点击上方蓝字关注我们
摘要
益智仁（Alpinia oxyphylla Miq.，简称A. oxyphylla）是一种传统中药，在改善轻度认知障碍和缓解阿尔茨海默病（AD）病理特征方面具有神经保护作用。本研究通过网络药理学方法，收集了50种活性化合物和164个潜在靶点，并与251个临床试验中验证的AD相关靶蛋白进行了对比分析。基于基因本体论/京都基因和基因组百科全书通路富集分析、化合物-靶点-通路-疾病/蛋白质-蛋白质相互作用网络构建以及网络拓扑结构分析，我们得出结论：益智仁可能通过调节神经递质功能以及神经元网络中的大脑可塑性来发挥神经保护作用。此外，我们选择了与AD密切相关的蛋白，包括淀粉样β前体蛋白、雌激素受体1、乙酰胆碱酯酶和一氧化氮合酶2，作为网络的瓶颈节点，并通过分子对接进行了进一步验证。我们的分析结果表明，萜烯作为益智仁提取物的主要成分，具有神经保护作用，为开发预防和治疗AD的天然疗法提供了新见解。
1 引言
阿尔茨海默病（AD）是最常见的神经退行性疾病，其特征包括脑萎缩、进行性认知功能障碍和行为障碍[1]。AD的主要神经病理特征包括细胞外淀粉样β（Aβ）肽的积聚[2]、过度磷酸化tau蛋白形成的神经原纤维缠结（NFTs）[3]、神经毡细丝、营养不良性神经炎[4,5]、星形胶质细胞增生、小胶质细胞激活[6]以及脑的整体神经退行性变[6–8]。关于胆碱能系统功能障碍[9]、Aβ沉积、氧化应激[10]、炎症途径[11]、钙信号传导功能障碍[12]、激素失衡[13]和遗传因素[14]等假说被认为在AD的发生和发展中起着重要作用，尽管该病的病因尚不完全清楚[15]。此外，尽管已经采用了几种治疗方法来补偿胆碱能神经元的损失、减少或预防淀粉样蛋白/tau蛋白的聚集和毒性，如基因治疗、疫苗、抗炎药物[16]、降胆固醇药物、抗氧化剂[17]和激素治疗[18]等，但这些单一靶向治疗往往效果不佳[19,20]。传统中药（TCM）在中国有着数千年的历史，因其副作用少、多靶点治疗和天然来源而受到广泛关注[21,22]。这些药物已成功用于治疗复杂的神经系统疾病，如AD[23,24]。
益智仁（Alpinia oxyphylla，简称A. oxyphylla）是益智的干燥成熟果实，长期以来被认为对腹泻[25]、遗尿（即非自愿排尿）、痴呆[26–28]、炎症[29]、癌症[29]和其他疾病[30,31]具有“多效”治疗作用。值得注意的是，萜烯作为益智的主要成分，被植物化学研究认为是具有潜在药理活性的代表性成分。近期，几项药理学研究表明，益智在改善认知障碍和减轻神经退行性疾病特征性的病理性脑损伤方面具有明确的有益效果[26,27,32–34]。益智提取物被证明对皮质神经元中谷氨酸诱导的凋亡具有神经保护作用[35]，同时还具有调节氧化还原稳态、增强酶的抗氧化性能、改善胆碱能系统和降低Aβ肽水平的生物活性。此外，提取物还通过脑室内注射给药改善了AD小鼠模型的学习和记忆障碍，并显著降低了β-淀粉样蛋白水平[26,36]。然而，尽管益智的治疗作用已知，但其药理和分子作用机制尚未完全阐明。尽管如此，上述研究为我们使用系统药理学方法进一步研究益智的分子机制奠定了基础。
值得一提的是，我们之前的实验已经通过延长非瘫痪率和降低淀粉样β（1-42）转基因秀丽隐杆线虫（C. elegans）的平均瘫痪率，验证了益智的神经保护作用（数据未显示）。在本文中，我们利用多个可用的公共数据库和生物信息学资源，通过药代动力学评估、靶点预测、网络和通路分析，揭示了益智对AD的潜在药理机制和有益作用。
2 结果
2.1 候选化合物的筛选和潜在靶点蛋白的预测
