重组蛋白折叠的细胞机制与应对策略

在细菌细胞中，尽管存在维持细胞内环境稳定的机制，但当表达重组蛋白时，由于其天然宿主与异源宿主的生长环境差异，温度、pH值和氧化还原条件的变化仍可能导致蛋白质折叠异常。

温度对蛋白质折叠的影响是多方面的，较高温度会增加重组蛋白在大肠杆菌中生产时错误折叠和聚集的风险，导致包涵体的形成[1]。相反，低温可以增加聚集蛋白中功能性蛋白的含量，但过低温度（低于0°C）可能导致冷变性。而pH值主要通过改变氨基酸残基的质子化状态影响蛋白质折叠，进而影响带电相互作用，如盐桥的形成。细菌通常将细胞内pH维持在相对稳定的范围，但细胞外蛋白质仍可能受到环境pH变化的影响。此外，氧化应激也是一个重要因素，活性氧物质的存在可氧化半胱氨酸残基，形成非天然二硫键，导致蛋白质错误折叠和聚集。这在表达来自厌氧生物的蛋白质时尤为重要，因为这些蛋白质对氧气更为敏感，更容易受到氧化应激的影响。

细菌细胞中的许多分子伴侣属于热休克蛋白（Heat shock proteins，Hsp）家族，根据其分子量大小可分为Hsp60、Hsp70、Hsp90等不同家族。如表1所示，分子伴侣如GroEL-GroES系统和DnaK-DnaJ-GrpE系统，在蛋白质折叠过程中发挥着关键作用。GroEL形成由两个七聚体环堆叠而成的蛋白质复合物，中间形成一个空腔，可容纳底物蛋白。GroES作为其辅助分子伴侣，可封闭GroEL空腔，为蛋白折叠提供一个隔离的环境。DnaK通过与底物蛋白的疏水区域结合，以ATP依赖的方式防止蛋白聚集，并协助其折叠。除了上述主要的分子伴侣外，细菌还含有其他一些分子伴侣，如触发因子、ClpB、HtpG和IbpA/IbpB等。

细菌中的蛋白质质量控制还涉及多种蛋白酶，如ClpAP、ClpXP和Lon等，负责降解错误折叠或聚集的蛋白质。ClpP是一种蛋白酶，需要ATP依赖的伴侣蛋白ClpA和/或ClpXP来识别并降解被标记的蛋白质。Lon蛋白酶则能识别并降解许多不稳定的调节蛋白和聚集倾向的错误折叠蛋白。图1显示了重组蛋白可以采取的不同途径，以及伴侣蛋白和蛋白酶在哪里作用于它。

真核生物具有多个分子伴侣家族，如TRiC、Hsp70和Hsp90等，它们分布在不同的细胞器中，协同作用以确保蛋白质的正确折叠。TRiC复合物在细胞质中发挥作用，其独特的结构使其能够容纳较大的蛋白质底物，HspB1-10相互形成同源二聚体、同源寡聚体和不同的异源寡聚体（表2）[2]。真核生物的内质网中也存在专门的分子伴侣系统， 包括BiP（Hsp70家族）、GRP94（Hsp90家族）、钙连蛋白和钙网蛋白等。此外，真核细胞中的线粒体和叶绿体等细胞器也具有自己的分子伴侣系统，如Hsp60-Hsp10、Ssc1-Mdj1-Mge1等。

真核生物的蛋白质质量控制主要通过泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin proteasome system，UPS）实现，这一系统涉及众多的泛素E3连接酶，它们能够识别并标记需要降解的蛋白质，随后通过蛋白酶体将其降解。在翻译过程中，真核生物也具有核糖体相关蛋白质量控制机制，当核糖体在翻译过程中遇到停滞或异常情况时，会触发一系列反应，导致不完全的新生链被降解。

原核生物的GroEL-GroES系统和真核生物的TRiC系统在结构和功能上存在显著差异（图2A）。GroEL的环结构为同聚七聚体，而TRiC的环结构为异聚八聚体，且TRiC能够容纳更大的底物蛋白，这些差异可能导致重组蛋白在原核和真核宿主中的折叠方式不同。虽然Hsp70家族分子伴侣在原核和真核生物中的机制和结构域相对保守，但在底物结合特异性和细胞内变构调节方面存在差异（图2B、C），这可能影响它们与重组蛋白的相互作用，从而影响重组蛋白的折叠效率和准确性。

