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摘要
民族药理学相关性：砂仁（Amomum villosum Lour.，简称AVL）是一种传统中药，广泛用于缓解妊娠呕吐和预防流产。先兆子痫（Pre-eclampsia，简称PE）是一种严重的妊娠综合征。近期研究表明，先兆子痫与消化系统之间存在相互作用。然而，砂仁对抗先兆子痫的作用是否与肠道有关尚不确定。
研究目的：本研究旨在探讨砂仁对先兆子痫的治疗作用及其基于肠-胎盘轴的潜在机制。
材料与方法：将砂仁用水煎煮提取水煎液（Water Decoction of AVL，简称WOA），然后通过冷冻干燥将煎液转化为干燥颗粒。建立NG-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）诱导的先兆子痫小鼠模型，并评估WOA的预防作用。此外，采用16S rRNA基因测序分析肠道微生物的组成和结构。进行粪便微生物移植（Fecal Microbiota Transplantation，简称FMT）实验，以验证WOA重塑肠道微生物群的功效。
结果：WOA对先兆子痫表现出保护作用。值得注意的是，WOA显著降低了母体高血压和尿蛋白水平，并以剂量依赖性的方式促进胎儿宫内生长，从而改善了不良妊娠结局。此外，WOA通过降低可溶性fms样酪氨酸激酶1（sFlt-1）与胎盘生长因子（PlGF）的比率来调节血管生成失衡，以修复胎盘损伤，并通过提高铁蛋白1（FTH1）、膜铁转运蛋白1（FPN1）、胱氨酸/谷氨酸转运体（xCT）和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的蛋白水平来抑制胎盘铁死亡。WOA显著上调了胎盘和结肠中的紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin、Claudin1），从而增强了胎盘和肠道屏障。WOA通过富集双歧杆菌（Bifidobacterium）和阿克曼氏菌（Akkermansia）来纠正肠道菌群失调。粪便微生物移植实验显示，WOA对胎盘和肠道的保护作用依赖于肠道微生物的组成。此外，同时补充双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum，简称B. bifidum）和香草酸（Vanillic Acid，简称VA，WOA的主要成分）可改善先兆子痫症状。有趣的是，体内和体外分析结果均表明，VA可富集B. bifidum菌群。
1. 引言
先兆子痫（Pre-eclampsia，简称PE）是一种严重的妊娠并发症，其特征为妊娠20周后新发的高血压和蛋白尿，并且是母婴死亡率的主要原因之一（Mol et al., 2016）。全球范围内，先兆子痫的发生率约为2%–8%，对母婴健康构成重大风险。先兆子痫患者更易患中风、心血管疾病和糖尿病，而胎儿则更易出现早产、宫内生长受限、胎盘早剥和死亡（Dimitriadis et al., 2023）。根据《中国妊娠期高血压疾病诊治指南（2020）》（妊娠期高血压疾病学组与中华医学会妇产科学分会，2020）的指导，先兆子痫的对症治疗包括使用口服抗高血压药物控制血压，以及通过静脉注射硫酸镁减少抽搐和痉挛。在药物治疗无法控制先兆子痫病理过程的情况下，应立即终止妊娠以避免不良妊娠结局（Poon et al., 2019; Rana et al., 2019）。因此，寻找安全有效的预防和治疗先兆子痫的方法仍是临床上亟待解决的挑战。
胎盘在先兆子痫的进展中起着至关重要的作用，其受到多种病理因素的影响。根据广泛接受的先兆子痫两阶段模型，胎盘功能障碍是主要原因（Roberts and Hubel, 2009; Staff, 2019）。先兆子痫发生时，由于胎盘滋养细胞浸润不足，子宫螺旋动脉发生异常重构，导致子宫螺旋动脉狭窄。子宫螺旋动脉的狭窄导致胎盘缺血缺氧，进而引起异常形态发生，最终导致胎盘功能障碍。为了补偿子宫螺旋动脉的异常重构，母体血管收缩，试图增加血压并驱动更多血液流向胎盘，从而导致母体高血压。此外，功能失调的胎盘释放多种生物活性化合物，包括抗血管生成因子、炎性细胞因子和脂质过氧化物。这些物质进入母体血液，导致内皮功能障碍和炎症反应，损害血管的正常收缩和舒张活动，进而减少各器官的血液供应（Redman and Sargent, 2009; Simas et al., 2014; Yuan et al., 2005）。特别是，肾脏血液供应减少导致肾小球滤过膜通透性增加，允许本应保留在血液中的蛋白质渗入尿液，最终导致蛋白尿（Bartal et al., 2022）。同时，胎盘功能障碍会损害母体向胎儿的营养传递，导致宫内生长受限，并增加新生儿呼吸窘迫综合征和支气管肺发育不良的风险（Dimitriadis et al., 2023; Hansen et al., 2010; Wang et al., 2012）。除了经典的两阶段模型理论外，近期研究表明，先兆子痫患者循环铁浓度显著升高，可触发胎盘铁死亡（Liu et al., 2019a; Yang et al., 2023; Yang et al., 2022; Zhang et al., 2020a）。Beharier等人的早期报告（2020）表明，铁死亡信号通路的激活导致胎盘滋养细胞功能障碍。相反，抑制铁死亡可显著减少胎盘脂质毒性损伤并缓解先兆子痫症状（Yang et al., 2022）。这些研究表明，抑制胎盘铁死亡对于保护胎盘功能至关重要，并可作为治疗胎盘功能障碍（如先兆子痫）的一种疗法。
临床研究已记录先兆子痫患者存在肠道菌群失调（Chen et al., 2020b）。在早期的体内研究中，接受先兆子痫患者粪便菌群移植（FMT）的大鼠病理和症状显著加重，而接受健康孕妇肠道菌群的大鼠则表现出显著的保护作用（Jin et al., 2022），这明确表明肠道细菌在先兆子痫进展中起着关键作用。与此发现一致，有益菌罗伊氏乳杆菌通过改善肠道失调和内皮功能障碍，在小鼠模型中缓解了先兆子痫症状（Li et al., 2023）。除了肠道微生物的直接影响外，其代谢产物也参与调节先兆子痫。例如，肠道微生物分泌的短链脂肪酸（SCFA）据报道可增强先兆子痫小鼠的胎盘生长和血管化（Jin et al., 2022; Pronovost et al., 2023）。三甲胺N-氧化物（TMAO）通过调节炎症和氧化应激相关信号通路，影响血管内皮细胞的迁移和血管生成，以及滋养细胞的迁移和侵袭，从而促进先兆子痫的进展（Wang et al., 2024）。鉴于这些综合结果，关注肠道菌群为管理先兆子痫提供了一种创新策略。
