导读
自20世纪60年代中期以来，毕赤酵母受到越来越多的科学关注。毕赤酵母是一种与蛋白质工业生产相关的酵母菌株，以其为宿主的外源基因表达系统近年来发展迅速，被认为是分子生物学中用于产生重组蛋白的重要和广泛接受的工具，应用于生物医药、工业酶制剂、化妆品及基础研究等各个领域。2023年澳大利亚研究人员在Biomolecules上发表了题目为《Industrial Production of Proteins with Pichia pastoris-Komagataella phaffii》的综述。详细介绍了毕赤酵母在重组蛋白生产中的优势、劣势、解决策略、工作流程及毕赤酵母合成重组蛋白的工业方法等，旨在为毕赤酵母的进一步研究提供理论基础。
一、毕赤酵母概述
基本介绍
毕赤酵母最初从法国板栗树渗出物中分离出来，历经多次分类和研究，其作为单细胞蛋白来源因经济原因受挫后，又被用于表达异源蛋白质。毕赤酵母是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌，在蛋白质工业生产中具有多种优势。
关键基因及宿主菌株类型
酒精氧化酶1基因（Alcohol Oxidase，AOX1）的启动子PAOX1是常用的强启动子，受甲醇诱导、甘油等抑制[1]。根据利用甲醇的能力，主要有Mut+、Muts、Mut-三种宿主菌株类型。AOX1和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-Phosphate，GAP）启动子是表达目标蛋白最常用的两个启动子。近年来在启动子改进、合成新启动子或定制野生型菌株方面有很多进展，相关成果多受专利保护。
图1 毕赤酵母生物技术
二、毕赤酵母在重组蛋白生产中的优势
与哺乳动物宿主相比
发酵效率高：酵母表达系统可在短时间内进行高密度发酵，相比哺乳动物细胞能更快速地生产蛋白质；蛋白质加工能力完备：能够对蛋白质进行正确折叠、蛋白酶解加工、二硫键形成和糖基化等操作，这些都是保证蛋白质具有生物活性的关键过程[2]；操作和成本优势：相较于昆虫或哺乳动物表达系统，毕赤酵母操作更为简单，成本更低，并且适合大规模的工业生产。
自身优势
遗传操作便捷：具有快速且自动化友好的遗传工程特性，方便对其进行基因改造以满足生产需求；发酵条件优良：可以按照既定的方案进行高密度发酵，同时遗传结构稳定，有利于稳定生产目标蛋白；工具丰富：拥有大量公开可用的工具，为研究和生产提供了便利；产物产量可观：具有较高的分泌效率和生物量产量，能够生产出较多的重组蛋白；启动子优势：PAOX1是常用的强启动子，受甲醇诱导被甘油、乙醇和葡萄糖抑制，这种特性可用于精确调控目标蛋白的表达，使其在特定条件下高效表达。
三、毕赤酵母在重组蛋白生产中的劣势及解决策略
劣势
毕赤酵母的天然翻译后修饰与哺乳动物细胞不同，这可能导致生产出的重组蛋白在结构和功能上与在哺乳动物细胞中生产的蛋白存在差异，影响其在一些对蛋白修饰要求严格的应用中的效果，比如在生物制药领域，可能影响药物的药效学和药代动力学特性。
解决策略
菌株工程改造：通过基因工程手段对菌株进行改造，以绕过高等真核细胞和酵母之间在翻译后修饰方面的主要差异；改造N-糖基化途径：
①、改变糖基化类型：采用糖工程策略，将酵母中高糖基化的N-聚糖转变为人类双天线复合型N-聚糖。
②、应用特定菌株：例如SuperMan5HIS-、SuperMan5和SuperMan5（pep4-, prb1-）等毕赤酵母菌株被用于生产目标蛋白，这些菌株能使目标蛋白在N-连接位点具有甘露糖-5结构，更接近哺乳动物细胞中的糖基化模式。SuperMan5菌株可用于表达疫苗抗原，通过引入异源活性酶并添加N-乙酰葡萄糖胺，进一步改造为能产生类人糖蛋白的菌株。
四、毕赤酵母生产重组蛋白的典型工作流程
用毕赤酵母表达异源蛋白的典型工作流程如图2所示。
1、基因合成：构建目标蛋白的基因序列是生产重组蛋白的基础；
2、克隆和转化：使用大肠杆菌进行克隆和转化操作，将目标基因导入合适的载体中；
3、毕赤酵母电穿孔：在验证质粒中生成的构建体正确后，对毕赤酵母进行电穿孔，使含有目标基因的载体进入毕赤酵母细胞；
4、微尺度培养：从选择性琼脂板上挑取菌落，在96深孔板中进行微尺度培养，这种培养方式可以对大量的菌落进行初步筛选，评估其生长和生产蛋白质的能力；5、高通量筛选和评估：对微尺度培养后的菌株进行高通量筛选和生产力评估，筛选出生产能力较强的菌株；
6、实验室规模发酵：实验室规模发酵包括在3L、5L和10L等不同规模的实验室发酵罐中进行发酵，进一步优化发酵条件提高蛋白质的产量；
7、大规模发酵：在工业生产中会进行大规模的发酵，以满足大量生产重组蛋白的需求；