利用系统药理学方法定义益智在AD中作用的潜在药理机制及每一步的细节如图1所示。通过筛选并排除Symmap、TCMSP、TCM-MESH和TCMID数据库分析中的益智原生化合物重复项，选择了50种化合物作为候选化合物。所有50种化合物被分为6类：23种萜烯（如氧萜醇A、氧萜醇B、姜烯醇等）、6种脂肪酸（如木蜡酸、油酸）、4种二苯基肽烷（如新乌药烷醇、氧萜烯醇）、4种甾醇（如谷甾醇、谷甾醇棕榈酸酯）、3种黄酮类化合物（白杨素、异益智素和桑黄素）以及10种其他化合物（如茄酮、异香草醛、鸢尾根定等），如图2所示。此外，在ETCM数据库中评估后，12种化合物在ADMET标准中表现良好，18种化合物表现中等（补充材料表S1）。
图1. 网络药理学解析益智仁作用于阿尔茨海默病的药理学机制。
图2. 益智仁中50种候选化合物的二维(2D)分子结构及分类。共分为6类，包括二苯庚烷类（4种）、黄酮类（3种）、甾醇类（4种）、萜类（23种）、脂肪酸类（6种）和其他类（10种）。
利用定量构效关系（QSAR）中的利平斯基五规则（Lipinski Rule of Five），结合这50种候选化合物，共筛选出31150个靶蛋白，并与STITCH数据库的结果进行比对。靶蛋白的对接概率和综合评分较高，表明其与化合物紧密结合。在这些靶蛋白中，筛选出164个作为候选靶蛋白，其中99个是萜类的候选靶蛋白（表S2）。此外，基于不同类别的化合物和对齐的候选蛋白，构建了化合物-靶标（CT）网络并进行了说明（图3）。化合物节点边框的红色、绿色、灰色和白色分别表示ADMET评价等级为良好、中等、弱和不适用。其中，五种萜类（氧菲洛尔B/C、氧菲伦二醇A/B和姜烯醇）、四种二苯庚烷类化合物（新努卡特醇、氧菲拉西醇和雅库奇诺酮A/B）以及三种黄酮类化合物（白杨素、异阿尔皮宁和苔色黄素）根据ADMET标准表现出良好的药代动力学性质。此外，我们的维恩图清晰地显示了萜类蛋白的重叠情况，其代表的蛋白靶标数量超过总数的一半，多于其他五组中的任何一组（图S1）。因此，我们推测萜类可能是益智仁中发挥神经保护作用的主要且独特的生物活性物质。
图3. 益智仁化合物-靶标网络的构建及候选靶蛋白的分类。候选化合物（黄色菱形网格节点）按结构类别分组，其药代动力学性质分为良好（红色边框）、中等（绿色边框）、弱（灰色边框）和不适用（白色边框）。同样，候选靶蛋白（蓝色圆形网格节点）也被分组，并与相应的化合物环绕在一起。
2.2. 氧化益智仁分子作用机制的探索
根据整合得分，我们选出了99个萜类化合物的潜在靶蛋白，并进行了GO（基因本体）和KEGG（京都基因和基因组百科全书）通路富集分析。在p值≤0.01的筛选条件下，共识别出579个GO条目和28个KEGG通路条目，如附表S3和S4（图S2D）所示。这579个GO条目中，459个属于生物过程，76个属于分子功能，44个属于细胞组分（附表S3）。为了直观明确地展示GO富集结果，我们采用了气泡图。如图S2A-C所示，p值按降序排列，优先级最高。更重要的是，毒蕈碱型乙酰胆碱受体家族M1-M5（CHRM1, 2, 3, 4和CHRM5）、神经元乙酰胆碱受体亚基alpha-4和7（CHRNA4和CHRNA7）、5-羟色胺受体3A和5A（HTR3A和HTR5A）、钠依赖性5-羟色胺转运体（SLC6A4）以及多巴胺D1/D2受体（DRD1和DRD2）是最常出现的蛋白靶标，它们主要富集在神经系统（has04725, 04726, 和04728）和感觉系统（has04742）、信号分子与相互作用（hsa04080）、信号转导（hsa04020, 04022, 04024, 04066, 和04371）以及物质依赖相关的信号通路中，特别是在神经传递（GO:0030594, 0099536, 和0099537）、神经元和突触形成（GO:0030425, 0045211, 0097447, 0097060, 和0099699）、5-羟色胺受体（GO:0099589）和G蛋白偶联受体（GPCR）信号通路（GO:0004993, 0007187, 0007188, 0008227, 和0099528）中。因此，我们进一步确认萜类化合物在神经系统疾病（如阿尔茨海默病，AD）中发挥着关键的调节作用。
