HIV-1 Gag病毒样颗粒下游纯化工艺

通过沉降去除细胞后，澄清是改进后续纯化步骤的关键。文中评价了两种深层过滤器对Gag VLPs的回收和富集，以及主要蛋白质和dsDNA污染物的减少。两种情况的动态光散射（Dynamic Light Scattering，DLS）曲线趋势相同，Supracap™ 50 V100深层过滤器的峰值略高，因为Gag VLPs的损失较低（图1a）。右图所见上清液的较小峰可能是由于细胞碎片或聚集体通过澄清而减少。电泳证实存在大于75 kDa的条带（Gag-eGFP的分子量约为88 kDa），通过蛋白质印迹（Western Blot）证实为Gag-eGFP，或游离单体或VLPs的一部分（图1b）。结果表明使用Supracap™ 50 V100深层过滤器可获得更高的回收率和纯度。

如果要使用先前冷冻的样品并且在其解冻过程中出现沉淀物和/或聚集体，则需进行二次澄清。因此对纯化工艺中需要二次澄清的，评价了两种不同的过滤器（Sartopore® SartoScale 25 PP 3和Supor® EAV-Mini Kleenpak™ 20过滤器）。图2a显示了两种澄清材料的DLS结果曲线相似。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-Polyacrylamide Gel Eelectrophoresis，SDS-PAGE）和Western Blot证实了Gag-eGFP的存在，其符合预期的分子大小（图2b）。二次澄清中Gag VLPs的零富集可能是因为常规过滤对于总纳米颗粒来说并不能富集Gag VLPs，因为大颗粒已经通过深层过滤去除。此外，尽管两种过滤器均降低了dsDNA量，但Supor® EAV-Mini Kleenpak™ 20过滤器对dsDNA和某些蛋白质具有一定的选择性，其降低量高于Sartopore® SartoScale 25 PP 3过滤器。研究表明使用Supracap™ 50 V100深层过滤器获得了初步澄清的最佳结果。对于二次澄清，如有需要，Supor® EAV-Mini Kleenpak™ 20过滤器是最佳选择。

通常在纯化工艺中澄清的下一步骤为浓缩，通过切向流过滤（Tangential Flow Filtration，TFF）和多模式色谱（Multimodal Chromatography，MC）的超滤被广泛使用。本研究评价了TFF使用的一种孔径300 kDa的聚醚砜（Polyethersulfone，PES）膜。所有Gag VLPs均被回收并浓缩了10倍，同时存在一些聚集体，并且粒度发生变化，如DLS图谱所示（图3a）。然而，将该样品稀释并通过纳米颗粒跟踪分析技术（Nanoparticle Tracking Analysis，NTA）分析时，也观察到聚集体的存在，但Gag VLPs的粒径为146 nm，与这些纳米颗粒的预期结果相对应。图4f所示在渗余物中可以看到大于75 kDa的条带，而在渗透物中没有出现，通过蛋白印迹证实该条带为Gag-eGFP（图3b）。据报道，采用omega PES膜的T系列盒式膜，可以去除80%以上的蛋白质，同时VLPs回收率约60%-80%。在这种情况下，建议使用TFF模式的超滤/渗滤浓缩Gag-eGFP VLPs作为DSP的中间步骤。

此外，文中也对HiScreen Capto Core 700色谱柱进行了评价。通过DLS观察到较窄的曲线，多分散系数（Polydispersity Index，PDI）和水力学直径（Hydrodynamic Diameter，MHD较低，表明馏分中存在较少的聚集体，随后通过蛋白质印迹证实其为Gag-eGFP（图3）。对于HIV-1 Gag VLPs目前已报道的最大回收率为73.1%，与本次研究的结果接近。 

