导读
血脑屏障(Blood Brain Barrier, BBB)是大脑中药物运输的最大障碍。目前，最常见的穿过血脑屏障的给药方式通常是鞘内注射和静脉注射。鞘内注射，通常会导致大脑中药物浓度升高，但具有更大组织损伤的风险。静脉注射，虽对组织损伤低，但是通常对靶器官组织中的药物浓度也较低。如今，微创甚至无创的诊疗方法受到了最多的关注。如何减少给药的损伤并使其高效通过BBB是研究的重点之一。
纳米抗体是源自骆驼科动物体内天然重链抗体。与普通抗体相比，纳米抗体具有低分子量、高亲和力和低免疫原性等优势。这些优势促使纳米抗体成为脑部疾病研究的有效工具。因此，关于纳米抗体诊断治疗的研究受到越来越多的关注。今天，我们将仔细讨论纳米抗体穿过血脑屏障的问题以及在脑相关疾病中的研究、诊断和治疗的应用。
一、纳米抗体的筛选与制备
目前，纳米抗体的筛选主要是通过构建噬菌库并从中筛选出高性能抗体来实现（图1）。为了构建免疫文库，将特异性抗原与标准佐剂混合注射到骆驼科动中。这些免疫通常在两个月内进行8次，相应的重链抗体经历成熟。然后收集外周血以获得淋巴细胞，分离淋巴细胞中的信使核糖核酸(Messenger RNA, mRNA)并反转录为互补脱氧核糖核酸(Complementary DNA, cDNA)。接下来，cDNA可以通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)扩增，克隆到噬菌体载体的表面蛋白基因，然后转移到宿主细胞，如大肠杆菌。因此，我们获得了一个包含所需重链抗体重链可变区(Variable Domain of Heavy Chain of Heavy Chain Antibody, VHH)基因片段(通常约106个个体转化子)的小型文库。为了选择与抗原高亲和力结合的VHH，子代噬菌体通常要经过2 – 3个循环的生物筛选，即在固定有抗原的微量滴定板上孵育。在清洗不需要的未固定在抗原上的噬菌体后，被选择的噬菌体被洗脱并用于重新感染宿主。最后，采用标准的酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA)分析单个克隆的抗原结合情况，并对相应基因进行测序，以完成纳米抗体的初筛。在已鉴定的纳米抗体中，根据所需的性质和应用，利用功能测定来选择先导化合物。
图1 利用M13噬菌体展示技术构建
免疫文库及筛选纳米抗体的方法
二、纳米抗体穿过血脑屏障的方式
胞吞作用
第一个被研究发现通过受体介导的胞吞作用(Receptor-Mediated Transcytosis, RMT)穿过血脑屏障的纳米抗体是FC5和FC44。FC5与脑微血管内皮细胞(Brain Microvascular Endothelial Cells, BMEC)的膜受体α (2，3)-唾液酸糖蛋白结合，从而触发蛋白介导的内吞作用；FC44与BMEC 上约36 kDa的蛋白结合，但其身份需要进一步研究。将FC5纳米抗体与人Fc片段融合，可以改善血清药代动力学，并增强化学偶联剂的药理作用。FC5与Fc的二价融合在脑上皮单层表现出显著增加胞吞作用的速率。
除此之外，靶向胰岛素样生长因子受体(Insulin-like Growth Factor-1 Receptor, IGF1R)和靶向转铁蛋白受体的纳米抗体也已被研究为递送大脑的工具。据报道，有限数量的纳米抗体通过选择性吸附介导的胞吞作用(Adsoptive-Mediated Transcytosis, AMT)的方式通过BBB。这些纳米抗体通常具有更高的等电点，例如靶向GFA P的纳米抗(pI=9.4)、靶向Aβ42的 R3QV (pI>8.3)和靶向磷酸化Tau蛋白(pI>9.5)的A2。
其他因素促进纳米抗体通过BBB
靶向谷胱甘肽的聚乙二醇化脂质体、多壁碳纳米管(Multi-walled Carbon Nanotubes, MWCNT)或Fe3O4纳米颗粒已知可以有效穿过BBB。除此之外，纳米抗体本身可用于改善大脑中脂质体的靶向性。值得注意的是，细胞穿透肽(Cell Penetrating Peptides, CPPS)也可能有助于增加纳米抗体渗透到大脑中。将纳米抗体与CPPS融合可以产生细胞渗透性，其可以通过非内吞递送进入活细胞。
