导读
寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)是一种通过蚊子传播的病毒，主要传播媒介为伊蚊。该病毒能够引起寨卡热，并可能导致严重的出生缺陷和神经系统疾病。其传播方式除了媒介传播，还包括性传播和体液传播，这些事实加上其通常无症状的性质使疾病控制更加困难。目前尚无针对ZIKV的特异性治疗药物或疫苗。因此，开发有效的疫苗对于控制ZIKV的快速传播和减少其有害影响具有重要意义。美国纽约州纽约市纽约市立大学医学院研究人员在PLOS Neglected Tropical Diseases上发表题目为《Zika Virus-like particle (VLP) based vaccine》的文章。文中宣布，他们开发了一种通过共表达结构蛋白(CprME)和非结构蛋白(NS2B/NS3)组装寨卡病毒样颗粒(Virus-like particle，VLP)的新策略，并证明了它们作为疫苗的有效性。VLP是ZIKV的非感染模拟物，因此不需要化学灭活。VLP疫苗能够保持天然表位结构，并且比灭活的寨卡病毒对照表现更好。他们的研究结果显示了快速开发一种安全且潜在高效的基于VLP的人类寨卡疫苗的可行性。
今天，由菌菌带大家详细解读这篇文献。
一、ZIKV简介及治疗现状
ZIKV通过受感染的伊蚊（主要是埃及伊蚊）叮咬传播给人类，导致寨卡热。该病毒最初于1947年在乌干达的寨卡森林从一只恒河猴身上分离出来，后于1952年在非洲人类身上发现。多年来，ZIKV在非洲通过蚊媒和非人类灵长类动物之间的森林循环传播，偶尔感染人类。但近年来，ZIKV在蚊媒和人类之间的传播循环导致疫情爆发，疾病传播至非洲大陆以外的法属波利尼西亚和其他太平洋地区。自2015年起，ZIKV在巴西迅速传播至南美洲和加勒比海地区，美国和欧洲也发现了零星病例。大多数感染者无症状或病情轻微，但孕妇感染可导致新生儿出生缺陷。此外，ZIKV感染还与吉兰-巴雷综合征病例增加有关，这些疾病给公共卫生带来巨大负担。ZIKV除通过蚊媒传播外，还可通过性接触和体液传播，且常无症状，使疾病控制更加困难。ZIKV属于黄病毒科黄病毒属，其RNA基因组编码一个开放阅读框，翻译成单一的多聚蛋白质，进一步裂解成结构蛋白(C、prM和E)和支持病毒复制的非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)（图1A）。黄病毒的复制和形态建成与细胞内膜密切相关，它通过分泌途径组装和运输，并在细胞表面释放。分泌前，病毒颗粒含C蛋白包裹的RNA，外裹脂质双层，嵌有E、M蛋白。成熟时，prM蛋白被裂解为小M蛋白和pr，pr随病毒释放。E蛋白为病毒主要抗原，介导受体结合，是疫苗开发重点。目前尚无ZIKV疫苗或疗法，因此预防性疫苗的开发至关重要。作者提出新策略生产重组ZIKV样颗粒(VLPs)，在动物模型中验证其有效性，有望成为应对ZIKV疫情的有效工具。
图1 寨卡病毒多聚蛋白加工和VLP组装策略
二、VLPs的组装策略
