导读
质粒是小型的双链环状 DNA 分子，含有染色体外的遗传信息。由于其具有自主繁殖的能力，一个细胞可含有多个拷贝的质粒。质粒所谓主链序列的遗传信息可能并非是必须的，但至少有助于细胞在特定环境中生存。
在过去的几十年里，质粒DNA已成为遗传学和分子生物学中最重要的工具之一，最近也用于医学基因治疗和基因疫苗接种。质粒DNA用于克服单基因缺陷，如囊性纤维化、肌营养不良症或血友病，或诱导针对肝炎甚至癌症等传染病的免疫反应。使用市售纯化试剂盒制备质粒不适用于高效的多毫克或克级质粒生产。更重要的是，所得质粒的数量和纯度完全不可重复，而这却是规模化生产的先决条件，尤其是对于药物领域而言。目前，已有很多先进的技术可以实现生产最大产品纯度的质粒DNA，从而确保产品安全性，满足适用的监管要求[1,2]。
高质量的质粒DNA是基因治疗生产中的关键组成部分，需求量很大，需要优化生产纯化工艺以满足治疗药物生产所需质量要求。大规模质粒常在大肠杆菌中发酵生产，一般工艺流程为：载体构建、种子库建立、收集菌体、大规模发酵、裂解细胞固液分离、澄清与浓缩、分离纯化、质量控制、分装等 [3]（图1）。
图1 质粒 DNA 的生产流程图
临床药用级别的质粒DNA要求纯度高，其质量控制检测项目包括：外观、pH、质粒浓度和纯度、超螺旋质粒纯度、酶切验证、测序、宿主蛋白残留、宿主DNA残留、宿主RNA残留、细菌内毒素残留、无菌等，具体如表1所示。
表1 质粒DNA的质控和检测方法及标准
（1）外观。目视或灯检检查各种质粒DNA样品是否为无色透明、无颗粒的液体。
（2）质粒的纯度与浓度。使用紫外分光光度计在220nm-320nm的波长范围内测量质粒DNA水溶液的吸收。所得到的扫描须在258nm处显示最大值；通过在吸收最大值处进行光度测量来确定水溶液中的DNA含量。如果质粒的纯度不足，可能的原因包括细胞破裂不完全或裂解液中和的时间控制不当。可以尝试加长裂解时间或优化中和液的添加和混合过程。另外，检查是否正确执行了离心步骤以去除沉淀的染色体DNA和细胞蛋白。如果质粒DNA过于稀释，可以通过真空浓缩或限量沉淀的方法提高DNA的浓度。
（3）超螺旋质粒纯度。完整的质粒为共价闭环、超螺旋构型。单条链结构破坏则形成开环，双链破裂则成为线性分子结构。DNA复制过程中的出错容易形成各种不同构型的质粒。超螺旋可以强烈影响细胞转染效率和影响DNA治疗中副作用的产生概率。超螺旋占比已被认定为预测质粒性能的一项重要指标。质粒制备过程中，不同构型的质粒可通过琼脂糖凝胶电泳（Agarose Gel Electrophoresis，AGE）后进行溴化乙锭（Ethidium Bromide，EB）荧光染色即可实现可视化检测[4]。
图2 不同质粒异构体CGE、IEX和AGE分离结果
（4）质粒DNA酶切验证。质粒DNA可以使用限制性内切酶在特定的碱基序列上切割。限制性酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和顺序的DNA片段。酶切后的片段通过在AGE用例如EB染色，可以使所得片段可见。通过将获得的片段大小与基于（理论）序列计算的片段大小进行比较，说明质粒DNA的种类[5]。
（5）宿主RNA残留。检查AGE测试结果照片是否存在RNA污染，在500bp以下的位置见到“云状”区带说明存在RNA污染。若提取的质粒DNA中混有较多的RNA，可以加入RNase进行处理。确保RNA酶在裂解步骤后加入，避免RNA的降解产物影响后续实验。
（6）宿主DNA残留。在常规碱性下提取质粒时,所有试剂量在细菌浓度增高情况下,造成纯化用药量的相对不足、使细菌染色体DNA 去除不完全等原因可能会造成细菌染色体DNA污染。检查AGE测试结果照片是否存在细菌染色体DNA，在大于10kb的位置见到明显的条带或者“背景区”说明存在细菌染色体DNA污染。为了确定质粒产品中细菌染色体DNA的比例，将适当稀释的等分试样用作定量实时PCR(qRT-PCR)中的模板，从而可以计算靶基因组序列的基因拷贝数。
（7）质粒同质性。质粒不同的拓扑结构可以通过毛细管凝胶电泳（Capillary Gel Electrophoresis，CGE）来区分，其中不同的质粒形式在电场中在充满凝胶的毛细管中分裂，然后进行光学检测。CGE检测被认为是可以定量检测不同质粒构型所占比例的唯一可靠方法[6,7]。
（8）内毒素（Lipopolysaccharide，LPS）的测定。内毒素是存在于细菌如大肠杆菌外膜中的脂多糖或脂聚糖，可以固定膜的完整性和保护细菌本身免受某些压力，维持细菌结构的稳定性。但若制备的质粒中LPS残留过高，会使其转染细胞的效率降低，同时还可能造成动物或人的免疫反应进而影响基因免疫疗法的实验结果。质粒DNA溶液中的革兰氏阴性细菌LPS含量可通过动态显色法鲎试剂等方法测定。该方法中，LPS可激活鲎试剂中的原酶，进而催化显色底物显色，形成黄色产物。黄色染色的增加与LPS浓度正相关[8,9]。
图3 通过动态显色鲎试剂测试内毒素水平
（9）蛋白质的测定。质粒DNA溶液中总蛋白质含量的定量是通过基于缩二脲反应的双辛可宁酸显色试验（Bicinchoninic Acid，BCA）来确定的。某些氨基酸和肽键还原Cu2+至Cu+，与二辛可宁酸形成强烈的紫色复合物。它的紫外吸收值可以与蛋白质浓度成正比。为了检测大肠杆宿主蛋白，还可以进行特异性ELISA测定[10]。
（10）测序。纯化的质粒DNA产品需要通过Sanger法测序并将所得序列与该质粒获得的（理论）参考序列进行比较，验证纯化质粒DNA产物的种类。然而，这种测序不能排除质粒产物亚群（如缺失产物）中存在小部分序列[11]。
图4 Sanger法测序示例
（11）微生物技术实验。该测试可以定量计数可能在有氧条件下使用不同培养基生长的温细菌和真菌。该测试可以确定一种物质或制剂是否符合相应的微生物质量要求。
虽然目前已建立大规模符合药学规格的质粒DNA生产工艺，能满足临床需求，但随着基因治疗的进一步发展，对质粒DNA的生产质量控制提出了更高的要求，以提高临床用药的安全性。本文系统阐述了质粒DNA的质量控制和检测方法，包括外观检查、纯度与浓度测定、超螺旋质粒纯度评估、酶切验证、宿主残留检测、内毒素和蛋白质测定等，为质粒DNA的质量控制提供了全面的指导。这些检测方法不仅确保了质粒DNA的纯度和一致性，还满足了临床应用的严格要求，为基因治疗的发展奠定了坚实的基础。
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参考文献
