Chromatography A | 教你拿捏质粒DNA纯化中层析载体和配基的选择

目前，用于pDNA回收和纯化的工艺包括几个连续的操作以达到最高的sc pDNA回收率和纯度，最大限度地减少pDNA的降解。2020年12月30日，葡萄牙学者在Journal of Chromatography A上发表题目为《Dilemma on plasmid DNA purification: binding capacity vs selectivity》的文章。

今天，让我们一起走进层析分离pDNA中改善载体和配基设计的研究进展，以克服pDNA纯化的挑战。

从历史上看，第一个用于pDNA纯化的方法是基于蔗糖或氯化铯-溴化乙啶密度梯度超离心。然而，这些方法耗时且难以规模化，并且使用有毒和致突变试剂，因此不适合用于pDNA制备。为了克服这些障碍，液相层析法已被确立为pDNA纯化的核心技术。层析可以探索诸如大小、电荷、疏水性、拓扑特征和亲和力等性质，促进pDNA与层析载体之间的相互作用，具有一定的选择性和分辨率，最终回收所需的sc pDNA（图2）。

最常用的初级捕获pDNA的方法是阴离子交换层析法（Anion-exchange chromatography, AEC），然而，其他层析技术也可以从裂解物中分离pDNA，如分子排阻层析（Size exclusion chromatography, SEC）、疏水相互作用层析（Hydrophobic interaction chromatography, HIC）和亲和层析（Affinity chromatography, AC）。在表1中给出了这些层析技术的总结，以及每种层析技术的主要优缺点。

最初，研究人员发现了一个缺限，载体和大分子（如pDNA）结合的能力较低。此外，在具有较高容量的树脂中，由于pDNA和杂质之间的相似性，它们之间通常缺乏选择性，这是重新发明层析载体的起点。

层析法是一种特性明确且成熟的方法，多年来，用于pDNA纯化的层析载体的发展试图克服与分子扩散和结合能力相关的限制，最终研究了不同的载体，如超多孔载体、Monolith层析和吸附膜[3]。

Q-琼脂糖阴离子交换层析含有季胺基团（Q），已广泛用于球形蛋白的纯化。从理论上讲，这种载体并不适合质粒纯化，主要是由于小孔径限制了分子进入孔隙导致了较低的结合能力（表1）。为了消除这种容量限制，研究人员开发了Fractogel EMD DEAE载体，该载体由具有大表面积的微球组成，包含偶联聚合物触角和大孔隙，可以有效捕获pDNA，从而获得更高的结合力（表2）。此外，Deshmukh于2005年开发了孔径约为3 μm的CELBEADS，其和pDNA的动态结合能力为1.4 mg/mL（表2），最终的质粒产品也不含RNA、gDNA、蛋白质和内毒素。

随着新方法的发展，BIA Separations的CIM monoliths已被开发并应用于pDNA分离，可以达到更高的pDNA结合能力（高于10 mg/mL）。对于monoliths，它们具有较高的孔隙率和较大的通孔，这使得流动相能够容易地穿过载体，这些独特的特性允许在短的处理时间内快速有效的分离，减少产品降解和缓冲消耗。2008年，Tarmann等人使用不同的层析载体与CIM-DEAE monolith进行性能比较，发现该载体具有最快的吸附速率和最高的结合能力（13 mg pDNA/mL）（表2）。然而，这种层析法也存在一些缺点，即需要较高的盐浓度，并且需要与其他步骤结合，从而增加了操作时间和成本[4]。

在用膜从裂解物中分离pDNA的情况下，Pereira在2010年从杂质特别是从RNA中分离了pVAX1-LacZ pDNA，其使用了一种疏水性的用线性烷基链配基修饰的膜，质粒的回收率为73%，纯度为60%。其显示出了一个高的结合能力，约为32.5 mg/mL（表2）。该方法快速、简单、有效并减少了pDNA纯化的步骤。

总的来说，为了提高层析载体的选择性、容量、耐久性和成本效益等参数，研究人员不仅致力于基础材料的改进，而且对配基的设计也非常重视，其主要尝试将优化的载体与特定配基偶联，以获得最佳的pDNA纯化性能（图3）。鉴于上文所述，下面的主题将重点描述用于pDNA层析分析的特定配基。

