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摘要
目的：胃癌（GC）是消化系统最常见的恶性肿瘤之一。胃癌的晚期转移严重限制了其常规治疗手段的应用，而某些中药复方被报道在抑制肿瘤转移方面具有良好前景。茯苓（PA），中药中称为茯苓，是一种源自多孔菌科真菌茯苓的常用中药材。
方法：采用MTT法检测细胞的增殖能力，通过划痕实验和Transwell实验评估不同浓度茯苓处理后细胞的侵袭和迁移能力。采用qPCR分析mRNA的差异表达。通过小鼠皮下肿瘤形成实验评估肿瘤在体内的生长情况。
结果：体内外实验均表明，茯苓显著抑制胃癌细胞的增殖。此外，体外实验还揭示，茯苓不仅抑制胃癌细胞的侵袭和迁移，还能逆转TNF-β诱导的上皮-间质转化（EMT）。进一步实验发现，茯苓通过诱导胃癌细胞发生铁死亡来抑制细胞的侵袭、迁移和EMT。
结论：简而言之，本研究表明茯苓通过诱导胃癌细胞发生铁死亡来抑制肿瘤转移。我们的发现提示茯苓在胃癌治疗中可能具有治疗潜力。
引言
胃癌（GC）是全球癌症相关死亡的第二大原因，中国占全球遗传性囊性疾病病例的近一半[1]。大多数胃癌患者在确诊时已处于晚期，导致全球死亡率居高不下。尽管采用了辅助化疗或放疗等综合治疗手段，但晚期确诊并接受手术治疗的胃癌患者预后仍然不佳，5年生存率较低。因此，在胃癌治疗研究中，发现具有更高疗效和更低毒性的新型化学预防和抗肿瘤药物至关重要。
上皮-间质转化（EMT）是指上皮细胞向间质细胞类型转换的生物学过程[2]，在此过程中，细胞失去极性、细胞间连接等上皮特性，而获得迁移和侵袭能力增强等间质特性[3]。虽然EMT在胚胎发育、器官形成和伤口愈合等正常生理过程中发挥着关键作用，但它也促进了多种疾病的发生和发展，特别是癌症转移和耐药[4]。因此，研究EMT对于理解癌症的起始、进展和治疗具有重要意义。目前，人们正在努力探索针对EMT过程的干预措施，以阻止癌症转移并提高治疗效果[5]。
铁死亡是一种新发现的非凋亡性细胞死亡形式，与细胞内铁死亡相关物质的积累和氧化应激有关[6]。铁死亡最初于2012年被描述，近年来引起了广泛关注[7]。细胞内铁死亡相关物质的过度积累可诱导氧化应激水平升高，导致脂质、蛋白质和核酸等生物分子受损，最终触发细胞死亡途径[8]。尽管铁死亡的确切信号通路尚不完全清楚，但已知它与凋亡信号通路不同。研究表明，铁死亡可能涉及多个信号通路，包括铁死亡依赖性的过氧化氢生成、活性氧（ROS）介导的线粒体损伤和相关细胞死亡蛋白的激活。铁死亡与某些疾病的发生和发展有关，如某些类型的癌症、神经退行性疾病和心血管疾病。在癌症中，铁死亡可能影响肿瘤细胞的存活和死亡决策，但具体机制尚需进一步研究。
茯苓（PA）[9]，中药中称为茯苓，是一种源自多孔菌科真菌茯苓的常用中药材[10]。茯苓主要生长在中国，尤其是湖南、湖北、安徽和江西等地。中药研究表明，茯苓可以调节脾胃功能，增强消化吸收能力，并改善食欲不振和腹胀等消化系统问题[11]。茯苓还可以调节免疫系统功能，增强机体抵抗力，提高整体免疫力[12]。在本研究中，我们使用胃癌细胞系SGC-7901和裸鼠来评估茯苓在胃癌治疗中的疗效，并探索其潜在机制。这一努力可能为茯苓在胃癌中的潜在治疗作用提供新的见解。
材料与方法
材料
茯苓（高效液相色谱纯度97%）购自中国上海源叶生物科技有限公司。茯苓溶于二甲基亚砜（DMSO）中，浓度为10 mM，并储存于-20 °C。SGC-7901细胞专用培养基、磷酸盐缓冲液（PBS）、胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）、Transwell渗透支持物（8.0 μm聚碳酸酯膜）、MTT、E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、波形蛋白和β-肌动蛋白抗体、TIMP-1、抗兔IgG辣根过氧化物酶（HRP）偶联抗体均购自Thermo公司。
细胞培养