8、蛋白质后期处理、纯化：从发酵液中分离和纯化目标蛋白，去除杂质和其他不需要的成分；浓缩：提高蛋白质的浓度，以便后续的加工和应用；配方：根据蛋白质的用途和要求，进行配方调整；交付：将处理好的蛋白质产品交付给客户或用于进一步的研究和应用。
图2 毕赤酵母生产重组蛋白的一般工作流程
五、蛋白质分泌瓶颈及解决思路
分泌途径关键因素
基因和关键部分：在毕赤酵母基因组中，约10%的基因与分泌途径有关，包括与内质网、蛋白质折叠、糖基化、蛋白酶解加工、内质网相关降解途径、高尔基体 以及囊泡介导运输等相关的基因。基因工程的关键部分包括启动子、分泌信号、分泌机制和辅助因子以及蛋白酶敲除[3]。糖基化影响：N-和O-糖基化差异对生物制药生产尤为重要，影响蛋白质的药效学和药代动力学，在蛋白质折叠和质量控制过程中起关键作用。其他潜在瓶颈：包括未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response，UPR）途径和内质网相关降解（Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation，ERAD）途径以及蛋白质进入内质网的转运过程等。当内质网中出现错误折叠或未折叠蛋白质过载时，细胞会激活UPR途径，试图恢复细胞内稳态，而错误折叠的分泌蛋白可能会通过ERAD途径被降解。
解决思路
对分泌途径的研究和改造：深入了解分泌途径相关的机制对于提高蛋白质的分泌效率和产量至关重要。通过对毕赤酵母的工程改造，例如优化启动子、选择合适的分泌信号、敲除蛋白酶基因以及调节与分泌途径相关的基因表达等，可以提高重组蛋白的生产和分泌水平。关注关键环节和因素：重点关注内质网的蛋白质折叠和质量控制过程、糖基化过程以及蛋白质运输过程中的各个关键环节。例如确保蛋白质在进入内质网时具有合适的信号肽，以及在内质网中能够正确折叠和糖基化。同时注意避免蛋白质的错误折叠和降解，通过调节细胞内的环境和相关基因的表达，维持蛋白质分泌途径的顺畅。
图3 为提高蛋白质生产和分泌
对毕赤酵母进行工程改造
六、毕赤酵母合成重组蛋白的工业方法
毕赤酵母用于生产多种商业产品，包括临床候选药物、饲料和食品酶等，多种产品已获得美国食品药品监督管理局的批准或认可。其工业方法涉及克隆筛选和生产动力学两个关键环节。
克隆筛选
依赖于能确保所有评估的转化体平等生长和生产的培养环境。微规模培养可用于比较大量转化体的生长和生产力，这些实验的差异是由于整合构建体的数量和基因组位置不同，生产力评估对于选择在生物反应器中培养的菌株至关重要，以确定最佳生产克隆。
生产动力学
生产动力学与特定产物形成率和特定生物量增长率相关，是生物过程效率的关键因素，对不同发酵系统的比较也很重要。产品形成动力学受多种生理因素影响，反映了从生产到分泌过程中各步骤的平衡。细胞工厂在不同发酵模式下生产特定目标蛋白具有特定的动力学特征，研究这些特征有助于实现最佳生物过程生产。在生物过程开发中，生产力和产量之间的平衡至关重要。
通过对毕赤酵母进行多方面的工程改造，在重组蛋白的生产和分泌方面取得了显著的成果，为生物医药产业带来了巨大的发展机遇，同时也为进一步的研究和应用奠定了坚实的基础，未来随着科学技术的不断发展和创新，毕赤酵母在药物研发、生产和治疗等领域的应用将不断拓展。
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参考文献
[1] Gao, J., Jiang, L., Lian, J. (2021). Development of synthetic biology tools to engineer Pichia pastoris as a chassis for the production of natural products. Synth. Syst. Biotechnol. 6, 110–119.
[2] Karbalaei, M., Rezaee, S.A., Farsiani, H. (2020). Pichia pastoris: A highly successful expression system for optimal synthesis of heterologous proteins. J. Cell. Physiol. 235, 5867–5881.
[3] Cámara, E., Landes, N., Albiol, J., et al (2017). Increased dosage of AOX1 promoter-regulated expression cassettes leads to transcription attenuation of the methanol metabolism in Pichia pastoris. Sci. Rep. 7, srep44302.
