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NDC的一般作用模式如图1所示，NDC在患者体内施用，由于其靶向部分特异性，可以到达癌症部位。Nb与化学药物结合，识别目标癌症抗原。通过受体介导的内吞作用发生NDC-抗原复合物的内化，整个复合物在核内体/溶酶体中进一步加工，将随后激活的化学药物释放到细胞质中。溶酶体释放的有效载荷激活的化学药物通过干扰DNA链或抑制RNA聚合酶、拓扑异构酶或微管活性进一步抑制快速增殖的癌细胞，从而导致细胞凋亡。

如图1所示，mcDNA是通过一种先进的体内重组技术从质粒DNA（Plasmid DNA，pDNA）中衍生而来[1]。它切除了pDNA中的原核序列，保留了对于治疗效果至关重要的真核序列，如启动子和目的基因。这种独特的结构使得mcDNA成为一种更小且更安全的基因传递载体。

在基因治疗过程中，免疫反应是一个需要重点关注的问题，过高的免疫原性可能会导致患者出现不良反应，甚至影响治疗效果。pDNA虽然是一种常用的非病毒载体，但它含有细菌序列和CpG基序，当递送到哺乳动物宿主时，这些成分可能触发不良免疫反应，并且其作为抗生素抗性的选择标记，可能会带来潜在的健康风险。例如在一些临床试验中，观察到使用pDNA载体后，患者出现局部炎症反应和全身免疫激活的现象。而mcDNA由于去除了这些潜在有害的细菌序列，其免疫原性大大降低，且不存在抗生素抗性基因转移的风险，这一特性使得它在临床应用中具有更高的安全性，减少了因免疫反应而引发的潜在风险。

此外，pDNA的基因表达效率往往受到细胞机制的影响，由于其细菌序列的存在，细胞可能会通过形成抑制性异染色质等机制来沉默pDNA的表达。mcDNA则避免了这种情况，它能够在细胞内实现更高效的基因表达，从而提高基因治疗的效果。一些研究表明，在相同的基因治疗实验中，mcDNA载体能够实现比pDNA更高水平的目的基因表达，为治疗疾病提供了更有力的手段[2]。

亲本质粒（Pparental plasmid，PP）扩增阶段通常在重组生物体内进行，常用的宿主是大肠杆菌。在这个阶段，需要考虑代谢负担对质粒复制和结构稳定性的影响。大肠杆菌在扩增过程中，其代谢负担会影响质粒的复制维持以及结构稳定性。例如，高拷贝质粒的扩增会对细菌产生代谢压力，可能导致质粒丢失或结构改变。诱导重组阶段通过添加诱导剂（如L-阿拉伯糖）激活重组酶，从而将PP转化为mcDNA。在此过程中，还会产生残余的PP和微小质粒（Miniplasmid，mP），这些杂质需要在后续步骤中去除，以获得纯净的mcDNA制剂用于治疗。

Phage λ integrase系统是最早用于生产mcDNA的方法之一，它是一种酪氨酸重组酶系统，需要辅助蛋白FIS和IHF来催化att杂交位点的重组。然而，该系统存在一些局限性，如在细菌宿主中具有内在毒性，导致PP-mcDNA重组产量较低，且最终制剂中会残留大量未转化的PP模板。

Phage P1 Cre recombinase系统是一种酪氨位点特异性酪氨酸重组酶系统，它在结合到loxP位点时进行双向重组。在用于生产小环载体时，需要插入一个突变的杂交位点以保证单向重组。尽管如此，该系统仍存在一些问题，如从PP到mcDNA的转化不完全，最终批次中存在残余质粒，这可能会引发宿主的不良免疫反应，限制了其临床应用。

ParA resolvase系统是一种丝氨酸重组酶系统，催化不可逆、保守的位点特异性分子内重组。该系统在细菌宿主中用于mcDNA生产具有较高的效率。利用该系统开发的一种“Recombination-Based Plasmid Separation”（RBPS）技术，实现了较高的PP-mcDNA重组效率和纯度，为大规模生产临床级mcDNA提供了可能。

PhiC31-integrase/I-SceI homing endonuclease system系统也是一种丝氨酸重组酶系统，介导attP/attB绑定位点之间的单向重组，同时l-Scel核酸内切酶会切割mP和未重组的PP分子，实现了较高的生产产量和纯度。

