导读
一般来说，一种有效的人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus, HIV）疫苗应能够诱导产生广泛中和抗体(Broadly Neutralizing Antibodies，bNAbs)。由于大多数抗体在体内需要较长时间的体细胞成熟，多个研究小组正在开发基于HIV包膜糖蛋白(Envelope glycoprotein，Env)的免疫原，但这类免疫原需要复杂且漫长的免疫程序，这在普通人群中实施起来较为困难。西班牙国家微生物学中心的研究人员曾在ASM Journals上发表题为《Potent Induction of Envelope-Specific Antibody Responses by Virus-Like Particle Immunogens Based on HIV-1 Envelopes from Patients with Early Broadly Neutralizing Responses》的文章。文章展示了用两名在HIV感染早期表现出广泛中和反应个体的新包膜，由病毒样颗粒（Virus-Like Particle，VLP）制备，对兔子进行免疫，能够在短期免疫后诱导产生特异性的HIV-1抗体。这一证据为使用基于早期广泛中和反应个体的HIV包膜序列作为疫苗原型，并通过经典疫苗接种方案生成保护性免疫反应提供了基础。
今天，带大家详细解读这篇文献。
一、疫苗与广泛中和抗体
在HIV感染中，Env是诱导中和抗体产生的关键。然而，HIV EnV通过高变异性、糖基化修饰以及空间位阻等多种机制演化以逃避免疫识别。因此，用重组gp120进行免疫接种未能有效诱导针对不同HIV分离株的中和抗体。早期研究发现，10%至25%的HIV-1感染者展示了广谱中和活性，但有效疫苗开发仍面临挑战。精英中和者的抗体已被详细研究，新型bNAbs和相应表位的识别推动了疫苗免疫原设计的进展。基于VLP的HIV Env能够提供多价展示，提高免疫原性，已经在其他纳米颗粒疫苗中获得验证。有研究者开发了基于精英中和者包膜的免疫原，并表现出诱导广谱中和反应的能力，由于这些HIV Env免疫原主要基于慢性感染患者的包膜，而在感染后期诱导重建广谱中和反应的包膜结构将需要复杂且冗长的免疫策略，这在普通人群中实施起来十分困难。研究者提出了假设，即基于早期感染者包膜序列的免疫原可以用来触发bNAbs，并在动物模型中进行了测试。研究人员在VLP设计中整合了一种经过优化的HIV Gag蛋白变体，并组装成类似于HIV病毒颗粒的结构，以增强T细胞免疫反应。这些研究为HIV疫苗的有效开发提供了新的方向。
二、早期感染（100天内）具有广谱中和反应的个体特征
研究对象包括了88名的早期感染（100天内）者，基于血清交叉中和能力，选择5名中和广度较优的个体，进行了详细研究。这5名个体的血清在1:200稀释度下对病毒株的中和活性超过50%（表1），血浆50%感染剂量(50% infective dose，ID50)如表2所示，DET 887和DET 936两名参与者分别在96 dpi和82 dpi中和了四种亚型病毒。结果表明，在HIV-1感染的早期阶段，免疫系统能够在短时间内对不同HIV-1亚型产生bNAbs。
表1 近期感染者中具有广泛中和
活性个体的血清中和数据及对应日期a
a1:200 血清稀释度下的中和百分比。白框表示中和活性＜50%，黄框表示中和活性≥25%且＜50%，橙框表示中和活性≥50%且＜75%，红框表示中和活性≥75%。
表2 具有广泛中和活性
早期感染者的血浆中和数据a
a白框表示ID50＜20，黄框表示ID50≥20且＜100，橙框表示ID50≥100且＜200，红框表示ID50≥300。
三、 表位图谱
研究人员对5名早期感染样本进行分析，通过比较样本血浆对JRCSF.N160K突变株和野生型JRCSF的中和能力发现，其对JRCSF.N160K的中和能力下降，这表明bNAbs中存在针对V2糖基的中和抗体（图1C）；在DET 902样本中检测到针对CD4bs的抗体（图1A）；5名个体中均未检测到针对V3糖基依赖性或近膜端外部区域（membrane-proximal external region，MPER）依赖性表位的抗体（图1B和1C），以上发现早期感染者体内的bNAbs与病毒的不同区域相互作用。
图1 5个早期中和者的血清表位图谱
四、产生bNAbs的HIV-1早期感染者的病毒包膜特征
对5名早期感染者的样本进行env基因序列测定，通过比较C2-V5区域的病毒序列特征发现，尽管感染时间较短，DET 887和DET 936仍表现出较高的病毒多样性（图2）。
图2 血浆中循环病毒的序列
系统进化分析（C2-V5区域）
可变环长度分析发现，唯一相关差异是DET 936的V1-V2环为82个氨基酸，比慢性和近期感染个体的440个B亚型序列平均长度长12个氨基酸；潜在糖基化位点（Potential N-linked Glycosylation，PNG）的分析显示DET 887、902和936的NXS/PNGS和NXS/NXT比例低于慢性和近期感染个体的平均水平，且在332位点缺少一个PNG（表3），广谱中和反应的发展可能与HIV-1 Env上的“糖盾”(glycan shield) 完整性相关。
表3 病毒env基因的可变环长度和PNGS