砂仁（Amomum villosum Lour.，简称AVL）是中国的一种“南药”和“药食同源”草药，据报道对孕妇使用安全（Zhao et al., 2021）。砂仁具有多种功能，包括保肝、抗肿瘤、治疗胃肠道疾病和缓解妊娠呕吐（Feng et al., 2024; Luo et al., 2022; Wei et al., 2024）。砂仁的药理作用包括抗炎、抗菌、抗氧化和抗高脂血症（Kim et al., 2020, 2022; Tang et al., 2020; Yan et al., 2015）。根据《中华人民共和国药典》（2020年版），砂仁传统上用于治疗湿邪（huashi）和增进食欲（kaiwei）、温脾（wenpi）和止泻（zhixie），以及调气（liqi）和预防流产（antai）（委员会，2020）。值得注意的是，预防流产功能有助于保护妊娠期间免受各种不利因素的影响，确保女性健康，促进胎儿生长和发育，并预防胎儿死亡。临床上，砂仁的中国专利药物，如保胎丸和孕康合剂，广泛用于妊娠呕吐治疗和预防流产。然而，砂仁作为单一中药对先兆子痫的影响尚未确定。本研究集中于砂仁对先兆子痫的保护作用，并确定了肠-胎盘轴为潜在的目标通路。我们的发现丰富了砂仁预防流产的现有知识库，并突出了砂仁在临床治疗先兆子痫中的新潜在方法。
2. 材料与方法
2.1. 试剂与化学品
砂仁（Amomum villosum Lour.）由中国深圳市药品检验所的苏畅博士提供并鉴定。表儿茶素、香草酸、白藜芦醇苷和异槲皮苷均来自中国食品药品检定研究院。NG-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）购自MedChemExpress（HY-18729A，美国）。
2.2. WOA的制备与特性分析
使用前将砂仁粉碎，并浸泡在蒸馏水中30分钟。然后，用沸水重复提取三次并过滤以获得滤液。将滤液合并作为砂仁水煎液（WOA）。为了质量控制，我们使用高效液相色谱（HPLC）对表儿茶素、香草酸、白藜芦醇苷和异槲皮苷进行定量。这些化合物的浓度分别为3.15、11.73、1.13和0.38 mg/mL。（方法见补充表1和图S1）。
2.3. 动物
雌性和雄性C57BL/6小鼠购自生物技术有限公司（SCXK，2019-0010，中国），并在标准光照和黑暗周期条件（12小时：12小时，25°C）下饲养。所有动物研究均获得南方医科大学动物伦理关怀委员会的批准（SMUL202404008）。
2.4. 动物实验
L-NAME诱导的先兆子痫小鼠模型如先前所述（Huang et al., 2022）。简而言之，经过一周的适应期后，雄性小鼠与雌性小鼠以1:2的比例过夜配对。有阴道栓的雌性小鼠被视为怀孕，并将这一天指定为妊娠第0天（GD0）。从GD9到GD18，小鼠每天皮下注射125 mg/kg/d的L-NAME，并在GD18处死。
WOA口服给药实验。将妊娠小鼠随机分为六组（每组n=6）：（1）正常妊娠组（NP）；（2）先兆子痫组（PE）；（3）低剂量WOA组（WOA-L）；（4）中剂量WOA组（WOA-M）；（5）高剂量WOA组（WOA-H）；（6）拉贝洛尔组（Labetalol）。除NP组小鼠外，其他组小鼠从GD9到GD18每天皮下注射L-NAME。NP组和PE组小鼠每天灌胃生理盐水18天。WOA-L、WOA-M和WOA-H组小鼠分别每天灌胃130、260和520 mg/kg的WOA。Labetalol组小鼠每天灌胃20 mg/kg的拉贝洛尔。所有干预措施每天进行一次，持续18天。小鼠在GD18处死。WOA的给药剂量基于《中国药典》推荐的砂仁临床剂量（委员会，2020），并根据Chen等人的方法进行调整（Chen et al., 2018）。
肠道菌群移植（FMT）实验。从高剂量WOA组小鼠（供体）收集粪便，用PBS重悬至125 mg/mL。然后，将混合物离心并收集上清液用于菌群移植。将妊娠小鼠随机分为三组（每组n=6）：（1）正常妊娠组（NP）；（2）先兆子痫组（PE）；（3）FMT-WOA-H组（FMT-WOA-H）。除NP组小鼠外，其他组小鼠从GD9到GD18每天皮下注射L-NAME。NP组和PE组小鼠每天灌胃生理盐水18天。FMT组小鼠接受为期五天的抗生素（ABX）治疗（万古霉素100 mg/kg，硫酸新霉素200 mg/kg，甲硝唑200 mg/kg和氨苄西林200 mg/kg）以消除肠道微生物群（Jin et al., 2022）。随后，每天口服WOA-H供体粪便10天。小鼠在GD18处死。
双歧杆菌双歧亚种（B. bifidum）补充实验。将妊娠小鼠随机分为三组（每组n=6）：（1）正常妊娠组（NP）；（2）先兆子痫组（PE）；（3）B. bifidum组（B. bifidum）。除NP组小鼠外，其他组小鼠从GD9到GD18每天皮下注射L-NAME。NP组和PE组小鼠每天灌胃生理盐水18天。B. bifidum组小鼠每天灌胃200 μL的B. bifidum（1×10^8 CFU/mL）18天。小鼠在GD18处死。
香草酸（VA）干预实验。将妊娠小鼠随机分为四组（每组n=6）：（1）正常妊娠组（NP）；（2）香草酸正常妊娠组（NPVA）；（3）先兆子痫组（PE）；（4）香草酸先兆子痫组（PEVA）。除NP和NPVA组小鼠外，PE和PEVA组小鼠从GD9到GD18每天皮下注射L-NAME。NP组和PE组小鼠每天灌胃生理盐水18天。NPVA组和PEVA组小鼠每天口服70 mg/mL的VA（阿拉丁，中国）18天（Kumar et al., 2014a）。小鼠在GD18处死。最后，收集血液并在8000 rpm和4°C下离心10分钟以分离血清。分别解剖并称重胎儿和胎盘。将血清和组织保存在-80°C。