文中作者称他们发现了组装VLPs的新有效策略，并将其用于疫苗开发。VLP的形成是通过共表达寨卡病毒结构蛋白CprME和与辅因子NS2B相连的蛋白酶NS3Pro的截断形式来实现的，它们共同构成病毒NS2B/NS3Pro蛋白酶复合物。将表达CprME和NS2B/NS3Pro的质粒转染至Expi-293悬浮培养细胞中，产生结构多肽CprME，该多肽在细胞和共表达的NS2B/NS3Pro蛋白酶的介导下发生蛋白水解切割（图1B）。通过Western blot分析转染了单独表达CprME(ZO2)或单独表达NS2B/NS3Pro(ZO3)或两者组合质粒的细胞裂解物，评估NS2B（图2D）/NS3Pro（图2C）的表达和多肽CprM（图2B）、E（图2A）的加工情况。其中ZIKV是来源于MR-766株，Mock是来源于未感染的（模拟）Vero细胞。该分析证明了NS2B/NS3Pro的蛋白质表达以及活性，其能够在随后从多聚蛋白切割C之前自切割解偶联NS2B和NS3Pro，由细胞信号酶蛋白酶介导的进一步切割加工步骤将E与M分离，并将C与pr分离。
图2 通过蛋白质印迹分析转染
细胞裂解物中的蛋白质表达和加工
三、VLP的产生和表征
主要结构蛋白E和M的生成
在共转染质粒ZO2(CprME)和ZO3(NS2B/NS3Pro)后，在ExpiHEK 293细胞的悬浮培养物中进行Zika VLP的重组生产。从培养物上清液中收获VLP并对其进行纯化。通过分析发现E蛋白为ZIKV和VLP制剂两者的主要组分（图3A），并通过Western印迹分析验证了E蛋白的身份，M蛋白也可以被清楚的鉴定（图3B）。在纯化的ZIKV-MR-766和VLP的E蛋白之间也观察到在细胞裂解物中检测到的E蛋白的迁移差异，并且发现ZIKV-FSS和VLP的E蛋白表现出相似的大小（图3C），差异原因是由于ZIKV-MR-766中缺乏四个氨基酸，包括糖基化位点N-154。由此可知Zika VLP的重组生产清楚的表达了结构蛋白E和M。
图3 通过考马斯蓝染色和蛋白质
印迹分析纯化的VLP和ZIKV
E蛋白的构象中和表位验证
为了证实E蛋白的构象中和表位是否显示在VLPs上，作者使用了小鼠单克隆抗体(MAb)4G2、MAb ZV-48、ZV-64和ZV-67，通过斑点印迹法探测纯化的VLPs和ZIKV（图4）。检查显示了VLP确实被这些MAb识别，表明这些中和表位在VLP中正确展示。
图4 天然VLP和天然及灭活寨卡病毒
与识别结构表位的MAb的反应性检查
四、阴性染色和免疫金标电镜
为了进一步表征VLPs的结构和表面组成，我们通过透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)检查了纯化的材料。与纯化的ZIKV（图5E）的比较分析表明，VLP（图5A）和病毒颗粒（图5B）在大小、形态和表面外观上相似。VLP为均一的球形结构，表面光滑，无明显的突出或粗糙特征。为了更好地确定VLPs的表面组成，作者使用了两种抗体探测重组颗粒，分别是4G2（图5C）和来自寨卡病毒患者的多克隆人血清（图5D）。对纯化的ZIKV的检测也显示出与4G2抗体的同等反应性（图5F）。结果表明E蛋白展示在颗粒表面，并且保持天然构象。
图5 VLPs和ZIKV的阴性染色
和免疫金标记的电子显微照片
五、基于VLP的ZIKV疫苗评估
ELISA法评价免疫原性
作者使用两种寨卡病毒株(MR-766和FSS 13025)作为抗原，通过ELISA评估了所有接种疫苗的动物中的总血清IgG应答水平。ELISA结果表明，接种低剂量(1 μg)或高剂量(4 μg)VLP疫苗的小鼠刺激了针对两种寨卡病毒株的高水平血清抗体的产生（图6）。当VLP疫苗与Adj一起配制时，这种应答增强（图6）。结果揭示了VLP和灭活的寨卡病毒对照组合物都能够引发针对两种寨卡病毒的高抗体应答。
图6 评价VLP和对照疫苗接种引起的血清IgG应答
VLP疫苗中和效力评估