重组蛋白在原核和真核宿主中的降解方式不同，原核生物主要通过几种特定的蛋白酶系统直接识别和降解错误折叠的蛋白质，而真核生物则依赖泛素化修饰来标记底物蛋白，然后通过UPS进行降解[3]。此外，如图3所示，原核生物的蛋白质质量控制主要识别富含疏水残基的非特异性序列以及少数特定的N-端和C-端降解信号，而真核生物能够通过多种N-degron途径识别几乎任何N -端残基作为降解信号，并且还能识别一些C-degron。

糖基化是一种常见的翻译后修饰（Post-translational modification，PTM），在真核生物中，N-糖基化可引导蛋白质进入钙连蛋白/钙网蛋白结合和质量控制循环，影响蛋白质折叠过程本身。然而，常用的细菌宿主如大肠杆菌通常不进行N-糖基化，限制了其在生产糖基化生物制药中的应用。

二硫键的形成对于许多蛋白质的结构和功能至关重要，它可以稳定蛋白质的三级结构，防止蛋白错误折叠和聚集。在真核生物中，氧化蛋白折叠发生在内质网中，由PDI家族的硫醇-二硫键氧化还原酶催化；而在革兰氏阴性细菌如大肠杆菌中，氧化折叠发生在周质中，由Dsb家族的蛋白质催化。除了糖基化和二硫键形成外，其他翻译后修饰如脂质修饰（N-肉豆蔻酰化、S-酰化）和赖氨酸甲基化等也对蛋白折叠和稳定性产生影响。

翻译延伸速度并非恒定不变，而是受到多种因素的调控。其中，密码子使用偏好是一个关键因素[4]，不同的密码子在细胞内对应着不同丰度的tRNA，稀有密码子的使用会导致翻译速度减慢。

在翻译过程中，蛋白质折叠与核糖体的运动同步进行，这一过程被称为共翻译折叠。新生肽链从核糖体中延伸出来后，会立即开始折叠，部分结构域甚至在核糖体内部就已开始形成。同时，蛋白质复合物的组装也可能在翻译过程中同时发生，这种共翻译组装方式有助于确保复合物中各亚基的正确折叠和相互作用。

优化密码子使用和添加溶解度标签（图4A）：现代的密码子优化策略更加注重平衡翻译效率和蛋白质折叠的需求，例如通过模拟天然宿主的密码子使用模式来优化基因序列[5]。添加溶解度标签也是提高重组蛋白可溶性表达的有效方法（表3），例如麦芽糖结合蛋白、小泛素样修饰蛋白等，其作用机制包括阻止聚集、促进结合伴侣蛋白等，但标签的选择和后续处理仍需进一步优化。

工程改造生产菌株（图4B）：通过过表达或共表达特定的分子伴侣，可以增强细胞内蛋白质折叠的能力，减少包涵体的形成（表4），还可对菌株进行改造以引入特定的PTM途径。但在实际应用中需要考虑异源分子伴侣的功能性表达、与宿主蛋白的兼容性以及对细胞代谢的影响等。

蛋白质工程改造（图4C）：基于进化（如噬菌体辅助连续进化、定向进化）和理性设计（如利用计算生物学和生物物理学方法预测稳定突变）的方法可用于改造蛋白质本身，以提高其折叠和合成效率。这些方法在提高蛋白稳定性和活性方面已显示出一定潜力，但仍有待进一步发展和完善。

重组蛋白在细菌细胞工厂中的折叠是一个复杂而精细的过程，受到多种细胞机制的调控。深入理解这些机制，包括物理化学因素、分子伴侣、蛋白质质量控制、翻译后修饰以及翻译过程中的动态事件，为我们设计有效的工程策略提供了理论基础。通过优化密码子使用、融合标签、菌株工程和蛋白质工程等多种手段，我们在改善重组蛋白折叠和功能性表达方面取得了显著进展。然而，仍然存在许多挑战，如更精确地预测蛋白质 - 分子伴侣相互作用、提高工程策略的通用性和效率等。未来的研究需要进一步整合细胞机制的知识与工程技术的创新，以实现更高效、更可控的重组蛋白生产，推动生物技术在医药、工业和其他领域的持续发展。