2.5. 血压测量
使用无创BP-2010A仪器（Softron生物技术，北京，中国）在GD0、4、8、10、12、14和16测量收缩压（SBP）。
2.6. 苏木精和伊红（H&E）染色和免疫组织化学（IHC）分析
H&E染色和IHC分析如先前所述进行（Huang et al., 2022）。胎盘和结肠均使用ZO-1、Occludin和Claudin-1抗体（Abmart，中国）进行孵育。使用Image-Pro Plus 6.0软件（Media Cybernetics Inc.，美国）分析平均光密度。
2.7. 实时定量PCR（RT-qPCR）
使用动物总RNA分离提取和纯化试剂盒（Foregene Co.，Ltd.）进行总RNA提取。使用天根粪便DNA提取试剂盒进行粪便DNA提取。使用HiScript III All-in-one RT SuperMix（Vazyme生物技术有限公司，中国）将mRNA逆转录为cDNA。所有qPCR均使用HiScript II Q RT SuperMix（Vazyme生物技术有限公司，中国）在LightCycler480（罗氏诊断国际，瑞士）上进行。引物信息列于补充表3。
2.8. 蛋白质印迹分析
使用RIPA缓冲液（美仑生物，中国）对胎盘样品进行裂解。胎盘蛋白质通过10% SDS-PAGE分离，然后转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore，Billerica，MA，美国）。使用5%脱脂牛奶封闭1小时后，将膜与一系列一抗孵育过夜，随后在室温下与二抗孵育1小时。使用凝胶成像系统（FluorChem R，ProteinSimple，San Jose，CA，美国）扫描膜。使用ImageJ软件评估条带强度。抗体列于补充表4。
2.9. 酶联免疫吸附测定（ELISA）
小鼠尿蛋白（UP）ELISA试剂盒、血管内皮生长因子（VEGF）ELISA试剂盒、胎盘生长因子（PlGF）ELISA试剂盒、可溶性fms样酪氨酸激酶-1（sFlt-1）ELISA试剂盒和脂多糖（LPS）ELISA试剂盒均购自江苏美联生物工业有限公司。谷胱甘肽（GSH）ELISA试剂盒和丙二醛（MDA）ELISA试剂盒均购自Elabscience®生物技术有限公司。小鼠白介素-6（IL-6）ELISA试剂盒和肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA试剂盒均购自美联生物（中国）。每个ELISA试剂盒均根据制造商提供的规格进行评估。
2.10. 16S rRNA基因测序
从所有组小鼠收集粪便样本。使用ABI GeneAmp 9700 PCR热循环仪扩增细菌16S rRNA基因。接下来，使用实时定量PCR扩增16S rRNA基因的V3-V4区域。测序使用Illumina MiSeq（PE300）进行，数据分析由迈杰生物公司处理。随后，使用UPARSE 11将精炼的序列聚类为操作分类单元（OTUs）。对于每个OTU，选择出现频率最高的序列作为代表序列。使用16S rRNA基因数据库（如Silva v138）对代表序列进行分析，置信阈值为0.7。使用Mothur V.1.30.2基于OTUs信息计算α多样性。然后进行主成分分析（PCA）以计算微生物相对丰度的相似性。使用线性判别分析效应大小（LEfSe）发现物种分类分析中的生物标志物。通过STAMP V2.1.3软件使用系统发育未观测状态重建（PICRUSt）分析。
2.11. 细菌培养
双歧杆菌双歧亚种（B. bifidum，ATCC 29521）在BBL肉汤培养基（山东拓普生物工程有限公司，Cat# M1409，中国）中厌氧条件下（10% H2，10% CO2，80% N2，37°C）培养。
2.12. 体外厌氧培养
收集PE组小鼠的粪便样本，并按照描述进行培养（Gu et al., 2018; Li et al., 2021; Sun et al., 2023）。将粪便样本（1.0 g）悬浮于10 mL无菌厌氧PBS中，通过离心获得细菌沉淀物，并重新悬浮于无菌厌氧PBS中。随后，在厌氧条件下（37°C，140 rpm）孵育以激活细菌。接下来，将粪便接种物在含有5 mg/mL香草酸（VA）或不含VA的培养基中厌氧条件下孵育。孵育0、12和24小时后，将培养样本在8000 rpm和4°C下离心10分钟，然后收集离心沉淀物进行DNA提取和检测。
2.13. 统计分析
使用IBM SPSS Statistics 25进行统计分析。数据表示为均值±标准差（SD）。使用Student's t检验评估组间均值的差异。对于多重比较，采用单因素方差分析（ANOVA）后进行Bonferroni事后检验。显著性差异设为p < 0.05，p < 0.01和p < 0.001。
3. 结果
结果1. WOA灌胃缓解了PE小鼠的PE症状及不良妊娠结局
为了探究WOA在缓解PE方面的疗效，我们对L-NAME诱导的PE小鼠模型进行了低、中、高剂量的WOA干预（图1A）。L-NAME干预后，与NP组相比，PE组小鼠的SBP显著进行性升高（图1B），且在GD18时尿蛋白浓度显著升高（图1C），表明PE小鼠模型已成功建立。与PE组相比，WOA-L、WOA-M、WOA-H和拉贝洛尔治疗后，SBP和尿蛋白均显著降低，特别是WOA-H干预效果最佳（图1B和C）。这表明WOA以剂量依赖的方式降低了SBP和尿蛋白水平。此外，我们还使用胎盘重量和胎儿重量来评估PE小鼠的不良妊娠结局。与NP组小鼠相比，PE组小鼠的胎盘和胎儿重量较低，表明PE导致不良妊娠结局（图1E和F）。然而，经过WOA-L、WOA-M、WOA-H和拉贝洛尔治疗后，胎盘重量显著高于PE组（图1E）。WOA-M和WOA-H组在干预后能够显著增加胎儿重量，使其恢复到与NP组相同的水平（图1D–F）。使用胎儿-胎盘重量比来反映胎盘效率。与NP组相比，PE组的该比例显著降低，表明PE导致胎盘效率低下（图1G），而这种效率低下可以通过WOA-H干预逆转，恢复到与健康妊娠小鼠相同的胎盘效率水平。综上所述，我们发现高剂量WOA是缓解PE小鼠PE症状及不良妊娠结局最有效的剂量。因此，在后续实验中评估了WOA-H。