已发现高滴度特异性中和抗体的激发与黄病毒感染的保护相关，虽然这还没有建立ZIKV，但很可能存在高滴度的中和抗体提供保护感染。作者使用先前描述的两种ZIKV的空斑减少中和试验(Plague reduction test，PRNT)评估了VLP疫苗和对照品引起的中和抗体水平。结果显示：较低剂量的VLP疫苗引起的中和抗体滴度明显高于阴性对照组；当Adj是配方的一部分时，反应增强（图7）。相比之下，在等效剂量和制剂下的In-ZIKV低于VLP疫苗的中和抗体滴度（图7）。将VLP疫苗剂量增加至4 μg后发现引起了显著更高的抗体滴度（图7）。
图7 通过针对两种寨卡病毒的空斑
减少中和试验（PRNT）的血清中和抗体应答
此外，作者使用了从Zika感染中恢复的患者的人血清作为参考。由于人血清是从最近感染的患者获得的，因此它可能更好地中和了同期的ZIKV-FSS，这表明这两种病毒之间可能存在中和表位的差异。这些结果都在表示VLP疫苗在引发中和抗体应答方面比In-ZIKV优越（图7，表1）。
表1 VLP疫苗和对照品引起的中和
抗体应答（PRNT 50）的比较
由于黄病毒感染可诱导异源/共循环病毒的抗体依赖性(Antibody dependent enhancement，ADE)感染增强，作者测试了针对ZIKV的VLP或对照疫苗接种引发的抗体应答是否可在增强登革病毒感染中起作用。使用MAb 4G2作为阳性对照，使用DENV-2作为阴性对照。该研究显示，由VLP疫苗接种引发的对ZIKV的抗体应答不增强DENV-2的感染（图8）。表明测试的稀释度下由这些ZIKV疫苗引发的抗体应答不诱导登革热2型病毒的ADE增强。
图8 通过疫苗接种引发的抗ZIKV应答
对登革病毒感染的ADE增强
纽约市立大学医学院研究人员通过构建表达结构性多聚蛋白CprME与非结构性NS2B/NS3Pro的质粒转染至Expi-293悬浮培养细胞中，足以自组装和释放无病毒RNA的VLP。纯化的VLP在大小、形态和抗原组成方面类似于野生型寨卡病毒，为疫苗开发提供了合适的策略。VLP具有没有感染性或不能复制，不需要灭活，更好地保留蛋白质结构和构象表位，等的优势。经过研究发现所有VLP疫苗和In-ZIKV对照制剂引起高滴度的血清抗体，并且不会引起ADE增强。
这项研究描述了一种安全，有效和简单的策略，以快速生产寨卡疫苗。它可以在哺乳动物细胞的悬浮培养物中通过标准发酵技术来实现，为快速扩大生产规模提供了合适的系统，并且不容易触发感染。疫苗的颗粒性质和各种构象抗原位点的保留甚至可以使这种疫苗在不使用佐剂的情况下对人类有效。综上所述，寨卡VLP平台提出了一种疫苗组合物和生产系统，可用于临床开发安全有效的预防性寨卡疫苗，这是应对寨卡疫情蔓延带来的挑战所急需的。
耀海生物，作为一家专业领先的微生物表达体系合同研发与生产组织（CRDMO）服务提供商，致力于为广大客户提供专业、高效的生物技术服务。公司专注于以大肠杆菌和酵母菌表达体系，开展一系列生物制药的发酵、纯化、制剂工艺开发和生产的一站式外包服务。我们的服务范围涵盖了多肽药物、重组蛋白药物、病毒样颗粒（VLP）、质粒DNA、纳米抗体等多种生物药的开发与生产。
此外，耀海生物还提供科研级别的mRNA、CircRNA和SaRNA等前沿技术的定制服务，以满足不断发展的生物科研和制药需求。我们以严格的质量管理体系、先进的实验设施和丰富的行业经验，确保为客户提供高品质的产品和一站式解决方案，助力客户在生物医药领域的创新与发展。
（如需相关CRDMO服务，请随时联系199 5298 1076）