目前，mcDNA的产量相对较低，与pDNA相比存在明显差距，主要是由于mcDNA的生产受PP产量和重组效率的控制。例如，一些重组系统中的内在毒性或对宿主因子的依赖等因素，都可能导致重组不完全，从而影响mcDNA的产量。Gaspar等人通过增加细菌生长温度到42°C来优化mcDNA的生产，提高了PP的生物合成，从而增加了mcDNA的产量[3]。

2016年，研究人员采用整体柱与二乙氨基乙基配体耦合的方法，一次色谱运行即可纯化mcDNA，并且只需要很少的NaCl梯度操作。这种方法具有成本效益且对环境影响较小，但mcDNA洗脱分布在两个峰，导致回收率较低（约50%）[4]。2019年，研究人员利用尸胺作为新的色谱配体，单次纯化可使超螺旋mcDNA回收率达78.6%，纯度98.4%，且只在一个峰中洗脱，但单次纯化得到的纯mcDNA量少，需多次重复。后来还探索了尺寸排阻色谱法，可以实现66%的回收率，能够回收较高质量的mcDNA（24.02 μg），且对两种不同大小的PP-mcDNA对均适用。

目前有多种检测宿主杂质的商业策略，但评估和表征sc mcDNA质量和纯度的方法昂贵且有限。定量聚合酶链式反应（Quantitative polymerase chain reaction，qPCR）可以用于评估PP、mP和mcDNA的含量，准确性高，但由于其成本较高，在大规模的生产过程中应用受到一定限制。电泳分析是一种快速且便宜的分析方法，可以提供一些关于核酸分子大小和纯度的初步信息，但无法准确量化mcDNA的含量。2020年，研究人员首次实施了一种基于色谱的定量分析方法，利用先前开发的尸胺修饰的整体柱，可在40分钟内从复杂裂解物样品中定量sc mcDNA，且可适用于不同大小的mcDNA-PP对。这种方法为mcDNA的定量分析提供了一种新的有效手段，有助于更好地控制mcDNA的质量和纯度[5]。

mcDNA作为一种高效且安全的基因载体，在基因治疗领域具有广泛的应用前景，可用于治疗各种遗传性疾病，如囊性纤维化、地中海贫血等单基因遗传病。通过将正常的基因导入患者细胞，替代缺陷基因，从而达到治疗疾病的目的。在DNA疫苗的研发中，mcDNA也具有潜在的应用价值。它可以作为一种有效的疫苗载体，将编码病原体抗原的基因传递到人体细胞内，激发人体的免疫系统产生免疫反应，进一步提高疫苗的安全性和有效性，为疫苗的研发提供了新的思路和方法。此外，在细胞治疗中mcDNA可以作为一种中间物质，用于修饰细胞的基因表达，可以为癌症等疾病的治疗提供新的策略和手段，有望提高细胞治疗的效果。

（1）产量和成本问题

目前，mcDNA的生产产量较低，这限制了其大规模的应用。同时，现有的生产和纯化方法成本较高，也增加了mcDNA在临床应用中的难度。可以通过基因菌株改造和探索不同的培养条件来提高mcDNA的整体产量，例如优化发酵条件，如调整温度和诱导时间，或者通过基因改良菌株。在成本方面，可以进一步研究开发更简单、稳健且成本效益高的纯化策略。

（2）质量控制问题

确保mcDNA的质量和纯度是其在临床应用中的关键，目前的质量控制方法还存在一定的局限性，需要更准确、快速且低成本的检测方法。可以进一步研究和开发更快、更便宜且更敏感的技术用于mcDNA的质量控制，例如结合液相色谱-质谱等先进的分析技术，提高对mcDNA质量和纯度的检测精度。同时，加强对现有质量控制方法的验证和重复性实验，确保其在不同mcDNA样品中的适用性和可靠性。

（2）体内递送效率问题

虽然已经开发了多种递送系统，但目前的递送效率和特异性仍有待提高，需要进一步开发更加高效的递送系统和策略，以确保mcDNA能够有效地递送到目标细胞和组织中。例如，可以结合纳米技术和生物材料科学，开发具有更高特异性和生物相容性的纳米载体。此外，还可以利用物理和化学方法的优势，开发联合递送策略，提高mcDNA的递送效率和治疗效果。

mcDNA作为一种新兴的非病毒DNA载体，在基因治疗、DNA疫苗和细胞治疗等领域具有巨大的应用潜力。尽管目前在生产和应用过程中还面临着产量、成本和质量控制等诸多挑战，但随着研究的不断深入和技术的不断进步，相信这些问题将逐步得到解决。未来，mcDNA有望取代pDNA成为最受欢迎的非病毒DNA载体，为基因治疗和相关领域带来新的突破和发展。