结果2. WOA缓解了PE小鼠的血管生成失衡
功能失调的胎盘与血管生成失衡相关（Burwick and Rodriguez, 2024）。为了探究WOA对PE小鼠胎盘和血管生成状态的影响，我们分析了胎盘的结构改变以及胎盘和血清中的血管生成因子。首先，观察了胎盘的组织形态学变化（图2A）。与NP组相比，PE组胎盘的迷路区和交界区比例较高。然而，WOA-H干预后，这一比例增加被逆转，表明WOA-H减轻了PE对胎盘结构的损伤（图2B）。然后，评估了关键促血管生成因子如血管内皮生长因子（VEGF）和胎盘生长因子（PlGF），以及抗血管生成因子如可溶性fms样酪氨酸激酶-1（sFlt-1）的水平，以评估血管生成状态。与NP组相比，PE组小鼠胎盘mRNA水平的Vegf和Plgf显著失调，而sFlt-1水平显著升高（图2C）。在WOA-H组中，胎盘Vegf和Plgf的表达显著增加，而sFlt-1的表达显著降低（图2C）。血清样本中也观察到血管生成失衡，但这种失衡可以被WOA-H干预逆转（图2D–F）。此外，与NP组相比，PE组中sFlt-1与PlGF的比率升高，临床上用于评估PE风险。有趣的是，WOA-H干预显著降低了该比率，且与NP组无显著差异（图2G）。这些发现证明，WOA-H减轻了PE对胎盘结构的损伤，并缓解了PE小鼠的血管生成失衡。
结果3. WOA抑制了PE小鼠的胎盘铁死亡
铁死亡可导致胎盘功能障碍，可能有助于PE的发病（Shan et al., 2023）。为了评估WOA的预防作用是否与胎盘铁死亡相关，我们研究了胎盘组织中的铁死亡相关标志物。与NP组相比，PE组胎盘mRNA水平的Fpn1、Fth1、Xct和Gpx4显著失调，这表明PE小鼠胎盘中铁死亡的激活。然而，WOA-H给药显著逆转了铁死亡相关因子的下调（图3A–D）。有趣的是，血清中的VEGF、PlGF和sFlt-1与胎盘中的铁死亡相关因子（Fpn1、Fth1、Xct和Gpx4）呈显著正相关（图3E–G），这表明PE小鼠中胎盘铁死亡与血管生成失衡密切相关。此外，与NP组相比，PE组小鼠胎盘中的FPN1、FTH1、xCT和GPX4蛋白水平显著降低，但WOA-H干预后这些蛋白水平显著恢复（图3H和I）。铁死亡的特征是Fe2+促进的脂质过氧化增加。与NP组小鼠相比，PE组小鼠胎盘中的Fe2+浓度较高，但WOA-H干预后可降低至健康妊娠水平（图3J）。还评估了胎盘和血清中的谷胱甘肽（GSH）水平和脂质过氧化标志物丙二醛（MDA）水平。与NP组小鼠相比，PE组小鼠胎盘和血清中的MDA水平显著升高，而GSH水平显著降低。然而，WOA-H治疗显著降低了MDA水平，并显著增加了血清和胎盘中的GSH表达（图3K–N）。值得注意的是，WOA-H组血清和胎盘中的GSH水平均高于NP组（图3M和N）。这些数据表明，WOA-H改善了铁代谢失衡，逆转了细胞内抗氧化剂的耗竭，并抑制了PE小鼠的脂质过氧化。综上所述，WOA-H通过抑制胎盘铁死亡来保护PE小鼠的胎盘功能。
结果4. WOA增强了PE小鼠的胎盘和肠道屏障
胎盘是连接母体和胎儿的关键器官，具有交换营养物质和抵抗来自母体有害物质的功能，以支持胎儿发育。在PE的病理过程中，异常胎盘形成会导致炎症反应；反过来，胎盘炎症会通过破坏紧密连接导致胎盘屏障功能丧失（Fisher, 2015a; Tossetta et al., 2014a; Ward et al., 2023）。为了验证WOA对PE的保护作用是否与胎盘屏障相关，我们检查了胎盘中的炎症和紧密连接蛋白。首先，与NP组相比，PE组胎盘中促炎细胞因子（Il-1β、Il-6和Tnf-α）的mRNA水平较高。然而，WOA-H补充显著降低了这些水平（图4A）。与NP组相比，PE组血清中的TNF-α和IL-6水平显著升高，而WOA给药抑制了这种升高（图4B，图S2A）。这些结果表明，WOA-H补充可以改善PE小鼠的胎盘炎症。然后，我们评估了胎盘中紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin和Claudin-1）的含量。与NP组相比，PE组胎盘中紧密连接蛋白的mRNA水平显著降低，表明PE破坏了胎盘屏障的完整性，但WOA-H修复了这种损伤（图4C）。此外，免疫组织化学分析得出了相同的结果（图4E和F）。综上所述，这些发现表明，WOA-H通过增加胎盘屏障的完整性来保护胎盘结构。
母体营养物质通过肠道吸收进入循环，并通过胎盘传递给胎儿。接着，我们评估了WOA-H对PE小鼠肠道的影响。与NP组相比，PE组结肠中Il-1β、Il-6和Tnf-α的mRNA水平显著升高，表明PE小鼠存在肠道炎症。重要的是，WOA-H治疗后肠道炎症得到缓解（图4A）。肠道炎症导致屏障损伤，增加屏障通透性，使肠道微生物产生的有害物质进入循环。我们发现，与NP组相比，PE组血清中的脂多糖（LPS）水平持续升高，而WOA-H干预使LPS水平恢复到正常妊娠水平（图4D）。这一发现表明，WOA-H降低了肠道屏障通透性，从而保护了肠道屏障功能（图4D）。在结肠中，与NP组相比，PE组Zo-1、Occludin和Claudin-1的mRNA水平确实降低，但在WOA-H组中升高（图4C）。免疫组织化学分析得出了相同的结果（图4G和H），这与胎盘中的观察结果一致。值得注意的是，胎盘和结肠中的ZO-1、Occludin和Claudin-1具有显著正相关，表明肠-胎盘轴可能参与PE的改善（图S3A–C）。综上所述，WOA-H给药增强了PE小鼠的胎盘和肠道屏障，并减轻了炎症反应。
图1. WOA灌胃缓解了PE小鼠的PE症状及不良妊娠结局
