图2c，d）。同时，通过圆二色性测定，Nb的熔解温度为74.81°C，显示出较高的热稳定性。
（3）对FXII激活的抑制作用
在体外实验中，使用多种触发FXII激活的试剂（如鞣酸、多聚磷酸盐和葡聚糖硫酸酯）（图2e-g），发现Nb能够剂量依赖性地抑制FXII的激活，但不抑制已经激活的FXIIa（图2h）。Nb-Fc也能够剂量依赖性地抑制鞣酸诱导的FXII激活和血浆激肽释放酶的形成（图2i，j），并且能够延长人血浆激活部分凝血活酶时间（Activated partial thromboplastin time，aPTT）（图2k），但不影响凝血酶原时间（Prothrombin time，PT）（图2l），这表明Nb-Fc特异性地靶向凝血的内源性途径。
图2 Nb及Nb-Fc的表征
三、纳米抗体在体内外模型中的治疗效果
在血栓形成模型中的作用
图3 用Nb-Fc治疗小鼠可抑制血栓形成而不影响止血
在体外膜肺氧合（Extracorporeal membrane oxygenation，ECMO）相关模型中的作用
在小鼠ECMO模型中（图4a，b），与单独使用肝素相比，联合使用Nb-Fc（2.0 mg/kg）和肝素（图4c）能够显著减少氧合器膜上的血栓沉积和总蛋白含量（图4d，e），并且在ECMO运行24小时后，能够减少肝脏和肾脏中的微血管血栓形成（图4f）。同时，ECMO过程会导致循环中D-二聚体、碱性磷酸酶、肌酐和TNF-α水平升高，以及中性粒细胞黏附、血小板聚集和它们之间的相互作用增加，而Nb-Fc治疗能够显著减轻这些病理反应（图4g-j）。此外，通过对肝脏和肾脏组织的病理学分析，发现Nb-Fc治疗能够减轻ECMO相关的器官损伤（4k-n），这可能是由于其抑制了血栓形成和炎症反应，从而保护了器官的微血管功能。
图4 用Nb-Fc敲除或抑制FXII可抑制
小鼠ECMO相关血栓形成和炎症，并改善器官损伤
在血管炎模型中的作用
（1）免疫复合物诱导的局部血管炎模型
使用免疫复合物介导的局部血管炎小鼠模型来检测FXII的作用，通过皮肤血红蛋白含量的测定发现Nb-Fc治疗能够显著减少炎症皮肤的面积和出血程度（图5a-c）。组织学染色显示，Nb-Fc治疗能够减少中性粒细胞浸润和髓过氧化物酶水平，类似的保护作用在FXII缺陷小鼠中也能观察到（图5d-g）。在这个模型中，中性粒细胞耗竭减少了血管渗漏（图5h-l），证实了中性粒细胞在血管炎中的关键作用。这些结果表明Nb-Fc可能通过干扰与中性粒细胞活动相关的机制来发挥作用。
图5 FXII敲除或Nb-Fc抑制可改善
小鼠免疫复合物介导的血管炎
（2）抗中性粒细胞胞质抗体诱导的系统性血管炎模型
在小鼠抗中性粒细胞胞质抗体（anti-neutrophil cytoplasmic antibody，ANCA）相关的系统性血管炎模型中，Nb-Fc治疗能够减轻肾小球节段性坏死和新月体形成（图6a-c），降低血浆肌酐和尿白蛋白水平（图6d，e），并且抑制中性粒细胞在肾小球中的积累（图6f，g）。FXII基因敲除也能产生类似的保护作用，这表明FXII在血管炎的发生和发展中起着重要作用，而Nb-Fc通过抑制FXII能够改善血管炎症状。
图6 FXII敲除或Nb-Fc抑制可改善
小鼠ANCA相关的全身血管炎
对中性粒细胞迁移的影响
图7 Nb-Fc选择性抑制中性粒细胞迁移
在人血微流控分析中的作用
图8 Nb-Fc在人血液微流体分析中
抑制血栓形成和中性粒细胞活化
靶向因子XII的纳米抗体Nb-Fc在抑制血栓形成和炎症方面效果显著，这不仅为凝血和炎症关系提供理论依据，也为相关疾病治疗带来希望。在ECMO患者中，血栓形成和全身炎症是主要的并发症，目前的治疗方法存在一定的局限性，而Nb-Fc的应用可能为改善这些患者的预后提供新的策略。在血管炎疾病中，无论是局部血管炎还是系统性血管炎，Nb-Fc都显示出了良好的治疗效果，这为血管炎的治疗提供了一种新的潜在药物选择，尤其是对于那些传统治疗方法效果不佳的患者。然而，FXII在炎症中的具体机制需进一步探索，如与其他分子和细胞的相互作用及在不同疾病状态下的调节机制。同时，还需开展临床试验评估Nb-Fc在人体的安全性和有效性，确定最佳剂量和方案，研究不良反应。未来，随着研究深入和临床试验开展，期待Nb-Fc在临床治疗中发挥重要作用。
在纳米抗体技术服务领域，耀海生物拥有丰富的纳米抗体研发及生产经验，以成熟的技术平台、先进的生产设备，以及在纳米抗体全生态表达系统的开创性技术，可为客户提供从基因工程菌构建、菌种库建立、小试工艺开发/优化、中试工艺放大、IND申报和临床样品制备、质量标准建立、分析方法开发/验证、质量管理体系建立、NDA注册申报和商业化生产（MAH）的全生命周期服务。
同时，匹配了成熟完善的多规模生产平台，覆盖工艺开发与分析方法开发和验证、设备验证及质量控制、质量研究等系列服务，可满足客户从药物早期发现、临床研究至商业化生产的服务需求。
（如需相关CRDMO服务，请随时联系199 5298 1076）
