一文读懂毕赤酵母表达系统

产生重组蛋白的主要方法是将携带所需DNA片段的载体引入宿主，酵母是一种真核细胞，具有作为重组蛋白表达的异源系统的能力。通常酵母可以分为两种不同的群体，非甲基营养型和甲基营养型。酿酒酵母是一种不能利用甲基营养化合物的酵母菌株，而毕赤酵母是一种能够利用甲基营养化合物的酵母菌株，经常被用作生产重组蛋白的宿主生物[1]。甲基营养酵母目前被大规模使用，因为它具有原核生物特性，使其能够利用C1化合物（甲醇）的能量，并利用甲胺作为氮的来源。重组蛋白生产过程的基本原理如图2所示。

在毕赤酵母克隆和表达的构建方法中需考虑多个因素，包括启动子终止子组合的选择、适当标记物的选择以及对细胞内或分泌表达的载体系统的利用，这需要仔细选择适当的分泌信号。选择合适的表达载体和相容的宿主菌株对实现重组蛋白的成功表达至关重要。

利用严格调控的启动子如醇氧化酶（Alcohol oxidase，AOX1）在蛋白质过表达方面具有益处。通过将生长过程与生产阶段分离，生物量的积累发生在蛋白质表达开始之前。在生长阶段，细胞不经历由于重组蛋白质的积累而引起的应激，甚至可以产生对毕赤酵母有害的蛋白质。另外在特定的时间间隔，如在靶蛋白的实际合成之前，同时表达辅助蛋白如伴侣蛋白可能是有利的。相反，组成型启动子的使用可以潜在地减轻与处理该过程相关的挑战。在代谢途径的工程方法中使用经过良好调节的组成型启动子还可以以调控的方式操纵代谢物。目前人们越来越倾向于使用修饰的启动子序列来增强毕赤酵母系统中的蛋白质生产[2]。

毕赤酵母载体根据其表达的蛋白质的位置可分为两类，细胞内表达载体和分泌型表达载体。在分泌型表达载体中，信号肽序列通常包括在启动子插入之后。毕赤酵母通常依靠整合型质粒来表达外源基因，这些载体被设计成穿梭载体，可用于大肠杆菌和酵母。在毕赤酵母中表达重组基因的过程可分为三个不同的阶段：将新基因克隆到合适的载体中进行表达，将克隆的载体插入酵母基因组中作为宿主，评价各种菌株以确定重组整合基因的表达能力[3]。为了增强外部DNA整合到毕赤酵母基因组中的有效性，有必要确保使用限制性酶如Sac I、Pme I和Bst X线性化所使用的载体，然后通过电穿孔将线性DNA插入感受态细胞中，插入的基因通过交叉重组的过程被整合到细胞基因组中，导致重组细胞的电穿孔形成（图3）。

利用毕赤酵母作为蛋白质生产宿主的主要益处之一在于其能够将大量正确折叠的、翻译后修饰的和具有生物学功能的重组蛋白质分泌到培养基培养物中。毕赤酵母最常用的分泌信号来源于酿酒酵母α-交配因子（α-Mating Factor，α-MF）、酿酒酵母转化酶（Sucrose Invertase，SUC 2）和毕赤酵母的内源性酸性磷酸酶（Acid Phosphatase，PHO 1）[4]。除了分泌信号的选择外，还有许多其他因素调节蛋白质的有效分泌。mRNA构型不足和基因拷贝数的变化，转录、翻译和蛋白转运到内质网过程中的限制，蛋白折叠不足以及蛋白转运到细胞外区域的次优等都是外源蛋白分泌表达的重要抑制因素。克服这些分泌瓶颈的常用方法是分子伴侣蛋白的上调。另一种方法即上调HAC1，HAC1是一种转录因子，控制参与未折叠蛋白反应途径基因的表达。已证明在正常生长环境下，毕赤酵母中HAC1的表达和剪接保持一致和不间断，这一现象可能解释了使用这种特殊生物体可以实现分泌蛋白质数量的增加。

在选择合适的表达载体和合适的宿主菌株，以及表达盒转化之后，识别表达水平升高的所需蛋白质的转化子变得至关重要。用于在毕赤酵母中产生多拷贝表达菌株的主要方法包括应用需要将转化混合物直接置于含有逐渐递增水平的抗生素的选择平板上的技术。绝大多数转化体将具有已整合到基因组中的表达载体的单拷贝，因此大量克隆将需要筛选以鉴定表现出高拷贝数的转化体。