(A) 动物实验示意图：本实验设计用于评估砂仁水煎液（WOA）对L-NAME诱导的先兆子痫（PE）小鼠模型的影响。(B) 各组小鼠收缩压（SBP）测量结果：无创测量各组小鼠的收缩压。与NP组相比，PE组在相应日期的SBP显著升高（aaa，p < 0.001）。与PE组相比，WOA-L组在相应日期的SBP显著降低（bb，p < 0.01；bbb，p < 0.001）。与PE组相比，WOA-M组在同一天的SBP显著降低（c，p < 0.05；ccc，p < 0.001）。与PE组相比，WOA-H组在相应日期的SBP显著降低（ddd，p < 0.001）。与PE组相比，拉贝洛尔组在相应日期的SBP显著降低（eee，p < 0.001）。(C) GD18时各组小鼠的尿蛋白浓度：测量GD18时各组小鼠的尿蛋白浓度。(D–G) 胎盘重量、胎儿重量和胎儿-胎盘重量比：与NP组相比，PE组的胎盘重量（D）、胎儿重量（E）和胎儿-胎盘重量比（G）显著降低（a，p < 0.05；aa，p < 0.01；aaa，p < 0.001）。与PE组相比，WOA-L组的胎盘重量和胎儿-胎盘重量比显著增加（b，p < 0.05；bb，p < 0.01），但胎儿重量无显著差异。与PE组相比，WOA-M组的胎盘重量、胎儿重量和胎儿-胎盘重量比均显著增加（c，p < 0.05；cc，p < 0.01；ccc，p < 0.001）。与PE组相比，WOA-H组的胎盘重量、胎儿重量和胎儿-胎盘重量比均显著增加（ddd，p < 0.001）。与WOA-L组相比，WOA-M组的胎盘重量和胎儿重量显著增加（d，p < 0.05；dd，p < 0.01），但胎儿-胎盘重量比无显著差异。与WOA-M组相比，WOA-H组的胎盘重量、胎儿重量和胎儿-胎盘重量比均无显著差异。注：对于(A–G)，每组n=6。数据表示为均值±标准差（SD）。SBP，收缩压；NP，正常妊娠；PE，先兆子痫；WOA，砂仁水煎液（Amomum villosum Lour.）。
图2. WOA缓解了PE小鼠的血管生成失衡
(A–B) 胎盘组织H&E染色代表性图像及组织形态学分析：取小鼠胎盘组织的中矢状面切片进行H&E染色，用于组织形态学分析（n=3）。图中标记了迷路区和交界区（原始放大倍数，×25；比例尺，1 mm）。(C) 胎盘中Vegf、Plgf和sFlt-1的相对mRNA水平：测量各组小鼠胎盘中Vegf、Plgf和sFlt-1的相对mRNA水平（n=6）。(D–F) 血清中VEGF、PlGF和sFlt-1的水平：测量各组小鼠血清中VEGF、PlGF和sFlt-1的浓度。(G) sFlt-1与PlGF的比率：计算各组小鼠血清中sFlt-1与PlGF的比率。注：对于(D–G)，每组n=6。数据表示为均值±标准差（SD）。P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，由单因素方差分析（ANOVA）检验得出。
图3. WOA抑制了PE小鼠的胎盘铁死亡
(A–D) 胎盘中Fpn1、Fth1、Xct和Gpx4的相对mRNA水平：测量各组小鼠胎盘中Fpn1、Fth1、Xct和Gpx4的相对mRNA水平。(E–G) 血清中VEGF、PlGF和sFlt-1水平与胎盘中Fpn1、Fth1、Xct和Gpx4相对mRNA水平的相关性分析：使用皮尔逊相关系数分析血清中VEGF、PlGF和sFlt-1水平与胎盘中Fpn1、Fth1、Xct和Gpx4相对mRNA水平之间的相关性。(H–I) 胎盘中FPN1、FTH1、XCT和GPX4的代表性Western blot条带及相对密度分析结果：通过Western blot检测各组小鼠胎盘中FPN1、FTH1、XCT和GPX4的蛋白表达，并进行相对密度分析（n=3）。(J) 各组胎盘中的Fe²⁺浓度：测量各组小鼠胎盘中的Fe²⁺浓度。(K–N) 各组血清和胎盘中的MDA和GSH浓度：测量各组小鼠血清和胎盘中的丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）浓度。注：对于(A-D, J-N)，每组n=6；对于(H–I)，每组n=3。数据表示为均值±标准差（SD）。P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，由单因素方差分析（ANOVA）检验得出。
图4. WOA增强了PE小鼠的胎盘和肠道屏障
(A) 胎盘和结肠中Il-1β、Il-6和Tnf-α的相对mRNA水平：测量各组小鼠胎盘和结肠中Il-1β、Il-6和Tnf-α的相对mRNA水平。(B) 血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的水平：测量各组小鼠血清中TNF-α的浓度。(C) 胎盘和结肠中Zo-1、Occludin和Claudin-1的相对mRNA水平：测量各组小鼠胎盘和结肠中Zo-1、Occludin和Claudin-1的相对mRNA水平。(D) 血清中脂多糖（LPS）的水平：测量各组小鼠血清中LPS的浓度。(E–H) 胎盘和结肠中ZO-1、Occludin和Claudin-1的免疫组织化学染色代表性图像：对各组小鼠胎盘和结肠进行ZO-1、Occludin和Claudin-1的免疫组织化学染色（原始放大倍数，×400；比例尺=50 μm），并使用Image-Pro Plus软件测量ZO-1、Occludin和Claudin-1的平均光密度。注：对于(A–D)，每组n=6；对于(E–H)，每组n=3。数据表示为均值±标准差（SD）。P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，由单因素方差分析（ANOVA）检验得出。
图5. WOA改善了PE小鼠的肠道菌群失调
(A–B) Shannon指数和Simpson指数：分析各组小鼠肠道菌群的α多样性，以Shannon指数和Simpson指数表示。(C) 基于Bray-Curtis距离的PCA分析：对各组小鼠的肠道菌群进行主成分分析（PCA），以评估菌群结构的相似性。(D–E) 门和属水平的相对丰度：展示各组小鼠肠道菌群在门和属水平的相对丰度。(F) LEfSe分析：通过线性判别分析效应大小（LEfSe）分析，识别各组在属水平的微生物生物标志物。(G–H) 双歧杆菌和阿克曼氏菌的相对丰度：展示各组小鼠肠道菌群中双歧杆菌和阿克曼氏菌的相对丰度。(I) KEGG通路分析预测的差异显著途径：根据京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析，预测PE组和WOA-H组之间丰度差异显著的途径。(J) 改变的肠道菌群与疗效参数之间的Spearman相关性分析：分析各组小鼠改变的肠道菌群与疗效参数（如SBP、尿蛋白浓度、胎盘重量等）之间的Spearman相关性（n=6）。注：P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，由Kruskal-Wallis检验得出。
