导读
自19世纪末抗体被发现以来，人类在生物医学领域对其研究一直不断深入。传统的IgG抗体，通常由两条重链和两条轻链构成，虽然具备优异的特异性和亲和力，但由于其体积较大且结构复杂，在某些特定应用中有所限制。1989年，布鲁塞尔自由大学的Raymond Hamers教授意外发现了一种新型抗体，这些抗体来自感染锥虫的骆驼体内。与传统抗体不同，这些抗体不含轻链，仅由两条重链构成，每条重链上拥有一个独特的可变抗原结合结构域。这一发现标志着纳米抗体（Nanobodies, Nbs）的诞生，并开创了抗体研究的新领域。
纳米抗体体积极小，结构简单，能够有效穿透复杂的生物环境，在肿瘤诊断、治疗和药物递送等方面发挥重要作用。纳米抗体的出现正在生物医学领域引发深刻变革，极大地推动了精准医学的发展。
一、纳米抗体的分子结构
传统的IgG抗体由四条链组成：两条重链和两条轻链。每条重链含一个可变区（VH）和三个恒定区（CH1、CH2、CH3），每条轻链则包含一个可变区（VL）和一个恒定区（CL）。这些链通过二硫键相互连接，形成一个Y字形结构。相比之下，Nbs由于缺失了CH1结构域和轻链，其分子质量显著降低。尽管结构简化，Nbs仍由四个骨架区（Framework Regions, FR）和三个负责决定抗原特异性的互补决定区（Complementarity-determining Regions, CDR）组成，且仅凭三个CDRs即可有效结合抗原。这一特性得益于CDR1的结构变异和CDR3的长度增加，其中CDR3区还形成一个大的暴露的凸环，这与传统抗体的凹形或平形结合位点不同，从而能够接触传统抗体难以结合的抗原表位。此外，Nbs的FR2区含有亲水氨基酸，提高了其水溶性和稳定性。
图1 IgG抗体、HCAb和Nbs的结构差异
二、纳米抗体的优势及局限性
Nbs相较于传统单克隆抗体具有多种独特优势。首先，Nbs体积小，使其能够有效穿透传统抗体难以到达的肿瘤组织和生物屏障，尤其是血脑屏障。同时，Nbs的分子量较小，免疫原性较低，从而降低了副作用的风险。此外，Nbs中CDR3区域形成的凸形结构，使其能够结合传统抗体难以接触的抗原凹陷部位。Nbs还具有优异的稳定性和可溶性，能够耐受高温和极端pH值，这使得它们在长期储存和运输过程中能够保持活性。最后，Nbs的生产和纯化过程较为简便，可以通过原核或真核表达系统进行生产，这使得它们适合大规模工业化生产，从而显著降低了生产成本。
然而，Nbs也存在一些局限性。首先，为了增强其治疗和诊断能力，Nbs的单价形式通常需要改造为多价形式，这增加了生产的复杂性。其次，由于Nbs体积较小，它们在血清中的持久性较低，容易被肾脏清除。第三，Nbs缺乏Fc区，因此不能发挥相关的效应功能。此外，Nbs的生产通常依赖骆驼源，其在人体内是否引发免疫应答尚不确定。
三、纳米抗体的产生和生产
产生
Nbs可以从三种不同来源中筛选：免疫文库、天然抗体文库和合成抗体文库。免疫文库通常通过对驯化动物（如羊驼或单峰骆驼）进行目标抗原免疫获得。这些动物在两个月内接受多次免疫后，从其血液中纯化出淋巴细胞，进行mRNA提取和cDNA转化，然后使用两步PCR方法扩增和筛选目标Nbs序列，最后将其克隆到表达系统（如大肠杆菌）中进行生产[1]。
如果不希望进行免疫，则可以构建天然抗体文库或合成抗体文库。在这种情况下，需要从多个未免疫的动物中收集血液来建立文库，以满足所需的规模。合成抗体文库的优势在于能够生成针对非免疫原性或毒性抗原的Nbs，并且避免了与骆驼免疫接种相关的伦理问题。
图2 生成抗原特异性Nbs的方法
选择与提取
纳米抗体库的筛选与鉴定流程主要包括噬菌体展示、固相筛选、验证和亲和力评估等步骤。利用M13噬菌体感染纳米抗体文库细胞，得到大量的纳米抗体展示噬菌体。将固定有目标抗原的微滴板与噬菌体共孵育，通过pH冲击或其他洗脱方法洗脱阳性结合物。将多轮筛选出的噬菌体转染到新的大肠杆菌细胞中，使用抗生素作为选择标记进行扩增培养。通过酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA）验证纳米抗体的特异性结合能力。对验证过的阳性结合物进行测序，确定纳米抗体的核苷酸序列。采用表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）技术，筛选亲和力最高的纳米抗体。将含有最终序列的大肠杆菌用甘油进行保菌，以便后续研究和应用。
除了上述方法外，还可以使用其他几种选择系统，如核糖体展示、细菌展示和酵母展示。这些方法可以避免M13噬菌体“粘附”到微孔板上，从而提高选择的准确性和效率。
表达和纯化
Nbs的标准生产通常采用大肠杆菌表达系统。首先，将含有Nbs的大肠杆菌甘油接种至LB培养基，过夜培养后转至TB培养基中进一步培养。当培养物光密度达到0.6–0.8时，添加1 mM IPTG诱导Nbs表达，并继续过夜培养。随后，通过离心收集细胞，加入适当的缓冲液进行渗透裂解，离心收集上清液[2, 3]。纯化过程中，使用IMAC靶向与Nbs初级序列相连的his6标签进行。最终通过SDS-PAGE、western blotting和差示扫描荧光法等方法对获得的Nbs蛋白进行验证和质量控制。
图3 Nbs的表达和纯化过程
四、纳米抗体的诊断应用
免疫测定