通过小规模培养技术开发了多种高通量方法用于检测大量克隆。依赖于耐药标志物的筛选方法的问题是产生假阳性结果的菌落发生率升高，耐药标志物赋予抗生素耐药性的机制取决于未经历转化的细胞，这些细胞能够在已破裂的转化细胞附近持续存在。通过创建表达载体解决了该问题，保证了基因表达基本水平的维持，能够通过将转化的生物体直接培养在含有最少量Zeocin™的培养基上来区分遗传变异的个体和多个拷贝。已经证明毕赤酵母在细胞内或通过分泌产生超过15 g/l克重组蛋白，毕赤酵母实现高滴度的能力归因于其生长极高细胞密度的能力，在极高的细胞浓度下，每个细胞内数量有限的蛋白质在该酵母中能够以可接受的体积产生，不丰富但具有重要科学和商业意义的蛋白质被称为整合膜蛋白。这些蛋白质构成了超过50%的人类用药药物的靶标。

只有少数膜蛋白在分子水平上详细研究了结构和功能之间的联系，主要原因是获得适合进行全面结构和生化研究的大量纯化蛋白（膜）具有挑战性。目前这一障碍可以通过获得亲和标记的膜蛋白来克服。毕赤酵母被经常用于生成附着在亲和标签上的膜蛋白，以纯化蛋白质并进行后续的生化研究。此外该酵母已被选为优选的表达宿主，用于阐明来自各种来源的膜蛋白的晶体结构。成功重组表达的优势由于异源表达宿主与表达它们的膜蛋白来源之间的进化接近性而增强。不同来源的膜蛋白在遗传上与其来源遥远的宿主中表达时在稳定性方面具有挑战。因此实施各种方法以增强毕赤酵母的宿主菌株并优化用于表达和生产膜蛋白的条件，用于提高可溶性蛋白生产的类似方法的应用，如蛋白质表达条件的操作、化学分子伴侣的结合、以及缺乏蛋白酶活性的菌株的利用，已经在膜蛋白表达中取得了不同程度的成功。

为了提高发酵过程的有效性，在发酵过程中整合菌株的操作和采用各种策略是至关重要的。尽管毕赤酵母发酵过程中常用的条件普遍存在，但最佳条件取决于所需产物、所用遗传组成以及产物的调节是通过构建型启动子还是诱导型启动子进行[5]。在毕赤酵母中成功进行改进、优化和模拟的主要因素包括发酵参数、操作模式和数学模型。优化发酵过程，包括选择合适的温度、pH、培养基组成和溶解氧等参数，以及采用合适的操作模式和数学模型，如流加补料（Fed-Batch） 培养和连续培养模式，同时可以利用基因组规模模型和数学方法来优化发酵过程。

目前毕赤酵母克隆表达系统面临多种挑战，包括无效信号分泌、转化子筛选方法、克隆变异及糖基化等。在毕赤酵母中有多种可能导致无效蛋白分泌的因素，对于信号分泌无效的问题，可通过绿色荧光蛋白检测确定，并使用信号序列来增强分泌；通过过表达分子伴侣如免疫球蛋白结合蛋白（Immunoglobulin Binding Protein，BiP）和蛋白质二硫异构酶（Protein Disulfide Isomerase，PDI）来增强分泌，但需要注意其协同作用和对不同重组蛋白的影响。有效筛选转化子的方法包括使用96深孔板筛选试验和液滴微流控技术，同时流动细胞术可用于分析细胞的生理状态和筛选高分泌型菌株。克服克隆变异的方法包括识别高分泌型的生物标志物和避免质粒污染导致的非同源重组。糖基化增强的方法包括改造毕赤酵母的N-糖基化途径，使其更接近哺乳动物的糖基化模式，但需要注意蛋白质的降解和糖基化的均匀性问题。

毕赤酵母与细菌相比具有作为真核生物的优点，并在发酵培养方面显示出未开发的潜力。除此之外，毕赤酵母被认为是广泛用于包括饲料、制药、洗涤剂、食品和其他行业在内的各个领域的主要微生物构架，用于生产重组蛋白质。为了获得所需蛋白质的最高产率，一定程度的工艺优化是必要的。在毕赤酵母表达系统中有效生产重组蛋白所需的条件最终取决于特定的靶蛋白。由于毕赤酵母的功效取决于特定蛋白质的结构属性，因此需要根据具体蛋白结构选择合适的方法。