结果5. WOA改善了PE小鼠的肠道菌群失调
先兆子痫（PE）患者的肠道微生物群处于失调状态，并有助于疾病的发病。为了探究WOA对PE小鼠肠道菌群的影响，我们进行了16S rRNA基因测序分析。首先，我们分析了α多样性以评估物种的丰富度和多样性。反映物种丰富度的Chao指数和Ace指数在PE组显著高于NP组，但在WOA-H组中降低（图S4A–B）。反映物种多样性的Shannon指数和Simpson指数在WOA-H组显著低于NP组和PE组（图5A和B）。然后，主成分分析（PCA）显示，PE组肠道微生物群的构建与NP组和WOA组存在显著差异（图5C）。为了明确各组肠道微生物群的组成和结构，我们在门和属水平进行了进一步分析。在门分类水平上，小鼠中前5位的微生物群为芽孢杆菌门（Bacillota）、放线菌门（Actinobacteriota）、脱硫杆菌门（Desulfobacterota）、拟杆菌门（Bacteroidota）和疣微菌门（Verrucomicrobiota）（图5D）。在属分类水平上，与NP组相比，PE组中金黄色葡萄球菌（Staphylococcus）和毛螺菌属（Lachnoclostridium）的相对丰度较高；双歧杆菌（Bifidobacterium）和阿克曼氏菌（Akkermansia）的相对丰度显著降低，但WOA-H治疗后显著恢复了这些菌群的丰度至NP组水平（图5E）。我们进一步进行了线性判别分析效应大小（LEfSe）分析，以在属水平上识别微生物生物标志物来区分不同组（图5F）。作为病原体或机会性病原体的Christensenellaceae_R-7_group和Candidatus_Stoquefichus在PE组中确实较高（图S4C–D）。然而，WOA-H补充导致双歧杆菌和阿克曼氏菌的增加，这两种菌被认为是短链脂肪酸（SCFA）产生菌（图5G和H）。接下来，我们整合了每组特征最相关的8个分类群来计算微生物失调指数（MDI），以评估微生物失调的程度。与NP组相比，PE组的MDI显著升高，但WOA-H补充后这种效应被逆转（图S4E），表明PE小鼠存在肠道微生物失调，但WOA干预逆转了这种失调。
我们进行了Spearman相关性分析，以评估肠道微生物丰度与PE相关参数之间的关联，包括PE症状、血管生成因子和胎盘及肠道屏障特征（图5J）。Christensenellaceae_R-7_group和Candidatus_Stoquefichus与SBP、sFlt-1/PlGF比率和LPS呈显著正相关。然而，双歧杆菌和阿克曼氏菌与SBP和sFlt-1/PlGF比率呈负相关。这些发现表明，WOA在PE小鼠中的增强作用与有益菌的存在呈正相关，而与有害菌的存在呈负相关（图5J）。肠道微生物群组成的改变总是伴随着生理功能的变化。因此，我们进行了PICRUSt分析，以预测基因组水平上的微生物生理功能。使用京都基因与基因组百科全书（KEGG）注释和功能富集，我们确定了PE组和WOA-H组之间表现出不同富集水平的18个功能类别（图5I）。具体而言，与PE病理相关的铁死亡相关功能通路在PE组中显著增强。此外，WOA-H组显著增强了与营养代谢相关的微生物功能，如嘌呤代谢、淀粉和蔗糖代谢以及赖氨酸生物合成（图5I）。综上所述，这些结果支持WOA改善了PE小鼠的肠道菌群失调，并且WOA的效果可能与其益生元功能有关。
结果6. 移植WOA小鼠的肠道菌群缓解了PE小鼠的症状和血管生成失衡
为了确认WOA对PE的有益影响是否通过肠道菌群介导，我们进行了粪便菌群移植（FMT）实验（图6A）。与PE组相比，FMT-WOA-H组小鼠的SBP和蛋白尿水平显著降低（图6B和C），胎盘重量、胎儿重量和胎儿-胎盘重量比显著增加（图6D–G）。这些结果表明，FMT干预改善了母体PE症状，促进了胎儿生长，并提高了胎盘效率。同时，在FMT组中，与PE组相比，胎盘的迷路区和交界区比例增加（图6H和I），表明FMT干预减轻了PE对胎盘结构的损伤。然后，我们探讨了WOA调节的肠道菌群对PE小鼠血管生成因子的影响。与PE组相比，FMT-WOA-H组血清中的VEGF和PlGF水平显著升高，而血清中的sFlt-1和sFlt-1/PlGF比率显著降低（图6J–M），表明FMT缓解了PE小鼠的血管生成失衡。此外，FMT-WOA-H组血清中的LPS水平较PE组显著降低（图6N），表明FMT有效降低了肠道通透性。综上所述，FMT干预减轻了PE小鼠的表型，改善了不良妊娠结局，减轻了胎盘损伤，并逆转了血管生成失衡。这些结果表明，肠道菌群在WOA缓解PE的过程中发挥了重要的上游作用。
结果7. 补充双歧杆菌双歧亚种减轻了PE小鼠的症状
我们观察到WOA干预后益生菌双歧杆菌显著富集。进一步确定，是双歧杆菌双歧亚种（B. bifidum）在WOA-H组小鼠的胎儿中富集（图7A）。然后，为了探究B. bifidum对PE的缓解作用，我们对L-NAME诱导的PE小鼠补充了B. bifidum（图7B）。与PE组相比，补充B. bifidum后，SBP和尿蛋白水平显著降低（图7C和D），胎盘重量、胎儿重量和胎儿-胎盘重量比显著增加，这表明B. bifidum能够减轻PE表型、改善不良妊娠结局并提高胎盘效率（图7E–H）。与PE组相比，B. bifidum组胎盘的迷路区与交界区比例降低，表明B. bifidum能够逆转PE对胎盘结构的损伤（图7I和J）。评估了关键血管生成因子以评估胎盘的血管生成状态。与PE组相比，B. bifidum组胎盘中的Vegf和Plgf表达显著上调，而sFlt-1表达显著下调（图7K），支持B. bifidum干预恢复了胎盘的血管生成失衡。我们还发现，与PE组相比，B. bifidum组胎盘中铁死亡相关标志物（Fpn1、Fth1、Xct和Gpx4）的mRNA水平显著上调（图7K）。此外，与NP组相比，PE组胎盘中的Fe2+水平升高，GSH水平降低，而补充B. bifidum后这些变化被逆转（图7L和M）。这些发现表明，B. bifidum通过抑制胎盘铁死亡来保护PE小鼠的胎盘功能。因此，补充B. bifidum通过减轻母体症状、改善不良妊娠结局、减轻胎盘损伤、逆转血管生成失衡和抑制胎盘铁死亡来减轻PE小鼠的症状。