人胃癌细胞系SGC-7901和人胃黏膜上皮细胞GES1购自中国普诺赛生命科技有限公司（目录号：CL-0021）。细胞在SGC-7901细胞专用培养基中于37 °C培养，并在含5% CO2的培养箱中定期监测生长状态。当细胞汇合度超过80%时，使用胰蛋白酶分离细胞，并每2至3天传代一次。
细胞活力测定
处于对数生长期的SGC-7901和GES1细胞经胰蛋白酶消化后悬浮成单细胞，以每孔3×10^3个细胞的密度接种于96孔板中。随后，用终浓度为0、25、50、100和500 μM的茯苓处理细胞。在CO2培养箱中孵育24小时后，向每孔加入10 μL 5% MTT溶液，并继续孵育4小时。弃去上清液后，向每孔加入100 μL DMSO。使用自动微板读数器测量每孔在490 nm处的吸光度值。
划痕实验
处于对数生长期的SGC-7901细胞经胰蛋白酶消化后，以每孔3×10^6个细胞的密度接种于6孔板中。在37 °C含CO2的培养箱中培养，当细胞汇合度超过80%时，使用200 μL移液器枪头在单层细胞上划痕，并用PBS洗涤以去除碎片。随后，用浓度为0、50和100 μM的茯苓处理细胞，并继续培养。在0和24小时时，使用倒置显微镜拍摄划痕区域的图像，并使用ImageJ软件量化划痕宽度。
Transwell小室实验
将Matrigel用无血清培养基稀释8倍后加入Transwell小室，然后在37 °C孵育4小时使凝胶固化。处于对数生长期的SGC-7901细胞经胰蛋白酶消化后悬浮，以每孔2×10^4个细胞的密度接种于上室，并在下室中加入浓度为0、50和100 μM的茯苓。培养24小时后，用PBS洗涤细胞，用甲醇固定，并用结晶紫染色。使用倒置显微镜在每孔随机选择5个区域计数迁移的细胞数。其余步骤与Transwell侵袭实验一致。
免疫染色
SGC-7901细胞经指定浓度的茯苓处理48小时后，用4%多聚甲醛固定。用0.1% Triton X-100孵育30分钟后，用1% FBS封闭，然后在4 °C下与一抗孵育12小时。接着，与二抗孵育2小时。用DAPI染色细胞核10分钟。在荧光显微镜下观察线粒体和细胞核，并使用ImageJ软件量化信号强度。
RT-qPCR
根据制造商的说明，使用Trizol（Invitrogen，美国）提取总RNA。使用Thermo Fisher（美国）的Prime-Script RT试剂盒合成cDNA。使用QIAGEN（德国杜塞尔多夫）的SYBR Green PCR试剂盒进行定量聚合酶链反应（qPCR），以确定基因表达水平。使用β-肌动蛋白作为内参。目标基因的相对mRNA水平通过2^-ΔΔCT方法归一化到β-肌动蛋白。
Western blot
等体积的蛋白质在SDS-PAGE凝胶上进行电泳，然后转移到硝酸纤维素（NC）膜上。在含5%脱脂牛奶的Tris缓冲盐水中封闭后，将膜在4 °C下与相应的一抗孵育过夜，然后在室温下在旋转摇床上额外孵育2小时。使用ECL（GE，美国）显色。使用图像分析软件（ImageJ）分析条带的灰度值，并使用凝胶分析系统对蛋白质条带进行成像。
动物模型
所有动物实验均经动物伦理委员会批准，并按照美国国家卫生研究院《实验室动物护理和使用指南》进行。从上海斯莱克实验动物有限公司（中国）获得5周龄雌性BALB/C裸鼠（18-20 g）。在建立肿瘤前，用指定浓度的茯苓处理SGC-7901细胞48小时。在植入后第90天对动物实施安乐死，并切除肿瘤称重以进行肿瘤大小分析。
统计分析
所有数据均来自至少三次独立实验。使用Graph Prism 8.0软件进行单因素方差分析（ANOVA）以确定统计学显著性。*P<0.001被认为具有统计学显著性。
结果
茯苓对胃癌细胞生长的抑制作用
茯苓的化学结构如图1A所示。在倒置显微镜下，经茯苓处理的SGC-7901细胞形态发生变化，如图1B所示。结果表明，对照组细胞保持完整且贴壁良好，而茯苓处理组细胞开始脱落，体积减小，部分细胞崩解并漂浮。为评估茯苓的体内效应，使用特定浓度茯苓预处理48小时的胃癌细胞构建异种移植动物模型。将SGC-7901细胞皮下注射到裸鼠右侧胁腹部，3个月后，观察并分析所有注射小鼠的继发性肿瘤。如图1C、D所示，在构建动物异种移植模型前，茯苓预处理组的肿瘤体积和重量均显著减少，且随着茯苓浓度的增加，减少程度加剧。这表明经茯苓预处理的胃癌细胞具有较弱的致瘤性和致死性，茯苓治疗有效抑制了体内胃癌的生长。