此外，我们从CTD（比较毒理学数据库）和GeneCards数据库中收集了与AD相关的基因条目。结果，分别从每个数据库中收集到了22150个和6634个蛋白质编码基因条目。通过筛选和整合，我们从两个数据库中得到了251个具有优先推断得分和相关性得分的基因条目，这些条目作为AD的关键潜在靶蛋白（附表S5和S6）。在氧化益智仁的潜在靶蛋白中，我们发现了21个与AD相关的靶蛋白，包括淀粉样β前体蛋白（APP）、ATP依赖性转位酶ABCB1（ABCB1）蛋白、神经元乙酰胆碱受体亚基alpha-7（CHRNA7）、血管紧张素转换酶（ACE）、谷氨酸受体离子型N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDA）2B（GRIN2B）、细胞色素P450 1A2（CYP1A2）、乙酰胆碱酯酶（ACHE）、5-羟色胺受体2A（HTR2A）、钠依赖性多巴胺转运体（SLC6A3和SLC6A4）、一氧化氮合酶（脑型：NOS1，诱导型：NOS2，内皮型：NOS3）、脑啡肽酶（MME）、基质金属蛋白酶-3（MMP3）、基质金属蛋白酶-9（MMP9）、NAD依赖性蛋白去乙酰化酶sirtuin-1（SIRT1）、前列腺素G/H合酶1,2（PTGS1和PTGS2）、转录因子p65（RELA）以及谷氨酸受体离子型NMDA1（GRIN1），如附表S7所列。萜类化合物与临床验证的AD相关靶蛋白的重叠反映了萜类化合物在治疗AD中的潜在功能。
2.3. 综合网络模型的构建与分析
氧化益智仁的化合物-靶标-通路-疾病（CTPD）网络包含234个节点和2594条边，其中与AD相关的潜在靶蛋白用红色边框标记，其他潜在靶蛋白用蓝色标记，如图S3所示。为了进一步探究氧化益智仁神经保护机制的潜在分子机制，本研究构建了萜类主要成分的化合物-靶标-通路（CTP）网络和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。具体来说，萜类化合物的CTP网络模型包含152个节点和995条边，基于GO/KEGG通路富集分析，有72个差异表达基因（p<0.01）富集在28条通路中（图4A）。红色边框的椭圆节点代表13个与AD相关的蛋白和4个关键蛋白（来自13个hubba蛋白，附表S8），这些蛋白是通过以HINT hqb作为背景网络的164个潜在蛋白的拓扑分析筛选出来的（图S4）。重要的是，PPI网络是获取对整个网络性能有更显著影响的节点的前提和基础。我们通过有价值的拓扑指标（包括度、中间中心性、接近中心性以及前20个节点中的瓶颈节点）筛选出了重叠节点。在PPI网络中，雌激素受体（ESR1）、APP、D2多巴胺受体（DRD2）和代谢型谷氨酸受体2（GRM2）被筛选为瓶颈节点蛋白，这与它们的分子功能相一致。我们利用聚类和拓扑方法来识别各种蛋白靶标之间的个体差异和相似性（图4B）。
