导读
柯萨奇病毒B1（CoxsackievirusB1，CVB1）是急性和慢性心肌炎、扩张型心肌病和化脓性脑膜炎的常见病因，但目前尚未有人类使用的CVB1疫苗。2023年6月28日，芬兰坦佩雷大学研究人员在Research Square上发表题目为《Comparison of structure and immunogenicity of CVB1-VLP and inactivated CVB1 vaccine candidates》的文章，文章比较了CVB1的病毒样颗粒（Virus-LikeParticle，VLP）和灭活全病毒疫苗的结构和免疫原性，探讨了它们作为疫苗的潜力，以及表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin-3-Gallate，EGCG）作为疫苗佐剂的可能性。研究发现EGCG作为黏膜佐剂，CVB1-VLP在鼻内给予时可被免疫细胞摄取，进一步对VLP进行结构工程可增加黏膜免疫原性，强调了使用福尔马林灭活CVB1疫苗进行黏膜免疫接种的潜力，并为未来基于VLP的针对所有肠道病毒的疫苗开发提供了重要信息。
一、CVB1-VLP结构
柯萨奇病毒B属于肠道病毒B种，包括6种不同的血清型（CVB1-CVB6），除了普通感冒症状外，CVB感染可能导致严重的后果，尤其是在免疫功能低下的个体中。这些并发症可能表现为脑膜炎、胰腺炎和心肌炎。其中CVB1分离株用于生产福尔马林灭活的CVB1疫苗，并且作为CVB1-VLP的模板。为了生产CVB1-VLPs，将杆状病毒转移载体pOET5作为载体，该载体包含由多角体启动子调控的CVB1VP0-3多聚蛋白的不同盒式结构以及由CMV启动子控制的3CD蛋白酶。再利用FlashBA CULTRA杆状病毒基因组产生重组杆状病毒，在感染复数（Multiplicity of Infection，MOI）值为1的High-Five昆虫细胞中培养以生产CVB1-VLPs。
虽然VLPs可能比传统疫苗生产表现得更好，但免疫原性可能较弱，通常需要使用佐剂以增强效果，而福尔马林灭活病毒是人类疫苗商业化生产的关键方法之一。在一种针对已知六种CVB血清型六价疫苗的生产中应用优化的福尔马林灭活时，该疫苗在小鼠模型和非人灵长类动物中具有出色的安全性。然而，用福尔马林处理CVB1病毒时间过长，会导致外壳崩解和病毒浓度降低。紫外线处理会在高温下破坏CVB1病毒和CVB1-VLP的稳定性，并降低疫苗的免疫原性，进而破坏其免疫原性表位。另外EGCG是一种儿茶素，是一种存在于绿茶中的多酚分子，已被研究作为抗病毒剂和疫苗佐剂的潜力。研究表明，EGCG对乙型肝炎C病毒和B病毒、流感病毒以及肠道病毒具有显著的抗病毒作用，此外EGCG还被研究作为疫苗佐剂的作用，发现其能够通过诱导高水平的中和抗体，增强流感亚单位疫苗的效能。
二、吐温80（Tween80）对VLP特性及EGCG与VLPs结合能力的影响
VLP纯化过程中使用Tween80可以显著提高CVB1和CVB1-VLP制剂的稳定性和产量，因此使用已建立的纯化方法分离出VLP制剂，并将EGCG分别存放在不含吐温80（VLPNo−Tween80）和含有吐温80（VLPTween80）的两种条件下。结果显示VLPTween80比VLPNo−Tween80的制剂纯蛋白产量提高了5.2倍，SDS-PAGE分析和密度分析确认了VLP的纯度，使得VLPNo−Tween80和VLPTween80的纯化制剂的纯度均≥95%（图1A-B）。负染电子显微照片显示，VLPs为30nm的完整颗粒（图1C-D）。对新鲜制备的VLPNo−Tween80的VLP进行动态光散射（DynamicLightScattering，DLS）分析，显示其为均一的单分散分布，而在室温条件下的Tris缓冲液中进行长达120h的稳定性测试后，发现VLPNo−Tween80的VLP粒子发生聚集。此外对VLPTween80进行了一个月稳定性测试，在此期间平均液滴直径的相对比例或平均液滴直径没有发生显著变化，综上Tween80显著提高了CVB1-VLP的溶解性和稳定性，表明Tween80对CVB1-VLP的重要性，以及EGCG与VLPs结合具有时间依赖性和可逆性，为后续研究EGCG作为疫苗佐剂的可能性提供了基础。
图1 CVB1-VLPNo−Tween80和
CVB1-VLPTween80的特性及与EGCG的结合能力
三、EGCG对CVB1-VLP的免疫调节作用