茯苓对胃癌细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用
为进一步阐明茯苓对胃癌细胞的影响，我们将茯苓与SGC-7901细胞在0、50和100 μM三个浓度梯度下共培养。如图2A所示，细胞活力随茯苓浓度的增加而逐渐降低。在500 μM 茯苓培养24小时后，GES-1细胞完全死亡。这表明高浓度茯苓具有过度的细胞毒性。因此，我们选择50和100 μM进行后续研究。同时，我们将50 μM 茯苓与SGC-7901和GES-1细胞共培养3天，细胞活力随时间逐渐降低。进一步分析茯苓对SGC-7901细胞侵袭的影响，如图2B、C所示，随着茯苓浓度的增加，细胞侵袭受到显著抑制。最后，分析了茯苓对SGC-7901细胞迁移的影响。实验结果如图2D、E所示，随着茯苓浓度的增加，细胞迁移受到显著抑制。因此，茯苓可以以浓度依赖的方式抑制SGC-7901和GES-1细胞的增殖、侵袭和迁移。
茯苓对胃癌细胞上皮-间质转化（EMT）的抑制作用
肿瘤细胞的转移与EMT相关。先前的实验表明，茯苓可以抑制胃癌细胞的迁移；因此，我们试图分析肿瘤细胞中茯苓与EMT的关系。TNF-β是一种肿瘤坏死因子，可通过诱导AKT磷酸化诱导肿瘤细胞发生EMT[13]。将SGC-7901细胞与TNF-β共培养24小时后，观察到E-钙粘蛋白表达下降和波形蛋白表达增加（图3A）。这表明细胞正在经历EMT转化，而加入茯苓后逆转了这一行为（图3B、C）。
图1 茯苓在体内外对胃癌增殖的抑制作用。A 茯苓的分子结构。B 茯苓对胃癌细胞SGC-7901形态的影响。C C57BL/6小鼠肿瘤异种移植模型的体积。D C57BL/6小鼠肿瘤异种移植模型的重量。所有实验均独立进行三次或更多次，所有结果均表示为对照组的平均值±标准差。比例尺，100 μm。*P<0.001。
图2 茯苓抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移。A 不同浓度茯苓处理下SGC-7901和GES-1细胞的活力分析。B、C 不同浓度茯苓处理下SGC-7901和GES-1细胞的代表性图像及侵袭细胞计数。D、E 不同浓度茯苓处理下SGC-7901和GES-1细胞的代表性图像及迁移率。所有实验均独立进行三次或更多次，所有结果均表示为对照组的平均值±标准差。比例尺，100 μm。*P<0.001。
图3 茯苓逆转TNF-β诱导的上皮细胞-间充质转化（EMT）。A SGC-7901细胞中E-钙粘蛋白和波形蛋白的免疫荧光染色。B E-钙粘蛋白和波形蛋白荧光强度的统计分析。C PCR分析E-钙粘蛋白和波形蛋白的表达。所有实验均独立进行三次或更多次，所有结果均表示为对照组的平均值±标准差。比例尺，25 μm。*P<0.001。
茯苓诱导胃癌细胞铁死亡
先前的实验表明，当茯苓与胃癌细胞共培养时，在明场显微镜下观察到细胞形态发生变化，包括线粒体体积减小、膜密度增加和嵴减少。这些形态变化与铁死亡现象高度一致。因此，我们进一步分析了茯苓与铁死亡之间的关系。如图4A-C所示，随着茯苓浓度的增加，细胞谷胱甘肽（GSH）和p53的表达增加，而SLC7A11和GPX4的表达减少，表明细胞中铁死亡积累。此外，活性氧（ROS）染色也支持这一结论。加入茯苓后，细胞ROS增加，而加入铁死亡抑制剂Fer-1后，细胞ROS显著减少（图4D，E）。此外，我们进行了蛋白质印迹（WB）分析，以检测铁死亡相关蛋白GPX4和SLC7A11的表达，如图4F，G所示。结果表明，茯苓处理后，GPX4和SLC7A11的表达显著减少，且这种效应可被铁死亡抑制剂逆转。这表明茯苓可以诱导细胞铁死亡，而Fer-1可以抑制这种现象。
茯苓通过诱导铁死亡抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移