图4. 萜类化合物-靶点-通路（CTP）网络及蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建与分析。（A）具有不同病理特性的候选化合物（良好：红色菱形，中等：绿色菱形，弱：黄色菱形，不适用：灰色菱形），椭圆节点表示KEGG富集条目（p < 0.01，粉色椭圆）和未在KEGG中富集的节点（p < 0.01，蓝色椭圆），以及阿尔茨海默病（AD）相关蛋白（红色边框椭圆）和萜类化合物的通路（紫色圆角矩形）的构建。（B）萜类化合物的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络以聚类着色，节点大小表示度值。在这些节点中，APP、ESR1、DRD2和GRM2作为核心靶点，以红色边框标示。
此外，在考虑药物设计与开发时，具有良好水溶性、血脑屏障通透性和药代动力学特性的化合物具有重要意义。为了更好地理解萜类化合物的作用机制、构效关系及其潜在靶点，我们根据ADMET筛选标准选出了具有良好药代动力学特性的萜类化合物，以及其常见靶点（即ACHE、AR、HTR1E、NOS2、SRD5A2、CHRM4和CYP17A1）。在这些靶蛋白中，ACHE和NOS2被发现与阿尔茨海默病（AD）相关蛋白存在重叠节点，这对未来研究具有重要价值。
2.4 分子对接
为了进一步验证萜类化合物在AD中的功能作用，我们随机测试并验证了具有良好药代动力学特性的萜类活性化合物与关键潜在蛋白之间的相互作用。通过应用AutoDockTools-1.5.6、Discovery Studio 4.5 Client和Pymol软件，我们阐明了潜在活性化合物（即氧化菲洛醇B、氧化菲洛二醇A、桉树脑和姜烯醇）与AD相关蛋白（即ACHE和NOS2）以及瓶颈节点蛋白（即APP和ESR1）之间的相互作用。值得注意的是，结合能越低，化合物与靶标的结合越强。我们发现活性位点残基与潜在化合物之间存在范德华力、氢键和芳香堆叠（π-σ、π-烷基和烷基相互作用）。
图5A和图S5A展示了氧化菲洛醇B（C07）在ACHE（6o4w）活性位点中的3D模式和2D表示。有趣的是，C07与ACHE的自由结合能被发现为-4.8 kcal/mol。此外，C07与TRP 286显示了两个π-σ键相互作用，并与TYR 124、PHE 297、TRP 286和TYR 341形成了八个π-烷基键。结合复合物的相互作用类型和距离也在图5A的放大图中进行了描绘。TYR 72、PHE 295、VAL 294、ARG 296、SER 293和LEU 76等原子作为口袋原子，通过范德华力围绕C07化合物聚集在一起。
类似地，氧化菲洛二醇A（C08）与NOS2（4nos）的结合相互作用如图5B和图S5B所示。C08与NOS2的自由结合能被发现为-4.68 kcal/mol。特别是，C08分别与HIS 499、GLN 502和VAL 500形成了3个氢键相互作用。VAL 500和LYS 254也与C08呈现烷基相互作用。此外，THR498、GLN 310、GLY313和ASP131能够通过范德华力与C08结合。这些结合复合物的相互作用类型和距离也在图5B的光线追踪图中进行了描绘。
此外，我们还分析了桉树脑（C42）与APP（5buo）的结合位点、相互作用类型和距离以及活性原子，并如图5C和图S5C所示。桉树脑（C42）与APP（5buo）的自由结合能被发现为-3.9 kcal/mol。C42与GLN 454形成了1个氢键相互作用，并与ILE 451、VAL 455和HIS 458分别形成了三个烷基和π-烷基相互作用。同时，C42在MET 383、HIS 436、THR 433和GLU 387之间呈现了四个范德华力。姜烯醇（C50）在ESR1（3os8修订突变位点）活性位点中的2D/3D模式以及相互作用类型和距离如图5D和图S5D所示。此处需更正，前文提及的C07与ACHE的自由结合能在此处应为C50与ESR1的相关数据，C50与ESR1的自由结合能被发现为-5.28 kcal/mol。C50与ARG 434和GLN 506形成了2个氢键相互作用，并与HIS 513形成了一个π-σ键。此外，C50还与HIS 513、ALA 430、ILE 510和ARG 434分别形成了七个烷基和π-烷基相互作用。THR 431和LEU 509与C50之间存在两个范德华力。