Nbs因其对目标抗原的高度特异性和亲和力，以及相较于传统抗体更高的稳定性，被应用于侧流免疫层析技术（Lateral Flow Immunoassays, LFIA）中，显著提升了检测的准确性和可靠性，并扩大了LFIA的应用范围，同时满足ASSURED标准的所有要求。基于纳米抗体的夹心式LFIA已成功应用于激酶、病毒、分子等的检测，展现出广泛的应用潜力。此外，ELISA作为一种实验室诊断方法，与纳米抗体结合形成的夹心式ELISA也已被成功开发，用于癌症生物标志物、环境和食品中毒素以及食品安全相关细菌的检测。
生物传感器
Nbs因其小尺寸、高稳定性、强抗原亲和力等优势，成为生物传感器开发的理想选择。它们能耐受高温和pH变化，适用于不理想环境的储存。纳米抗体生物传感器已应用于检测心血管疾病的生物标志物纤维蛋白原，检测限低且功能得到验证。此外，纳米抗体还被用于开发检测SARS-CoV-2和中东呼吸综合症冠状病毒刺突蛋白的生物传感器，展现出抗击COVID-19的潜力。
体内诊断
纳米抗体因其体积小、穿透力强、易于修饰和快速排除等特性，在开发体内诊断用的荧光或放射性靶向探针方面展现出巨大潜力。光学成像技术利用荧光标记，虽然穿透深度不如核成像，但因使用非电离辐射，更安全且成本较低。核成像如PET/SPECT则因其定量和高穿透能力而具优势，研究显示纳米抗体在这些技术中表现出高对比度和低辐射负担，适用于多种癌症和其他疾病的检测，展示了广阔的应用前景。
五、纳米抗体的治疗应用
癌症的治疗
纳米抗体在癌症治疗中展现了显著的潜力，主要体现在其优异的肿瘤穿透能力和对特定抗原的精准识别上。一种方法是开发表达靶向肿瘤抗原的纳米抗体的嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor, CAR）T细胞，并将其重新注入患者体内，以结合并中和肿瘤细胞，目前已有相关产品获得FDA批准用于多发性骨髓瘤治疗[4]。另一种方法是利用多价纳米抗体直接诱导肿瘤细胞程序性死亡，展现出显著的抗肿瘤效果。此外，纳米抗体在免疫检查点阻断、毒素偶联以及放射性核素治疗等领域也表现出了广泛的应用潜力。
自身免疫性疾病的治疗
纳米抗体在治疗自身免疫疾病领域取得了显著进展。2018年，Caplacizumab获得欧盟批准用于治疗获得性血栓性血小板减少性紫癜，随后2019年也获FDA批准。Ozoralizumab是另一种获得批准的纳米抗体药物，用于治疗类风湿关节炎。此外，还有多款纳米抗体药物如Vobarilizumab、Sonelokimab、Gefurulimab等，分别针对类风湿关节炎、银屑病、重症肌无力等自身免疫疾病，正处于不同的临床试验阶段。
表1 部分纳米抗体药物
传染病的治疗
针对传染病的治疗性纳米抗体相对较少。已有一些针对轮状病毒和呼吸道合胞病毒的纳米抗体，但前者自2013年无更新，后者在二期试验中效果不显著。尽管治疗性纳米抗体在传染病领域仍处于初期阶段，但在应对SARS-CoV-2、流感H7N9病毒及细菌毒素等方面显示了潜力。此外，在抗锥虫、疟原虫等方面，纳米抗体也显示了一定的治疗效果。
纳米抗体，作为一种新型的抗体分子，以其独特的结构和卓越的性能，在疾病治疗、诊断以及肿瘤的靶向诊断和治疗等方面展现出了巨大的潜力。其小巧的体积、高稳定性以及强大的组织穿透能力，使其在众多生物疗法中脱颖而出，成为研究的热点。当前，纳米抗体的研究已取得了诸多突破，包括在癌症免疫疗法、传染病防控及精准医学中应用初见成效。同时，纳米抗体药物Caplacizumab和Ozoralizumab的成功上市，不仅验证了纳米抗体技术的可行性和有效性，也为后续更多纳米抗体药物的研发提供了宝贵的经验和信心。然而，尽管纳米抗体的优势明显，仍面临诸如生产成本、长期稳定性及体内代谢等挑战。我们有理由相信，随着技术的不断进步和创新，纳米抗体的制备工艺将更加完善，其应用场景也将进一步拓展。
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参考文献
[1]SERGE M J F J. A guide to: generation and design of nanobodies [J]. FEBS J, 2021, 288: 2084-2102.
[2]ELS P, TOON L, SARAH T, et al. A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology [J]. Nat Protoc, 2014, 9: 674-93.
[3]KARIUKI C, MAGEZ S J P E, PURIFICATION. Improving the yield of recalcitrant Nanobodies® by simple modifications to the standard protocol [J]. Protein Expr Purif, 2021, 185: 105906.
[4]MULLARD A J N R D D. FDA approves second BCMA-targeted CAR-T cell therapy [J]. .Nat Rev Drug Discov, 2022, 21: 249.