捕获步骤的评价包括6种不同的色谱方法：3种离子交换色谱，1种疏水相互作用色谱，2种肝素亲和色谱。在多种色谱技术中，离子交换色谱（Ion Exchange Chromatography，IEC）已广泛用于纯化VLPs。本次测试了三个IEC色谱柱：Monolith QA、Mustang Q和Capto Q ImpRes。结果表明，使用Monolith QA色谱柱可以分离出主要杂质，包括宿主细胞蛋白和DNA。在主要洗脱馏分中Gag VLPs的回收率小于50%。而Mustang Q的产量与之前报道的结果相比有所提高，可能的原因是上样样品之前已经使用两种过滤器（Supracap™ 50 V100和Supor® EAV-Mini Kleenpak）进行了澄清，这使得膜的性能更好，尽可能减少了样品中的沉淀物，并避免了系统超压。Capto Q ImpRes的回收率最高，不仅可以从宿主细胞蛋白和dsDNA中分离Gag VLPs，而且还可以富集总纳米颗粒，因此可使用强季胺离子交换剂来浓缩和纯化HIV-1 VLPs；同时对捕获步骤中使用羟基官能化聚甲基丙烯酸酯进行测试。测试的两种功能化单体中，QA单体结果最好，表明QA配体提供的离子交换原理与OH配体提供的疏水交换相比，可以更好地回收Gag VLPs；肝素亲和层析在纯化VLPs具有较大潜力，本文测试了Capto肝素柱和POROS肝素柱。POROS肝素捕获Gag VLPs的能力更高，可以有效地将Gag VLPs与样品中的其他纳米颗粒分离。DLS分析的PDI和MHD在所有捕获色谱评估中非常相似（图4a），通过SDS-PAGE观察到预期大小的条带，蛋白质印迹证实为Gag-eGFP（图4b）。

考虑到初始样品的不同，主要的评价标准是基于Gag VLPs的回收率，考虑每种情况下负载和洗脱柱/膜的Gag VLPs总量/mL。根据获得的结果，Capto Q ImpRes色谱柱可以更好地回收目标产物，且污染物含量更低。结合实验结果与Gag VLPs的分子特性，该色谱柱为捕获和纯化Gag VLPs的最佳选择。

精纯是获得最终临床级材料的关键步骤。使用两种不同的柱（HiTrap® Sephadex G-25柱和XK 16/40 Sepharose 4FF柱）评估尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography，SEC），在SEC中，Gag VLPs在空隙体积（Void Volume，VV）中洗脱，PDI和MHD非常相似。此外通过电泳和蛋白印迹观察到大于75 kDa的条带（图5b）。与Sephadex G-25色谱柱相比，Sepharose 4 FF的结果更好，可能的原因是使用不同的树脂及色谱柱尺寸的差异。

为了最终验证该工艺，通过完整的纯化流程对从生产批次中提取的100mL样品进行处理，使用在每个步骤性能最好的技术。首先使用Supracap™ 50 V100深层过滤器进行澄清。无需进行二次澄清，因为第一次过滤后浊度值可接受，排除了大聚集体和沉淀物的存在；样品无需浓缩，使用HiScreen Capto Q ImpRes色谱柱进行捕获；IEC后用XK 16/40 Sepharose 4FF柱进行电泳。

图6显示了每一步获得的Gag VLPs的分子特征。与样品中存在的其他纳米颗粒相比，最终浓缩和纯化的Gag VLPs在低温透射电镜显微镜下可以清楚的观察到，Gag VLPs为被脂质膜包围的球形电致密纳米颗粒（图6a）。另一方面，如SDS-PAGE中所示随着过程的进行，Gag-GFPs被浓缩，并且其他污染蛋白被去除。在所有步骤中，通过Western blot证实了Gag-eGFP的存在（图6b）。此外观察到峰随着样品上清液纯度的增加而变窄（图6c）。

本研究对HIV-1 Gag-eGFP纯化工艺进行设计，并比较了每个步骤中的不同操作。在初步澄清中，通过深层过滤将上清液中的HIV-1 Gag-eGFP VLPs与大多数细胞聚集体和碎片分离，而不会导致VLPs的显著损失。其通过过滤的二次澄清进行精纯，并且dsDNA含量降低。TFF可进一步浓缩，并去除超过85%的dsDNA和总蛋白质含量。Capto Q ImpRes IEC在捕获和纯化VLPs的所有测试色谱中结果最佳。最后使用S4 FF SEC进行脱盐和缓冲液交换可获得更高的纯度。该工艺显示，总蛋白中Gag-eGFP VLPs的总回收率为38%，且上清液中dsDNA的去除率几乎为100%。

根据疫苗种类及最终应用需求和纯化水平，可以采用不同的下游处理技术。总体而言，本文研究的DSP操作和分析工具适用于大规模生产，该DSP生物工艺可作为HIV-1 Gag VLPs纯化的平台。