导读
近几十年来，重组蛋白在对抗众多疾病方面发挥了关键作用，有着巨大的潜力。随着基因工程技术的进步，蛋白质药物的研究取得了重大突破，融合蛋白、多肽和工程抗体等技术的应用使重组蛋白的构建更加多样化，允许根据疾病特征和患者需求进行定制。在蛋白质的制备过程中，存在可能引发不良反应或过敏反应的杂质。本文概述了在纯化复杂的治疗性蛋白质时遇到的现有挑战以及相应解决方案。这些方法可以加快新产品在研发中的进步，缩短商业化所需的时间，并显著降低生产成本。
一、控制蛋白的还原
蛋白质包含多个二硫键，二硫键的正确配对对于蛋白质结构和活性至关重要。理想情况下，二硫键在蛋白质分泌到细胞外环境之前是正确配对的，但在细胞培养的复杂氧化还原环境中，二硫键很容易断裂。在生物体中，硫氧还蛋白催化硫醇和二硫化物交换形成二硫键的氧化和还原。此外，由于细胞裂解，细胞内酶、蛋白质和辅因子释放到细胞培养基中会导致二硫键减少。抑制还原酶的活性是解决抗体减少问题的有效方法。结果表明，连续通气、添加硫酸铜和半胱胺可有效抑制分子断裂。此外，还可以通过调节pH值和温度来降低硫氧还蛋白催化反应性，以及实施快速纯化以缩短催化反应时间。如表1所示，为下游纯化中抗体减少的机制与常见策略[1]。
表 1下游纯化中抗体减少的机制与解决方案
二、 蛋白质捕获
蛋白质捕获是一个反复出现的话题，研究人员在蛋白质上设计了不同的标签以实现有效分离。虽然单抗的捕获已经很成熟，但复杂融合蛋白、无标签重组蛋白和疫苗的捕获方法可能会有很大差异，具体取决于每种蛋白质的独特特性[2]。
抗体融合蛋白
亲和层析（Affinity chromatography, AC）广泛用于单抗的捕获，它依赖于靶抗体与AC填料之间的特异性结合。如图1所示，抗体由不同的结构域组成，不同的结构域可以被设计和生产为具有治疗活性的重组融合蛋白。在抗体工艺开发中，已经开发了Protein A、Protein G和Protein L，用于在不同位点捕获抗体。Fc融合蛋白是最常见的设计结构，通常可以使用Protein A和Protein G层析进行捕获。Protein L和Protein A可以特异性识别ScFv的VL和VH区域以进行选择性捕获。理论上，Protein A、Protein G 和Protein L都可用于捕获Fab片段，它们在应用中表现出截然不同的结合能力。不同的配体结构、配体密度和填料基质导致相同配体类型之间的蛋白质捕获能力存在显著差异，各种填料可能对不同的分子表现出不同的特异性。
图1 根据亲和结合结构域分类
的IgG和融合蛋白的示意图
除了填料的选择外，缓冲系统的选择对于蛋白质捕获也至关重要，尤其是对于不稳定的融合蛋白。AC通常采用酸性洗脱将目标蛋白与填料分离，在这种情况下，蛋白质可能会变得不稳定。此外，对于酸性融合蛋白，在其等电点范围内调整pH值可能导致蛋白质沉淀或聚集。因此，对于对酸性条件敏感的融合蛋白，建议选择亲和力较低的填料，并降低洗脱缓冲液的缓冲能力，以提高洗脱pH值。
无标签重组蛋白
由于缺乏亲和结构域，无标签重组蛋白只能依赖于非特异性捕获，通常基于蛋白质的物理化学性质，如电荷、疏水性和分子量。图2推荐了无标签融合蛋白的纯化策略。离子交换层析（Ion Exchange Chromatography, IEX）通常在温和条件下提供高分离度和高结合载量，因此推荐用于捕获重组蛋白。样品在阴离子交换层析（Anion Exchange Chromatography, AEX）树脂上的过度吸附会导致产品纯度下降，并使树脂的再生变得具有挑战性，从而缩短其使用寿命。因此，阳离子交换色谱（Cation Exchange Chromatography, CEX）被用作首选的离子交换捕获方法。此外，样品pH值应与目标分子的等电点相差至少0.5个单位，以确保产品稳定性。需要微调pH值和电导率，以最大限度地提高结合载量和分离度。疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC）填料已用于蛋白质纯化步骤，并具有吸附容量高、选择性高、洗脱条件温和和成本低等主要优点。通过选择具有适当疏水强度的填料并优化高盐负载条件，可以获得更好的分离效果。此外，HIC洗脱是在低盐条件下进行的，因此对后续工艺相对友好[3]。