目前的pDNA纯化工艺，需要几个层析步骤，这使得pDNA的生产不仅耗时而且成本高昂。标准的层析方法存在一些局限性，简而言之，AEC对pDNA的选择性较差，而SEC对pDNA的容量和选择性有限，虽然在HIC中pDNA可以与内毒素和单链核酸有效的分离，但pDNA的洗脱发生在高盐浓度下，亚型分离非常困难。为了消除这些限制，AC采用特定的固定化配基在特定条件下与负载的目标生物分子相互作用，旨在促进pDNA的回收水平。由于选择性的提高，该技术可以在一个过程中实现纯化。先前用于pDNA纯化的亲和策略包括DNA结合蛋白、三联体DNA形成、芳香亲和层析和氨基酸亲和层析[5]。

使用DNA结合蛋白作为配基的核酸分离方法已经建立。第一个使用这种层析法的是伍德盖特，他们使用了一个双功能锌指（zinc finger, ZNF）结构的DNA结合蛋白与谷胱甘肽-S-转移酶融合，从复杂的裂解物中分离pDNA。然而，使用这种方法产率为10%。另一种不同的策略是基于三重螺旋亲和力，包括胸腺嘧啶（thymine, T）和腺嘌呤（adenine, A）之间形成Hoogsteen氢键从而形成TAT三联体，或质子化的胞嘧啶（cytosine, C）特异性识别鸟嘌呤（guanine, G）形成CG-C+三联体。为了保证这些三联体在使用过程中的稳定性，必须使用酸性pH。pDNA的结合是和一个生物素化的寡核苷酸配基形成分子间三联体，通过在层析柱上加载温和的碱性缓冲液来回收，其可以使Hoogsteen氢键不稳定。Sherman等人于1997年使用这种层析法纯化了质粒pXL2563，该质粒含有多聚GAA序列，可以靶向共价结合到所用Sepharose柱上的CTT寡核苷酸，质粒最大回收率为42%。最后有一个探索较少，但仍然是一个重要的策略，涉及到使用芳香亲和配基，最常见的是六元环苯。这些化合物可以完全分离sc亚型，纯度水平在98.8%到100%之间，回收率约为100%，如表3所示。

在过去的几年里，氨基酸也被用于亲和层析。迄今为止，精氨酸、组氨酸、甲硫氨酸等氨基酸已成功应用于sc pDNA亚型的分离（表3）。这些特异性配基的主要优点是可以与sc pDNA建立多种相互作用（疏水、静电、阳离子、范德华力和氢键），促进对目标生物分子的亲和，从而导致更有效和选择性的分离。当氨基酸固定在微球上时，sc pDNA的纯度在97%到100%之间，回收率在40%到70%之间。值得注意的是，虽然选择性非常重要，但理想的层析载体也能够促进高纯度pDNA的分离。关于这一点，有研究人员打算将这些配基的选择性与载体的容量结合起来，比如，使用monolith。Monolith比传统的基于微球的层析载体具有更高的pDNA结合能力，例如，将组氨酸固定在琼脂糖载体上时，最大动态结合能力约为0.5 mg/mL，而将相同的氨基酸固定在monolith上时，动态结合能力约为11 mg/mL。

为了寻找最合适的配基，研究人员使用多功能性配基来促进与目标分子的多种的相互作用。这种类型的配基具有多个活性位点，可以同时实现离子和疏水相互作用，增加了层析过程的选择性和特异性。例如，氨基酸衍生物，如组胺，已经应用于sc pDNA的纯化。2013年，Cernigoj利用组胺的疏水性（来自咪唑基团）和离子行为（来自氨基），结合使用(NH4)2SO4降低pH梯度，从开环（open circular, oc）和sc pDNA制成的样品中分离pDNA。

用于pDNA分离的层析法取得了重要进展，大大提高了载体对于大分子的适用性。未来将使用具有大表面积和大孔隙的载体，不仅可以使所需分子的结合位点数量更多，而且还可以促进载体内分子更好的流动。通过这种方法，载体的结合能力和pDNA回收的能力将会增强。因此将来层析载体的生产会创造出传统方法无法生产的复杂结构，有望提高pDNA层析载体的分离性能、生产率和成本效益。在选择性方面，配基的开发还须不断努力，生物信息学工具和分子对接等方法可以帮助科学家开发出改进的、高度靶向的配基。总的来说，科学和技术开始协同作用于层析载体的生产和特定配基的开发，这可以更好地识别目标分子，从而可以实现高回收率和纯度。我们相信通过设计更特异的配基来提高载体的结合能力和选择性，对于从整体上提高pDNA的纯化性能具有重要意义。