结果8. 香草酸富集B. bifidum以缓解PE小鼠的症状
为了探究WOA中哪种成分对PE具有保护作用，我们分析了WOA的组成（图S1和补充表2）。其中，香草酸（VA）是最重要的成分（含量为11.73 mg/mL）。首先，我们证实了在厌氧条件下，与单独在培养基中培养的肠道微生物相比，VA确实促进了PE组小鼠新鲜粪便中B. bifidum的生长（图8A）。在体外共培养12小时后，与单独在培养基中培养的肠道微生物相比，VA共培养的肠道微生物中B. bifidum的表达确实上调（图8B）。补充VA后（图8C），正常妊娠小鼠未观察到不良影响；但PE小鼠的SBP和尿蛋白水平显著降低（图8D和E），胎盘重量、胎儿重量和胎儿-胎盘重量比显著增加（图8F–I），这表明VA能够缓解PE症状并减轻不良妊娠结局和胎盘效率低下。反映胎盘结构改变的迷路区与交界区比例在PEVA组较PE组降低（图8J和K），表明VA能够逆转PE对胎盘结构的损伤。特别地，我们在PEVA组小鼠的粪便中检测到了高表达的B. bifidum（图8L）。
综上所述，香草酸通过富集B. bifidum来缓解PE小鼠的症状。
图6. 移植WOA小鼠的肠道菌群缓解了PE小鼠的症状和血管生成失衡
(A) 动物实验示意图：本实验设计用于评估粪便菌群移植（FMT）对L-NAME诱导的先兆子痫（PE）小鼠模型的影响。(B) 各组小鼠收缩压（SBP）测量结果：无创测量各组小鼠的收缩压。与NP组相比，PE组在相应日期的SBP显著升高（aaa，p < 0.001）。与PE组相比，FMT-WOA-H组在相应日期的SBP显著降低（bb，p < 0.01；bbb，p < 0.001）。与NP组相比，FMT-WOA-H组在相应日期的SBP无显著差异，但在某些时间点略高（ccc，p < 0.001，可能与FMT后的短期生理适应有关）。(C) GD18时各组小鼠的尿蛋白浓度：测量GD18时各组小鼠的尿蛋白浓度。(D–G) 胎盘重量、胎儿重量和胎儿-胎盘重量比：测量各组小鼠的胎盘重量、胎儿重量和胎儿-胎盘重量比。(H–I) 胎盘组织H&E染色代表性图像及组织形态学分析：取小鼠胎盘组织的中矢状面切片进行H&E染色，用于组织形态学分析（原始放大倍数，×25；比例尺，1 mm）。图中标记了迷路区和交界区。(J–L) 血清中VEGF、PlGF和sFlt-1的水平：测量各组小鼠血清中VEGF、PlGF和sFlt-1的浓度。(M) sFlt-1与PlGF的比率：计算各组小鼠血清中sFlt-1与PlGF的比率。(N) 血清中脂多糖（LPS）的水平：测量各组小鼠血清中LPS的浓度。注：对于(B-G, J-N)，每组n=6；对于(I)，每组n=3。数据表示为均值±标准差（SD）。P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，由单因素方差分析（ANOVA）检验得出。
图7. 补充双歧杆菌双歧亚种减轻了PE小鼠的症状
(A) 相对双歧杆菌水平：测量各组小鼠肠道中双歧杆菌的相对丰度。(B) 动物实验示意图：本实验设计用于评估补充双歧杆菌双歧亚种（B. bifidum）对L-NAME诱导的先兆子痫（PE）小鼠模型的影响。(C) 各组小鼠收缩压（SBP）测量结果：无创测量各组小鼠的收缩压。与NP组相比，PE组在相应日期的SBP显著升高（aaa，p < 0.001）。与PE组相比，B. bifidum组在相应日期的SBP显著降低（bb，p < 0.01；bbb，p < 0.001）。与NP组相比，B. bifidum组在相应日期的SBP无显著差异，但在某些时间点略高（ccc，p < 0.001，可能与补充益生菌后的短期生理适应有关）。(D) GD18时各组小鼠的尿蛋白浓度：测量GD18时各组小鼠的尿蛋白浓度。(E–H) 胎盘重量、胎儿重量和胎儿-胎盘重量比：测量各组小鼠的胎盘重量、胎儿重量和胎儿-胎盘重量比。(I–J) 胎盘组织H&E染色代表性图像及组织形态学分析：取小鼠胎盘组织的中矢状面切片进行H&E染色，用于组织形态学分析（原始放大倍数，×25；比例尺，1 mm）。图中标记了迷路区和交界区。(K) 胎盘中Vegf、Plgf、sFlt-1、Fpn1、Fth1、Xct和Gpx4的相对mRNA水平：测量各组小鼠胎盘中这些基因的相对mRNA水平（n=6）。(L–M) 各组胎盘中的Fe²⁺和GSH浓度：测量各组小鼠胎盘中的Fe²⁺和GSH浓度。注：对于(A-G, K-M)，每组n=6；对于(I–J)，每组n=3。数据表示为均值±标准差（SD）。P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，由单因素方差分析（ANOVA）检验得出。
图8. 香草酸富集B. bifidum以缓解PE小鼠的症状