图5. 分子对接模型、活性位点及结合距离的示意性三维表示，以及化合物（A）氧化藁本内酯B（C07）在乙酰胆碱酯酶（PDB ID: 604w）中的光线追踪，（B）氧化藁本二醇A（C08）与一氧化氮合酶2（4nos），（C）桉油精（C42）与淀粉样前体蛋白（5buo），以及（D）姜烯醇（C50）与雌激素受体1（3os8修订突变位点）的光线追踪。
3 讨论
传统中药（TCM）已被证明是一种以多靶点/多成分方式缓解复杂疾病的有效治疗方法，这使其在所有传统药物中独树一帜[37]。重要的是，中药用于治疗神经系统疾病已有数千年历史。凹叶厚朴属植物属于姜科姜属，富含萜类、黄酮类和二苯基庚烷类等化合物，这些化合物在腹泻和遗尿症患者中已显示出临床活性[38-41]。近年来，越来越多的临床试验和研究表明，凹叶厚朴在改善认知障碍和减轻阿尔茨海默病（AD）特征性脑病理损伤方面具有明确的积极作用[26,37]，尽管其潜在作用机制尚不清楚。此外，我们之前的结果表明，凹叶厚朴提取物对降低AD转基因秀丽隐杆线虫的瘫痪比例具有显著的神经保护作用（数据未显示）。这促使我们采用综合计算系统药理学方法，以及经典分子动力学和分子对接模型，来探索凹叶厚朴及其生物活性化合物治疗AD的有效物质、推定靶点和潜在药理机制。
通过整合SymMap、TCMSP、TCMID、TCM-ID和ETCM数据库，使用ADMET标准筛选出了50种候选化合物，并使用QSAR-TargetNet筛选标准选择了凹叶厚朴的164个推定靶点（包括99个萜类靶点）。化合物的分类和化合物-靶点网络的分析表明，具有良好药代动力学特性的萜类、黄酮类和二苯基庚烷类是凹叶厚朴中的主要化合物，这与现有实验数据一致。随后，我们鉴定和分类了579个GO术语、28个KEGG通路术语，以及凹叶厚朴的6种相关蛋白质疾病。这些推定靶蛋白的功能包括G蛋白偶联胺、神经递质和5-羟色胺受体功能蛋白、树突和突触膜组分，以及参与GPCR信号通路的蛋白。因此，GO/KEGG富集通路强调了凹叶厚朴推定蛋白与AD的潜在相关性。接着，我们通过构建凹叶厚朴的CTPD网络，以及萜类的CTP和PPI网络，检查了推定蛋白与CTD和GeneCards中AD相关蛋白之间的联系。在凹叶厚朴的推定靶蛋白中，21个与AD相关的靶蛋白和8个推定靶蛋白（HDAC1、ESR1、EGFR、RELA、ESR2、AR、RAC1、TP53）通过拓扑分析具有瓶颈节点的特征。此外，我们对占凹叶厚朴推定靶点很大比例的萜类推定靶蛋白进行了KEGG通路注释，并通过聚类算法构建了蛋白质-蛋白质相互作用网络，以预测蛋白质功能。基于手动注释图，萜类在调节神经系统中神经递质的合成和释放、信号传导、树突生长和棘突形成（包括突触可塑性）方面发挥了作用（图6）。
图6. KEGG富集通路术语和益智仁中鉴定出的推定靶标蛋白及萜类化合物的神经系统相互作用效应。通路和生物学功能（蓝色矩形）构成压缩的神经突触信号传导网络。橙色和绿色矩形分别代表本研究中鉴定出的推定靶标蛋白和网络中的相关功能蛋白。箭头表示激活；圆箭头表示抑制。