研究人员对三组不同感染时期患者的HIV-1 Env“糖盾”完整性进行分析，发现DET 887、DET 892、DET 902和DET 936包膜中糖基孔（glycan hole）的平均大小较小，DET 763比其他包膜的糖基缺口大2倍（图3A和C）；研究人员还分析了高可变环区（hypervariable loops）中的PNGS对三组个体包膜上“糖盾”的贡献，发现早期感染病毒与近期和慢性感染病毒在高可变环区的PNGS频率没有显著差异（图3B）。早期感染者的病毒包膜特征，如较低的NXS/NXT比率和特定的糖基化位点缺失，可能与早期产生bNAbs的能力有关，但未发现病毒包膜上的“糖盾”完整性与广泛中和反应有直接关联。
图3 早期中和者（Early Neutralizer，EN）
个体的糖基孔区域预测
五、HIV-1-Gag VLPs的设计及表征
基于血清中和能力、低NXS/NXT比率以及缺乏N332的特点，选择DET 887和DET 936的病毒包膜序列，并引入SOS和T突变，设计HIV-1包膜的VLP免疫原。在HEK-293T细胞上共转染887-SOS-T和936-SOS-T表达质粒与env缺陷HIV骨架（pNL4-3ΔenvFL）后获得病毒，感染TZM-bl细胞48小时，通过评估荧光素酶活性验证病毒的感染效率。与假病毒相比，887-SOS-T和936-SOS-T的感染性显著降低，分别降低了35倍和8倍（图4）。
图4 SOS-T突变在EN假病毒中的效应比较
在293F细胞中生成携带SOS-T变异的HIV-1 Gag VLPs，并通过Western blotting分析Env结合率，评估VLP包膜的整合情况，887-SOS-T变异的VLP包膜整合效率是936-SOS-T的两倍，且只能在936-SOS-T VLPs中检测到三聚体（图5）。综上，两种病毒三聚体整合水平较低，但仍表现出传染性。
图5 VLP的Env整合率
六、887-SOS-T与936-SOS-T HIV-1-Gag VLPs抗原性比较
研究人员测试了887-SOS-T和936-SOS-T HIV-1-Gag VLPs与特异性bNAbs的相互作用，包括预融合天然三聚体抗体（PG16、PGT145、VRC01、PGT151和35022）、CHO依赖的bNAb 2G12、CD4诱导的非中和抗体（17b），不带包膜的VLPs作为对照。结果显示，大部分测试抗体对Env-VLPs具有特异性结合，而对不含包膜的VLPs反应性较低；PGT151显示出强烈的非特异性结合，提示其可能与VLP膜组分存在交叉反应；887和936 VLPs能够被PGT145、VRC01和35022特异性识别，17b抗体也能够结合两种包膜（图6）。综上，来自早期广泛中和反应个体的Env-VLPs能够展示多种构象的包膜蛋白。
图6 VLPs抗原性分析
七、887-SOS-T 和 936-SOS-T HIV-1-Gag VLPs的免疫原性
为进一步评估病毒包膜的免疫原性，并与相应的稳定可溶三聚体进行比较，分别用HIV-1-Gag VLPs及相应的SOSIPs免疫兔子。兔子首先接种两次DNA，再进行三次VLPs或SOSIPs加强接种（图7A），另一组兔子接种不含包膜的VLPs，实验使用DNA初免/蛋白加强的105天快速免疫方案，以模拟自然感染过程。免疫过程中，所有免疫的兔子都产生了抗-gp120反应，但免疫887和936 VLPs的兔子具有更高的抗体滴度（图7B）；在最终采血（第17周）时，VLPs和SOSIPs免疫组之间没有显著差异（图7C）。通过IFN-γ水平评估T细胞反应，各组之间没有显著差异（图8D）。结果表明，VLPs和SOSIPs都能有效诱导针对HIV-1包膜的免疫反应。
图7 接种VLPs和SOSIPs兔子的免疫反应特征
八、自体VLP和SOSIP识别
免疫887和936 VLPs的兔子血清能够识别自体VLPs，免疫887 SOSIPs的兔子血清可识别887 VLPs，免疫936 SOSIPs的兔子血清无法识别936 VLPs（图8A）；免疫887或936 VLPs的兔子血清能够识别887和936 SOSIPs，对自身序列有更强的识别能力（图8B）。研究人员从免疫的兔子血清中纯化得到IgG，进行中和测试，在所有测试的病毒中均未观察到中和活性。综上，基于887设计的两种免疫原均能诱导产生识别自体三聚体的抗体，并有一定的交叉识别能力，但未观察到中和活性。
图8 免疫兔子所诱导的自体VLP和SOSIP反应特征
目前普遍认为，HIV-1感染者通常需要2到3年的时间才能产生bNAbs，因为需要较长时间的体细胞成熟以生成这些抗体。研究团队在2016年发表的一项研究中发现， HIV感染者在感染后的前6个月内就能产生广泛中和免疫反应。基于这一队列，本研究聚焦于感染早期产生bNAbs个体的病毒包膜蛋白，设计VLPs和SOSIPs免疫原并进行测试，发现其均能诱导对异源gp120的抗体反应，但在免疫原性上没有显著差异，且未诱导自体中和反应，可能与免疫策略和佐剂有关。
以上研究数据为基于早期广泛中和反应患者的HIV-1包膜的免疫原提供了一个新的平台，这些免疫原有潜力通过类似于经典预防疫苗的免疫接种方案产生保护性免疫反应。为了进一步发展这类免疫原，需要更多的早期中和反应个体来定义早期感染中诱导更广泛中和反应的相关因素。
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