通过分析CVB1-VLPNo−Tween80与已建立的注射型佐剂系统04（AS04）或潜在佐剂EGCG结合诱导的体液免疫反应（图2A），评估总抗原特异性IgG抗体，并以IgG1亚型作为体液免疫反应的指标，以IgG2a亚型作为细胞免疫反应的指标。结果显示在CVB1-VLPNo−Tween80+AS04组观察到了最高的特异性IgG抗体水平（图2B）。而在CVB1-VLPNo−Tween80+EGCG免疫的小鼠血清中IgG1抗体滴度最为显著（图2C），这表明EGCG可能增强了特异性体液免疫反应，CVB1-VLPNo−Tween80+EGCG的变异最小（图2E）。另外所有疫苗组的小鼠都保持了预期的体重增长（图2F），没有出现注射部位的炎症迹象。因此EGCG作为CVB1-VLP的佐剂有一定潜力，能诱导较高的IgG1和中和抗体水平，既不会损害也不会阻碍特异性免疫反应。
图2 通过皮下免疫途径接种的
CVB1-VLPNo−Tween80的免疫原性
四、EGCG通过鼻内免疫途径的佐剂活性
研究通过鼻腔滴注的方式以评估EGCG作为黏膜佐剂的效果，旨在比较EGCG和福尔马林灭活CVB1疫苗（CVB1EGCG和CVB1Formalin）与单独的CVB1-VLPTween80疫苗或与EGCG混合的疫苗（CVB1-VLPTween80和CVB1-VLPTween80+EGCG）（图3A）。抗原特异性分泌型IgA和IgG在CVB1Formalin组中显著增加，相反在CVB1EGCG组中这些反应较弱（图3B-D），另外从接种疫苗的动物中提取脾细胞，用活性CVB1刺激，测量疫苗诱导的细胞免疫原性（IFN-γ、IL-2和TNFα分泌水平）。其中CVB1Formalin组和CVB1EGCG组显示出比CVB1-VLP组更高的细胞因子分泌模式（图3E-G）。从终止血清中定量中和抗体、抗原特异性IgG以及IgG亚型IgG1和IgG2a，与CVB1Formalin相比，CVB1EGCG在所有抗体类型上能更显著的诱导相对平衡的免疫反应（图3H-K）。相反，CVB1EGCG诱导的中和抗体反应较弱，IgG1反应减弱，表现对体液免疫反应的抑制。而将EGCG与VLPs（CVB1-VLPTween80+EGCG）结合似乎进一步抑制了VLPs的摄取。综上EGCG不会增强黏膜抗原摄取，相反作为黏膜佐剂表现出抑制作用，福尔马林灭活的CVB1作为鼻内疫苗能诱导体液、黏膜和细胞的平衡免疫反应，是有前景的黏膜疫苗，而单独使用CVB1-VLP或与EGCG联合使用时，免疫细胞可摄取CVB1-VLP，但需要开发新的黏膜佐剂来提高其免疫原性。
图3 鼻腔免疫途径的EGCG的佐剂活性
五、CVB1-VLPsTween80和CVB1Formalin的冷冻电镜（CryoEM）分析
为进一步了解不同制剂之间的免疫原性差异，采用CryoEM分析用于鼻内接种的CVB1-VLPTween80颗粒和CVB1福尔马林制剂的结构。CVB1-VLPTween80有紧凑和扩展两种结构，分别对应天然CVB1病毒粒子和CVB1A-粒子。紧密型CVB1-VLPTween80密度图与从PDBID：7DPF获取的天然成熟CVB1模型拟合良好，结构和位置上与天然CVB1有对应关系，但也存在差异，如VP0内部缺少39个残基长的部分和N末端及肉豆蔻酰基，VP4的N末端臂在CVB1-VLPTween80中不能在残基56之前建模，且有一个分子占据了在天然CVB1中不存在的亚基间口袋（图4A-E、H），而扩展型CVB1-VLPTween80可通过缺乏5倍轴下方密度识别，无VP4和VP0中的密度，脂质因子和疏水口袋塌陷，与A-粒子结构相符，存在可建模的VP3环（170-188位残基），其残基旋转远离2倍轴侧面的孔，可能不阻碍VP1N末端从衣壳中退出；在2倍轴侧面有未建模密度（图4A、F、G）。另外福尔马林灭活的CVB1病毒粒子结构与CVB1-VLPTween80有异同，扩展形式有相似特征但VP3环密度弱，且存在交联和VP1N-末端内部化等差异。综上CVB1-VLP和CVB1福尔马林的结构，揭示了它们与天然CVB1的差异，为理解免疫原性差异提供了结构基础。虽然VLPs免疫原性相对较低，但具有稳定性好等特点，为基于VLP的疫苗开发提供了结构和特性方面的参考。
图4通过冷冻电镜和单颗粒重建获得的紧密型
和扩展型CVB1-VLPTween80的最终重建分析
佐剂分为免疫刺激剂和传递系统，可通过在注射部位为抗原创造储存单元或免疫微环境来增强疫苗免疫原性，吸引免疫细胞，促进抗原吸收和免疫反应激活。本研究用DLS分析发现EGCG与CVB1-VLP结合会导致粒子聚集，形成可逆结合的聚集体。EGCG作为CVB1-VLPNo-Tween的佐剂表现出有前景的特性，能提高IgG1和中和抗体水平，有作为有效佐剂增强疫苗诱导免疫反应的潜力，值得进一步研究。另外本文首次探索CVB1-VLP或福尔马林灭活CVB1作为黏膜疫苗，但EGCG可能损坏了CVB1的免疫原性表位，导致其灭活病毒的体液免疫反应低于福尔马林灭活病毒。CVB1-VLP经黏膜途径可被免疫细胞摄取，但需开发新的黏膜佐剂以增强对VLP的免疫反应。而福尔马林灭活的CVB1疫苗在黏膜免疫中的潜力，强调了下一代基于VLP疫苗进一步开发的重要性。
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