图6左图显示，溶质载体家族18成员A1、A2和A3（SLC18A1, 2, 3）可能在突触囊泡循环、乙酰胆碱酯酶（ACHE）[42]和含黄素胺氧化酶A（MAOA）[43,44]信号传导中发挥作用，这些过程已被证实参与色氨酸代谢、甘油磷脂代谢，并且与可卡因和安非他命成瘾、酗酒以及帕金森氏病在突触前神经末梢相关。神经递质，如多巴胺（DA，hsa04728）、5-羟色胺（5-HT，hsa04726）和乙酰胆碱（ACh，hsa04725），作用于毒蕈碱型乙酰胆碱受体M2（CHRM2）[45]和胶质细胞中的DA代谢相关的MAOA，以及通过钙诱导的钙释放（CICR）[48]机制影响钙（Ca2+）储存的CHRNA7[46]和CHRM1[47]，还作用于HTR2A-SLC6A4-IP3-TRPC1[49,50]通路以进行Ca2+转运。在突触后细胞膜上，DA是哺乳动物大脑中典型的慢速神经递质，与D1样受体DRD1和DRD5[51,52]结合，这两者均与腺苷酸环化酶（AC）和环腺苷酸（cAMP）的产生正相耦合，并在PTGS1和NOS1表达的下游被激活和调节。而D2样受体DRD2、DRD3和DRD4的激活在多巴胺能突触通路（hsa04728）[51]中对AC和cAMP产生的调节作用恰好相反。更多证据表明，DA通过多种依赖于cAMP和Ca2+以及不依赖于它们的机制（has 04020）影响神经元活性、突触可塑性和行为。类似地，ACh结合并激活毒蕈碱型乙酰胆碱受体CHRM1、2、3、4和5[53]，并直接改变磷脂酶C、三磷酸肌醇、cAMP、游离Ca2+的细胞稳态，以及神经元ACh受体CHRNA4和7[54]的激活。它还调节钠（Na+）和Ca2+的快速内流，进而通过cAMP（hsa04024）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK，hsa04010）和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）（hsa04151）信号通路导致细胞去极化。对于单胺类神经递质，5-羟色胺（5-HT）与离子型5-HT3受体、G蛋白偶联受体（GPCR）5-HT受体（包括5-HT1（Gi/Go偶联）、5-HT2（Gq偶联）、5-HT4/6/7（Gs偶联）和5-HT5受体）结合，这些受体可直接或间接参与突触传递、神经元兴奋性、突触可塑性和神经保护的调节[55,56]。因此，我们推测，通过神经递质受体的功能注释和富集分析，益智仁或萜类化合物作为天然化合物可能在介导抗阿尔茨海默病（AD）效应中发挥重要作用。
基于我们的拓扑分析、筛选出的Hubba节点以及萜类化合物的蛋白质-蛋白质相互作用网络构建，选择了两个瓶颈节点蛋白：淀粉样前体蛋白（APP）[57]和雌激素受体1（ESR1）[58]，以及两个AD相关靶标：ACHE[59]和一氧化氮合酶2（NOS2）[60]，作为AutoDock化合物-配体相互作用分析的基础，以初步研究萜类化合物的抗AD效应。良好的分子对接得分和结果表明，萜类化合物具有适宜的抗AD活性。其他推定蛋白靶标也与益智仁中的几种代表性化合物高度匹配，但其具体作用和特性需要在未来的研究中进一步验证和探究。
4 材料与方法
4.1 化合物数据库构建