通过物理和化学手段可以暂时增加BBB通透性，也可以提高纳米抗体通过BBB的能力。研究表明，动脉内给药可以增加大脑中纳米抗体的摄取。甘露醇作为一种高渗剂，还可以通过削弱BMEC的连接来提高几种纳米抗体融合分子穿过BBB的能力。在最近的一项研究中，发现超声和微泡(Ultrasound and Microbubbles, USMB)的组合可以通过体外上皮细胞屏障增强药物的通透性。USMB处理将上皮细胞对大分子量分子(4-20 kDa)的通透性提高了3 - 7倍，同时促进了相同分子的细胞内积累。USMB将抗CXCR4纳米抗体的细胞旁通透性提高了一倍，并将其与视网膜母细胞瘤细胞的结合增加了五倍，这表明可能是一种新的方法用来改善药物向受组织屏障保护的器官的递送。大脑温升高也是影响BBB结构稳定性的因素之一。当BBB被疾病破坏时，纳米抗体通过BBB的能力增强。这就是为什么许多关于疾病相关的纳米抗体研究表明，它们可以在BBB完整性受损的病理条件下自发进入大脑。
局部给药方式
纳米抗体不太常用的给药方法包括鼻内、鞘内/脑室内给药和其他局部给药方法。例如，据报道，脑室内注射抑制Aβ分泌酶1的纳米抗体可诱导转基因AD模型小鼠血液和大脑中Aβ载量的急性降低。鞘内给药引起的损伤比脑室内注射小，并且在中风和神经退行性疾病模型中已得到广泛研究，以在BBB中输送更多药物，也可能是未来在大脑中输送纳米抗体的一种有效方法。Pizzo等人分析了鞘内给药后IgG和纳米抗体如何以大小依赖性方式分布在整个大鼠大脑中。结果显示，两者都分布在大脑表面，并沿着所研究的所有类型的血管周围的血管周围空间扩散。对于较小的纳米抗体来说，进入脑部区域的百分比明显大于较大的IgG。
鼻内给药的药物可以通过嗅神经和三叉神经的细胞内或细胞旁通路穿过BBB，这对于不能穿过BBB的药物，这是一种很好的局部给药方法。值得注意的是，鼻内给药的抗肿瘤坏死蛋白(Transthyretin, TTR)的纳米抗体可以穿过BBB。然而，在这种情况下也出现了靶向介导的作用，野生型小鼠中，TTR的纳米抗体在受体介导的过程中被运动神经元特异性内化。而在TTR缺乏的小鼠中，纳米抗体则被所有细胞内化，用于溶酶体末期降解。
与基于蛋白质的方法完全不同，腺相关病毒载体的基因转移策略可以以一种更直接运输基因的方式将纳米抗体直接递送到中枢神经系统，因此具有长期效应。
图2 神经血管单位的结构和纳米抗体
血脑屏障递送的方法
三、纳米抗体在脑部疾病中的诊断治疗应用
阿尔兹海默症
目前，已有一些临床前影像学研究开始报道使用纳米抗体检测阿尔兹海默症(Alzheimer’s Disease, AD)相关生物标志物。例如， 99mTc标记靶向Aβ的纳米抗体pa2H在APP/PS1小鼠大脑中摄取量较小但显著增加。R3QV是一种结合于Aβ中心17 - 28位残基的纳米抗体，而纳米抗体A2则结合于pTau蛋白的C端，这两种纳米抗体均可穿过BBB。使用造影剂钆对R3QV进行位点特异性标记，以设计用于磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging, MRI)的成像探针。此外，钆基纳米颗粒也与放射性核(68Ga3+或111In3+)螯合或与近红外染料(如Cy5.5)共价结合，以便在体内使用。
值得注意的是，靶向Aβ寡聚体的纳米抗体(PrioAD12和PrioAD13)能检测视网膜中Aβ寡聚体的积累，而这些寡聚体起源于外周血，先于认知功能下降和低聚物在脑内沉积。这为通过“眼部检查”早期发现AD提供了一种思路。V31-1 纳米抗体可识别Aβ42的C端，并且在蛋白质印迹和斑点印迹分析中仅识别单体和寡聚物。同样，纳米抗体A4和E1对Aβ寡聚体表现出很强的亲和力。另一个纳米抗体B10对Aβ原纤维蛋白可识别，但未识别对Aβ1-40或Aβ寡聚体蛋白质片段识别较弱，表明其能识别构象表位。此外，Rutgers等人构建了8个靶向Aβ的纳米抗体(ni3A、ni8B、va2E、vaE2、va1G、pa4D、pa11E、pa2H)，其中pa4D、pa11E和pa2H 可以识别血管和实质沉积中的Aβ，而其他纳米抗体只能识别血管沉积中的Aβ，这表明血管和大脑中的Aβ表位可能存在差异。
除此之外，纳米抗体还研究治疗AD。纳米抗体A4、E1、V31-1可与Aβ寡聚体结合，抑制其聚集成Aβ原纤维，并阻断Aβ寡聚体诱导对SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞的神经毒性。
帕金森疾病