图2 无标签重组蛋白的纯化过程
三、不稳定的蛋白质
确保蛋白质在整个过程中的稳定性是蛋白质纯化的主要考虑因素，因为大多数蛋白质容易受到温度、pH值或盐浓度变化的影响，进而导致出现沉淀和质量降低等问题。
缓冲系统和条件。不适当的pH会导致蛋白质快速聚集和片段化。AC的洗脱缓冲液通常是酸性的，长时间暴露在这种条件下会导致蛋白质活性持续下降。因此，洗脱后，应尽快将pH值调回中性，以防止活性降低。此外，缓冲系统和蛋白质浓度对于稳定性也至关重要。对于松散折叠的蛋白质，不适当的溶液条件会导致疏水区域部分暴露，从而加速聚体的形成。稳定剂。在工艺开发过程中，对于具有强疏水性的蛋白质，在亲和步骤中发生了明显的沉淀。考虑到相对延伸的分子结构和分子中存在暴露的疏水区域，在工艺缓冲液中引入了表面活性剂以稳定蛋白质结构并显著提高产品回收率。其他因素。热力和剪切力会导致不可逆的蛋白质聚集，而冷冻和脱水可能导致一些复杂的蛋白质结构发生构象变化并影响它们的活性。因此，缩短纯化过程持续时间并最大限度地减少样品冻融是最有效和最方便的方法。
表 2纯化过程中影响蛋白质稳定性的因素及策略
四、聚体的去除
蛋白质聚集是蛋白质纯化中最具挑战性的方面之一。部分聚体来源于细胞培养过程。后期聚集则主要取决于缓冲液条件，需要根据目标蛋白质和聚体之间的物理和化学性质的变化，使用不同的色谱模式来去除聚体。表3总结了在纯化过程中去除蛋白质聚体的方法和优化策略[4]。
表3 使用不同类型层析手段去除聚体的策略
亲和层析。单体和聚体都可以被亲和填料捕获。亲和力的差异会对聚体产生不同的分离效果，因为Protein A可以同时结合抗体的Fc和Fab区域，而结合亲和力取决于填料和抗体的设计。Protein A和抗体之间的亲和力取决于两者的结构。Protein A与Fab区的相互作用较弱，与Fc区的结合较强。相比之下，Protein A缺乏与Fab的相互作用。在洗涤和洗脱缓冲液中添加氯化钙/聚乙二醇（Polyethylene glycol, PEG）或氯化钠/PEG组合可以有效增强聚体和靶抗体的分离。
图 3 Protein A填料与抗体的相互作用
离子层析。聚集会产生蛋白质表面覆盖，导致与单体相比表面电荷的差异。尽管聚体通常比单体蛋白更紧密地结合到CEX填料上，但两者之间的分离通常很困难，尤其有二聚体时。除了筛选不同类型的阳离子树脂外，还可以通过在流动相中添加赋形剂来改善单体和聚体的分离。疏水层析。HIC在去除聚体方面具有显著优势，因为与单体相比，聚体表现出更高的表面疏水性。通过HIC分离的功效受蛋白质疏水性、盐类型和浓度以及填料疏水性的影响。通过降低盐浓度或使用疏水性更强的树脂，目标蛋白质可以流过，同时保留聚体和其他杂质，从而避免了高电导率引起的蛋白质不稳定。多模式层析。多模式色谱允许在一个步骤中基于电荷、疏水性、氢键和其他因素进行分离，因此具有更好的选择性。
五、 HCP的去除
宿主细胞蛋白(Host Cell Proteins, HCP)是活细胞分泌的蛋白质、细胞死亡和裂解时释放的细胞内蛋白质异质混合物。在与工艺相关的所有杂质中，HCP通常特别值得关注，因为它们会影响产品的安全性、有效性和稳定性。图4推荐了在下游加工的不同阶段去除HCP的有效策略。
图4 下游加工不同阶段去除HCP的有效策略
