一文读懂大肠杆菌菌株（附重组蛋白表达解决方案）

大肠杆菌作为重组蛋白生产的宿主，主要分为K-12衍生株和B衍生株两大类。K-12是1920年从一个患者身上分离，由此衍生出的商业菌株包括JM109、DH5α、M15和Top10等，多用于遗传工程中的DNA扩增。E.coli B株系的发现历史比较曲折，现在常用的为其衍生株-BL21菌株，由Studier于1986年提出，随后不同基因工程修饰菌株随之诞生。与K-12相比，B衍生株缺少鞭毛基因、DNA胞嘧啶甲基转移酶和外膜蛋白酶OmpT (OmpT protease)，还具有额外的II型分泌系统，更有利于蛋白质分泌。

为了增强重组蛋白的表达，已开发出多种质粒载体和大肠杆菌菌株，每种菌株在蛋白质表达、折叠能力和修饰方面都有独特的优势，适用于不同类型的重组蛋白生产需求。图1是四种常见的用于重组蛋白生产的E. coli菌株的示意图，包括BL21系列、Rosetta系列和Origami系列等。表1汇总了不同大肠杆菌菌株的特征，可根据目标蛋白的特性选择最合适的表达宿主。

来源于E. coli B株系，BL21菌株缺乏Lon蛋白酶(Lon protease)和外膜蛋白酶OmpT，Lon蛋白酶主要功能是降解外源蛋白，外膜蛋白酶OmpT主要功能是降解胞外基质蛋白，这两种关键蛋白酶的缺乏可有效避免重组蛋白的降解。BL21菌株具有先天性的hsdSB基因突变，失去甲基化和降解外源转染质粒的能力，使得质粒能够传代保留至子代细菌中。BL21仅表达E.coli RNA聚合酶，适合依赖于E.coli RNA聚合酶的质粒载体，如pGEX、pMAL等；存在泄漏表达（Leaky expression），即在没有诱导剂的情况下也有一定程度的蛋白表达。

BL21 (DE3)的衍生株，携带pLysS/pLysE质粒（图2），具有氯霉素抗性；可表达抑制T7 RNA聚合酶的T7溶菌酶，从而可以抑制T7 RNA聚合酶在目的蛋白被IPTG诱导前的本底表达，但不干扰IPTG诱导的目的基因表达；pLysE有比pLysS更高的T7溶菌酶表达水平，理论上可将本底表达降至更低水平。适用基于T7启动子的质粒载体，如pET系列。推荐用于毒性蛋白的表达。

BL21 (DE3)的衍生株，增加了rne131突变（RNase E编码基因），导致RNase E表达缺陷，增强目的基因的mRNA稳定性，提高异源蛋白的表达效率。适用基于T7启动子和非T7启动子的质粒载体，包括pET系列、pGEX和pMAL。用于常规蛋白表达，该菌株的异源基因基础表达水平较高，不建议表达毒性蛋白。

大肠杆菌B/r型菌株，来源于BL21，具有缺陷型的Lon和OmpT蛋白酶及四环素抗性。BL21 (AI)中araBAD启动子下游T7 RNA聚合酶转录受到L-阿拉伯糖严格控制，添加L-阿拉伯糖诱导araBAD启动子下游的蛋白表达，添加葡萄糖可以抑制araBAD启动子下游的蛋白表达，即使不加葡萄糖，araBAD启动子下游的本底蛋白表达水平仍然很低，加入葡萄糖后能够进一步的降低本底蛋白的表达水平。适用于任何以T7启动子为基础的表达载体。普通重组蛋白在BL21 (AI)菌株中获得的产量和其他BL21菌株产量相当；而对大部分毒性蛋白在BL21 (AI)菌株中获得的产量高于BL21 (DE3) pLysS菌株或BL21 (DE3)菌株，因此适用于毒性蛋白表达。

T7表达系统调节的蛋白表达水平对于蛋白质的正确折叠和形成至关重要，表达水平较低时，蛋白质能够以原生且正确折叠的形式表达，但当表达的蛋白质超过了分泌系统的能力，就可能在细胞中形成包涵体。