目前针对帕金森疾病(Parkinson’s Disease, PD)的纳米抗体主要靶向于α突触核蛋白，包括NbSyn2和NbSyn87，两者都作用于α突触核蛋白的C端，但NbSyn2作用的序列更靠近C端，对α突触核蛋白的聚集影响更小。就PD诊断而言，到目前为止，还没有任何用于诊断脑成像相关纳米抗体的研究。
关于PD的药物治疗，减少α突触核蛋白聚集的想法可以分为两种方式：一是抑制α突触核蛋白向原纤维的聚集，二是降解α突触核蛋白。研究表明，NbSyn2和NbSyn87均可在体外抑制α突触核蛋白原纤维的形成，它们的存在会降低毒性更大的福斯特共振能量转移(Forster Resonance Energy Transfer, FRET)的α突触核蛋白寡聚体，进而减少细胞死亡、小胶质细胞激活和其他损伤反应。此外，由于PD通常与富含亮氨酸重复序列激酶2(Leucine-Rich Rrepeat Kinase 2, LRRK2)的突变相关，从而增加其活性，因此针对LRRK2不同位点的多种纳米抗体已被开发为抑制剂。除了典型的PD相关分子外，一些疾病常见的损伤相关分子也可作为治疗或诊断靶点，如靶向caspase-3的纳米抗体、线粒体Rho GTPase 1 (Miro1)等。针对前者的纳米抗体可抵抗多种脑部疾病中氧化应激引起的细胞损伤，而后者与线粒体稳态相关，经纳米抗体可视化或调控后是潜在的生物标志物或治疗靶点。
脑瘤
3.3.1 胶质母细胞瘤(Glioblastoma, GB)
诊断方面，在胶质母细胞瘤(Glioblastoma, GB)细胞中过表达野生型和突变型EGFR双靶向纳米抗体用Cy5.5标记用于光学成像。最近的一项研究报道，用99mTc标记的抗SIRPα纳米抗体可以定性地显示颅内肿瘤。治疗方面，应用纳米抗体治疗GB的一个基本思想是拮抗神经胶质瘤进展中的关键抗原。Zottel A等人首先验证了GB的8种新型抗原，其中，Nb225和Nb7显示出良好的肿瘤抑制作用，对正常星形胶质细胞无伤害。作为替代方案，纳米抗体已被用作免疫毒素的靶向部分，为细胞毒性部分发挥作用奠定了基础。一些研究使用二价抗EGFR纳米抗体与假单胞菌外毒素偶联，通过促凋亡肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体增强对GB肿瘤细胞和肿瘤干细胞的杀伤能力。
3.3.2 脑转移
与纳米抗体治疗GB的研究相比，在脑转移(Brain metastases, BM)方面使用纳米抗体的研究相对成熟。18F标记的2Rs15d纳米抗体静脉注射到携带颅内HER2表达的BT474M1肿瘤的小鼠体内，通过PET成功地显示了HER2阳性的脑肿瘤，除肾之外的主要器官的肿瘤与组织的比值大于 10:1。当放射性核素111In标记后，在携带SKOV3的小鼠颅内也观察到类似的结果。此外，放射性核素标记的2Rs15d显示出一定的治疗潜力，抗PDL1纳米抗体也可以有效地用作纳米载体的靶向配体。
其他脑部疾病
在狂犬病方面，已经开发了多种具有高亲和力和低成本的纳米抗体。例如，纳米抗体与源自人软骨寡聚体基质蛋的螺旋螺旋肽连接，形成均相五价多聚体，称为共聚体26424和26434]或双特异性纳米抗体，可以靶向白蛋白以增加血液半衰期，然后将其与暴露后疫苗预防相结合。在朊病毒病领域应用研究纳米抗体主要集中在研究分子相互作用和开发潜在的治疗方法上。除此之外，纳米抗体也可以在亨廷顿病中发挥有益的作用。2015年，第一个靶向亨廷顿蛋白N末端结构域的纳米抗体被开发出来，据报道，它对人突变体和野生型亨廷顿蛋白具有良好的亲和力。
纳米抗体作为分子量小、亲和力高、免疫原性的分子，可以应用于广泛的领域，与普通全尺寸抗体相比，还具有特定的优势。对于脑相关研究，纳米抗体可用于开发针对特定靶点的多种显微镜成像示踪剂还可以作为特定基因遗传调节因子中的连接分子。此外，纳米抗体还可用作微悬臂传感和有机晶体中的示踪剂，用于疾病的早期检测或病原体检测。同时，与单克隆抗体相比，纳米抗体的生产成本较低，因此适用于生产体外诊断试剂盒。目前，用于检测脑疾病的高灵敏度检测装置的研发仍处于相对早期的阶段，值得进一步研究。但使用纳米抗体的生物传感器明确显示出未来快速、低成本和大规模筛查AD等脑部疾病的潜力。总体来看，纳米抗体在脑疾病领域的应用仍有许多创新有待探索。
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