深层过滤 (Depth filtration, DF)用于固液分离，也可用于利用带电粘合剂和蛋白质之间的静电相互作用去除HCP。因此，采用两种分离策略：第一，控制条件以促进HCP沉淀；其次，通过与深层过滤材料的静电相互作用去除可溶性HCP。亲和层析是蛋白质捕获的理想工具，因为靶蛋白可以以特定方式与填料紧密结合。然而，由于与Protein A填料的非特异性相互作用或与靶蛋白的非特异性结合，一些HCP与产物共洗脱。离子交换也是去除HCP的重要手段。大多数HCP属于酸性蛋白，因此在碱性靶蛋白的情况通模式下的AEX去除HCP。对于结合和洗脱模式，可以利用HCP和靶蛋白之间的pI差异在蛋白质洗脱之前去除部分HCP，从而最大限度地减少HCP与靶蛋白的共洗脱。同时，疏水层析也显示出强大的HCP去除能力。通过控制HIC工艺中使用的盐的类型和浓度、温度、pH值和配体，可以提高选择性。多模式层析具有离子交换和疏水性的双重特性，多种相互作用的组合可以提供更好的选择性。然而，通过多模式色谱实现增强分离需要全面的实验设计研究，以探索不同因素之间的潜在相互作用。
六、蛋白回收
对于复杂蛋白质，大量聚体和杂质的存在会导致产量降低。因此，在保持产品质量的同时最大限度地提高回收率成为蛋白质纯化工艺开发的关键挑战。DF用于细胞培养液的初始澄清，以保护层析柱。选择合适的DF过滤器是减少吸附引起的蛋白质损失的关键。蛋白质表面部分的不均匀电荷导致与带电膜发生静电相互作用，从而导致蛋白质吸附。因此，用不同材料的DF膜可以提高蛋白质回收率并减少蛋白质吸附造成的损失。此外，可以通过增加洗涤缓冲液的电导率来减轻部分吸附。然而，应特别注意洗涤缓冲液盐的浓度调整，因为过高的电导率可能不适合后续的分离阶段。
治疗性蛋白质药物的开发是一项涉及不同学科的多方面系统工程工作。层析技术在蛋白质纯化中起着关键作用。亲和填料和多模式填料是解决蛋白质纯化挑战最有前途的色谱介质。这两种类型的填料对杂质的选择性更强，能够更好地区分不同蛋白质和工艺相关杂质。本文深入探讨了重组蛋白开发纯化工艺的复杂情况，针对蛋白质还原、蛋白质捕获、稳定性降低、聚体消除、去除HCP的去除和优化回收详细梳理了多种不同的解决方案，对纯化工艺发展的入门和快速检索提供了便利。
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参考文献
[1] Tang P, Tan Z, Ehamparanathan V, Ren T, Hoffman L, Du C, Song Y, Tao L, Lewandowski A, Ghose S, Li ZJ, Liu S. Optimization and kinetic modeling of interchain disulfide bond reoxidation of monoclonal antibodies in bioprocesses. MAbs. 2020 Jan-Dec;12(1):1829336.
[2] Tang S, Tao J, Li Y. Challenges and solutions for the downstream purification of therapeutic proteins. Antib Ther. 2023 Nov 19;7(1):1-12.
[3] Kimerer LK, Pabst TM, Hunter AK, Carta G. Chromatographic behavior of bivalent bispecific antibodies on hydrophobic interaction chromatography columns. J Chromatogr A. 2020 Apr 26;1617:460836.
[4] Wang W, Roberts CJ. Protein aggregation - Mechanisms, detection, and control. Int J Pharm. 2018 Oct 25;550(1-2):251-268.