Lemo21 (DE3)属于大肠杆菌BL21 (DE3)衍生菌株，携带的pLemo质粒赋予氯霉素抗性，同时含有L-鼠李糖启动子控制下的T7溶菌酶基因，通过添加不同浓度生物L-鼠李糖（0~2000 µM）诱导不同浓度的T7溶菌酶（LysY）表达，精确调节T7 RNA聚合酶的活性，进而调节靶蛋白的表达水平（图3）。当不含鼠李糖时，其作用类似于含有pLysS的菌株。适用基于T7启动子的质粒载体，如pET系列。可通过调整蛋白的表达水平促进蛋白的正确折叠，因此适用于毒性蛋白、膜蛋白和溶解性较差的蛋白质表达。

在BL21菌株中，IPTG诱导重组蛋白表达具有随机效应，低浓度IPTG诱导只能在少数细胞中实现重组蛋白表达，要使所有细胞都表达，往往需要极高浓度的IPTG，且单个细胞内的重组蛋白水平差异较大。这种IPTG浓度带来的开-关效应让重组蛋白的得率难以控制。

Tuner (DE3)属于BL21 (DE3)的衍生株，Lemo21 (DE3)的替代方案，携带lacZY(半乳糖苷透性酶)基因突变，乳糖通透酶(LacY)突变使得IPTG可以均匀渗透到整个细胞群中，产生浓度依赖且均匀的诱导水平，从而通过调整IPTG的浓度可实现线性表达调控。一般与pET系列载体联合使用。用于较难溶解的蛋白表达，通过控制较低水平的目的蛋白表达，从而增强靶蛋白的溶解度和活性。

两者均为BL21(DE3)的突变株，含有从表型上选择的基因突变，以产生对有毒蛋白质的耐受性，从而减少与毒性蛋白表达相关的细胞死亡问题。C41(DE3)菌株含有至少一个未知的突变，但在表达某些膜蛋白时仍然存在部分毒性。为了解决这个问题，通过筛选C41(DE3)对另一个不同毒性蛋白的抗性菌株获得突变株C43(DE3)。C43(DE3)突变株具有至少两个未知突变，这些突变赋予了它更广泛的表达有毒蛋白或疏水性蛋白的能力。C41 (DE3)和C43 (DE3)在编码T7 RNA聚合酶基因的lacUV5启动子区域存在突变，这会让T7 RNA聚合酶表达降低，导致T7启动子控制下的蛋白质的转录和翻译速度减慢，减少了细胞毒性，因此使用这两种菌株的蛋白表达量均比BL21(DE3)菌株低。该菌株表达T7 RNA聚合酶，适用基于T7启动子和非T7启动子的质粒载体，包括pET系列、pGEX和pMAL。推荐用于各种生物体（包括真细菌、酵母、植物、病毒和哺乳动物）毒性蛋白或膜蛋白的表达。

真核细胞偏爱的密码子和原核系统有不同，因此，在用原核系统表达真核基因的时候，真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说是稀有密码子，由于外源蛋白的高水平表达会耗尽原核细胞中的稀有tRNA池，导致翻译停滞，限制外源蛋白的高效生产。Rosetta系列为大肠杆菌补充缺乏稀有密码子对应的tRNA，旨在提高外源基因尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。

来源于BL21，携带具有氯霉素抗性的pRARE质粒，能够补充6种原本在大肠杆菌中稀有密码子（AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和GGA）对应的tRNA，提供更加“通用”的蛋白质表达。

来源于BL21(DE3)，携带具有氯霉素抗性的pRARE/pRARE2质粒，可补充大肠杆菌缺乏的6种/7种(增加了CGG)稀有密码子对应的tRNA。该菌株染色体整合了λ噬菌体DE3区，可同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，适用基于T7启动子和非T7启动子的质粒载体，包括pET系列、pGEX和pMAL。

尽管在大肠杆菌中表达异源蛋白取得了很多进展，但要实现具有最佳溶解度和适当结构及功能特性的蛋白表达仍然是一个挑战。常见的蛋白表达问题(表2)，如蛋白不表达，蛋白表达水平低，蛋白表达在包涵体中，蛋白质毒性等，宿主菌株的选择是优化蛋白表达方式之一。

宿主、载体和培养条件是成功生产重组蛋白的三个主要因素，结合对重组蛋白物理化学特性的了解，每种菌株独特的优势及实验的具体需求来选择最合适的宿主，同时优化质粒载体（如pET、pHAT、pMAL、pGEX和pSUMO等）、培养相关的时间、温度和诱导剂等因素，提高蛋白表达及纯化的效率。