在本研究中，益智仁的化学物质数据来源于SymMap（http://symmap/org/）[61]，这是一个综合数据库，涵盖了来自中药系统药理学（TCMSP）数据库和分析平台（http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）[62]、中药综合数据库（TCMID）[63]、中药信息数据库（TCM-ID）[64]和《中药百科全书》（ETCM；http://www.nrc.ac.cn:9090/ETCM/）数据库[65]的信息。采用吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADMET）标准，即口服生物利用度（OB ≥ 30%）、类药性质（DL ≥ 0.18）评价和血脑屏障（BBB ≥ -0.3），对益智仁的综合类药性质和药代动力学特性进行评估和筛选，以获得候选化合物。此外，使用PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库对化合物的二维/三维（2D/3D）结构、规范简化分子线性输入规范（SMILES）和PubChem ID进行校准。
4.2 AD相关蛋白和推定靶标蛋白筛选
利用比较毒理基因组学数据库（CTD；http://ctdbase.org/）[66]和GeneCards（http://www.genecards.org/）[67]数据库，根据与AD相关性较高的排名得分，鉴定AD相关蛋白靶标。然后，使用利平斯基五规则对化合物进行评分，并通过定量构效关系-TargetNet（QSAR-TargetNet：http://targetnet.scbdd.com）[68]有条件地筛选和过滤推定靶标蛋白。通过UniProt数据库（http://www.uniprot.org/）[69,70]中的唯一UniProtKB ID和目标名称，验证候选化合物的AD相关蛋白和推定靶标蛋白。
4.3 基因本体（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集及网络构建
Metascape（http://metascape.org/）[71,72]是一个基于网络的综合基因注释和分析资源门户，结合了GO[73]和KEGG[74]通路富集分析搜索，利用了超过40个独立的知识库。推定蛋白的GO/KEGG通路富集术语，其p值≤0.01被视为显著且值得关注。
为了阐明AD的发病机制并阐述益智仁的作用机制，我们构建了化合物-靶标相互作用（CT）、化合物-靶标-通路（CTP）和化合物-靶标-通路-疾病（CTPD）网络，并使用拓扑参数进行分析，通过Cytoscape 3.6.0软件（美国西雅图系统生物学研究所；http://www.cytoscape.org/）[75]筛选和可视化瓶颈节点的子网络。在Metascape和STRING（https://string-db.org/）[76]数据库中设置蛋白质-蛋白质相互作用（PPI），并通过Cytoscape的聚类分析进行可视化。
4.4 分子对接
使用AutoDockTools-1.5.6、Pymol 2.3和Discovery Studio 4.5 Client[77,78]进行经典分子动力学分析，获得化合物与靶标蛋白之间的结合能力、位点及相互作用。候选化合物的三维化学结构式来源于PubChem，并使用ChemBioDraw 3D进行能量最小化。此外，推定靶标的晶体结构来源于蛋白质数据库（http://www.pdb.org/），通过Pymol 2.3和UCSF Chimera 1.14rc软件去除配体和水基序、进行修订、优化突变位点并添加氢原子进行修饰。
5 结论
综上所述，益智仁在治疗AD方面已显示出积极作用。在本研究中，我们采用网络药理学和分子对接方法探讨了其抗AD活性的机制。研究结果表明，作为传统中药（TCM）的益智仁，通过多通路和多靶点发挥整体作用。益智仁，尤其是其萜类化合物，似乎在调节神经递质的合成、释放和传递，以及神经系统树突棘和突触的形成和可塑性方面具有神经保护作用，这为开发新型抗AD药物提供了理论基础和新见解。
点个在看你最好看