为了确认茯苓通过诱导铁死亡抑制侵袭和迁移，我们将胃癌细胞与铁死亡抑制剂Fer-1和茯苓共培养。根据MTT数据，与对照组相比，与Fer-1和茯苓共培养的细胞存活率更高（图5A）。细胞划痕试验和Transwell迁移试验显示，茯苓处理的SGC-7901细胞的侵袭和迁移能力显著降低。特别是，加入Fer-1促进了细胞侵袭（图5B，C）和迁移（图5D，E）。为了进一步了解茯苓如何通过铁死亡调节细胞侵袭和迁移，我们进行了E-钙粘蛋白和波形蛋白染色。如图5F，G所示，加入Fer-1逆转了细胞中的上皮细胞-间充质转化（EMT）。这些发现表明，茯苓通过诱导铁死亡逆转EMT并抑制侵袭和迁移。
图4. 茯苓（PA）诱导胃癌细胞发生铁死亡。通过qPCR对铁死亡关键因子的表达分析：A. GSH，B. SLC7A11，C. GPX4。D. 不同浓度茯苓和Fer-1处理的胃癌（GC）细胞中ROS染色的代表性图像，E. 荧光强度的统计分析。F. 不同浓度茯苓和Fer-1处理的GC细胞的蛋白质印迹（WB）分析，G. 荧光强度的统计分析。所有实验均独立进行三次或更多次，所有结果均表示为对照组的平均值±标准差（SD）。比例尺，100 μm。*P<0.001
图5. 茯苓通过诱导铁死亡抑制胃癌（GC）细胞的增殖、侵袭和迁移。A. 50 μM 茯苓和Fer-1处理的SGC-7901细胞的活性分析。B, C. 50 μM 茯苓和Fer-1处理的SGC-7901细胞的侵袭试验代表性图像和定量分析。D, E. 50 μM 茯苓和Fer-1处理的SGC-7901细胞的迁移试验代表性图像和定量分析。F. 50 μM 茯苓和Fer-1处理的SGC-7901细胞中E-钙粘蛋白和波形蛋白的免疫荧光染色。G. 不同浓度茯苓和Fer-1处理的GC细胞中ROS强度的统计分析。所有实验均独立进行三次或更多次，所有结果均表示为对照组的平均值±标准差（SD）。比例尺，100 μm。*P<0.001
讨论
普遍认为，传统中药（TCM）具有“多成分”和“多靶点”的特点[14]。然而，TCM包含众多无效和未确定的成分，这给阐明其机制和有效成分，以及确保其质量和稳定性带来了重大挑战。因此，迫切需要开发由已确定成分组成的中药制剂[15]。
近年来，多项研究表明，从[16]中提取的茯苓是主要生物活性成分。茯苓通过多种癌症中的细胞死亡诱导和细胞增殖抑制作用，具有有效的抗肿瘤效果[17]。然而，关于茯苓在胃癌（GC）中的作用知之甚少。在本研究中，我们调查了茯苓在SGC-7901细胞系中的抗肿瘤作用。茯苓以浓度依赖性的方式显著抑制了SGC-7901细胞的增殖、侵袭和迁移。此外，我们的体内实验数据表明，茯苓可以抑制肿瘤生长，显示出其强大的抗肿瘤作用。
EMT是一种促进胚胎发育的表型转化，最初由发育生物学家描述[18]。EMT是胚胎发生过程中上皮细胞失去其连接和极性的过程，从而产生迁移的间充质细胞类型（如中胚层和神经嵴）[19, 20]。接下来，我们分析了茯苓对胃癌细胞迁移和侵袭的影响，并通过EMT途径进行了相关验证。我们的研究表明，TNF-β处理后，细胞中E-钙粘蛋白的表达减少，而波形蛋白的表达增加。这种行为可以通过添加茯苓来逆转[21]。同时，越来越多的研究表明，EMT与肿瘤转移密切相关。
越来越多的科学证据表明，癌症的发展与细胞增殖失控和细胞死亡不足密切相关。铁死亡是一种新兴的程序性细胞死亡形式，也被认为是体内清除受损和不必要细胞的常见方法[22]。诱导细胞铁死亡通常被认为是治疗各种癌症疾病的理想方法。我们的研究表明，茯苓促进铁死亡相关基因GPX4和SLC7A11的表达，并增加细胞ROS水平，而与铁死亡抑制剂和茯苓共培养可以逆转这种效应。一方面，茯苓通过激活胃癌细胞中的铁死亡来调节胃癌细胞的生长、迁移和EMT。另一方面，铁死亡抑制剂对茯苓调节效应的逆转表明茯苓与铁死亡之间存在靶向调节关系。总之，我们的数据表明，茯苓通过激活铁死亡抑制SGC-7901和GES-1细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT，为胃癌的治疗提供了新的思路和方向。
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