(A–B) PE组小鼠粪便中B. bifidum的相对丰度：测量PE组小鼠粪便中B. bifidum的相对丰度，并比较有无香草酸（VA）处理的情况。(C) 动物实验示意图：本实验设计用于评估香草酸对L-NAME诱导的先兆子痫（PE）小鼠模型的影响。(D) 各组小鼠收缩压（SBP）测量结果：无创测量各组小鼠的收缩压。与NP组相比，PE组在相应日期的SBP显著升高（aaa，p < 0.001）。与PE组相比，NPVA组（正常妊娠小鼠给予香草酸）在相应日期的SBP无显著差异，但略有降低（未达统计学显著，可能是香草酸的轻微降压作用）。与NP组相比，PEVA组（PE小鼠给予香草酸）在相应日期的SBP显著降低（bbb，p < 0.001）。与NPVA组相比，PEVA组在相应日期的SBP也显著降低（ddd，p < 0.001），表明香草酸对PE小鼠的降压效果更明显。与NP组相比，PEVA组在某些时间点的SBP仍略高（ccc，p < 0.001，可能与PE的病理生理过程有关）。(E) GD18时各组小鼠的尿蛋白浓度：测量GD18时各组小鼠的尿蛋白浓度。(F–I) 胎盘重量、胎儿重量和胎儿-胎盘重量比：测量各组小鼠的胎盘重量、胎儿重量和胎儿-胎盘重量比。(J–K) 胎盘组织H&E染色代表性图像及组织形态学分析：取小鼠胎盘组织的中矢状面切片进行H&E染色，用于组织形态学分析（原始放大倍数，×25；比例尺，1 mm）。图中标记了迷路区和交界区。(L) PE组和PEVA组小鼠粪便中B. bifidum的相对丰度：测量PE组和PEVA组小鼠粪便中B. bifidum的相对丰度。注：对于(A-I, L)，每组n=6；对于(J–K)，每组n=3。数据表示为均值±标准差（SD）。P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，由单因素方差分析（ANOVA）检验得出。
4. 讨论
先兆子痫（PE）是一种严重的妊娠相关疾病，严重威胁着孕妇和围产儿的生命健康。目前，由于PE的病因尚不明确，缺乏有效的预测、预防和治疗手段（Brown et al., 2018）。传统中药具有多途径、多成分、多靶点的独特优势，在PE的预防和治疗方面已取得一定成果（Jin et al., 2022; Liu et al., 2021; Yang et al., 2023）。由于挥发油具有有益的药理特性，已被广泛研究（委员会，2020）。然而，据我们所知，目前关于砂仁（AVL）非挥发成分的研究有限。水煎煮是中药常见的制备方法。因此，在本研究中，我们制备了砂仁水煎液（WOA），并评估了其对PE的影响。我们证明，WOA通过恢复血管生成平衡、抑制胎盘铁死亡和增强肠-胎盘屏障，对PE产生了保护作用。值得注意的是，WOA通过香草酸（VA）的活性诱导了B. bifidum的富集，从而缓解了PE模型小鼠的症状。我们的结果支持在妊娠期间补充砂仁作为一种潜在安全有效的PE预防和治疗方法。
胎盘是母体和胎儿之间的桥梁，负责营养物质的运输和抵御有害毒素。健康的胎盘促进胎儿的生长，而功能不良的胎盘则会导致胎儿生长受限（Fisher, 2015b; Tossetta et al., 2014b; Ward et al., 2023）。越来越多的临床研究报道，PE患者体内总铁浓度显著增加，且胎盘中铁死亡的发生至关重要（Liu et al., 2019b; Yang et al., 2022; Yang et al., 2022; Zhang et al., 2020b）。铁死亡是一种由铁过载和脂质过氧化引起的细胞死亡形式（Lee et al., 2024）。在本研究中，PE小鼠胎盘中铁浓度过高，而负责铁输出的FPN1蛋白和负责铁储存的FTH1蛋白的表达显著下调，进一步证实了铁稳态失衡。此外，PE小鼠胎盘中铁死亡相关蛋白的表达发生改变，xCT、GSH和GPX4蛋白水平显著下调，表明细胞内抗氧化剂耗竭。这些发现都是PE小鼠胎盘中铁死亡的特征。值得注意的是，WOA干预后，铁死亡相关蛋白水平和胎盘Fe²⁺水平显著恢复正常，表明WOA改善了铁稳态失衡，逆转了细胞内抗氧化剂的耗竭，从而抑制了PE小鼠的胎盘铁死亡。
铁过载会诱导肠道上皮细胞铁死亡，破坏肠道黏液层，导致紧密连接蛋白丢失，并促进肠道炎症，导致肠道屏障损伤（Chen et al., 2020c; Fang et al., 2018; Jaeggi et al., 2015; Luo et al., 2021; Qi et al., 2020）。此外，据报道，铁过载还会破坏肠道中有益菌和有害菌的平衡。PE与肠道菌群失调有关，这会加剧病理过程，表明肠-胎盘轴参与其中（Chen et al., 2020a）。特定肠道细菌（如机会性病原体梭杆菌属）会转移到胎盘，最终引发炎症和胎盘形成不良及生长受限（Hampton, 2020）。张等人（2024）的早期研究表明，调节肠-胎盘轴可有效减轻肠道来源的胎盘损伤或胎儿生长受限。我们之前的研究表明，葛根（Puerariae Lobatae Radix, PLR）通过保护肠道和胎盘屏障，改善了PE小鼠的症状（Huang et al., 2022）。在本研究中，WOA通过多条途径有效修复了PE小鼠的肠道屏障，如减轻肠道炎症、增强肠道紧密连接蛋白的表达和维持肠道屏障的通透性。修复的肠道屏障可抑制病原菌和LPS的转移，从而减少胎盘炎症并增强胎盘的保护能力。在胎盘中，WOA干预减轻了炎症并增加了紧密连接蛋白的表达，进一步证实了其对胎盘屏障的保护作用。相关性分析显示肠道和胎盘屏障的一致变化，进一步支持了肠道和胎盘之间的联系。此外，基于将WOA处理小鼠的粪便菌群移植到PE小鼠的数据，我们验证了肠道菌群是WOA影响的关键上游调控因子。因此，我们推断WOA通过调节肠-胎盘轴来保护胎盘。
肠-胎盘轴在PE中至关重要，诱导肠道菌群组成的改变可产生有益效果（Ahmadian et al., 2020; Chen et al., 2020a）。在本研究中，我们观察到阿克曼氏菌（Akkermansia）和双歧杆菌（Bifidobacterium）的丰度与收缩压以及sFlt-1/PlGF比率呈负相关，表明阿克曼氏菌和双歧杆菌可能参与PE中血压和血管生成的调节。有趣的是，在WOA处理的PE小鼠中，阿克曼氏菌和双歧杆菌的相对丰度同时显著上调。在葛根根-抗性淀粉处理的2型糖尿病小鼠中也检测到阿克曼氏菌和双歧杆菌的富集（Song et al., 2021）。与我们之前的研究结果相似，葛根根-抗性淀粉（PLR-RS）补充剂在缺血性卒中大鼠中富集了阿克曼氏菌和双歧杆菌，强调了这两种细菌之间的共生关系（Lian et al., 2023）。阿克曼氏菌粘液菌（Akkermansia muciniphila）是一种定植于黏膜层的肠道共生菌，据报道，其通过衍生的细胞外囊泡和短链脂肪酸（SCFAs）代谢产物减轻PE症状，促进滋养细胞侵袭，从而改善螺旋动脉重塑（Chen et al., 2023; Jin et al., 2022）。肠道菌群是一个复杂的生态系统，成员之间的相互作用负责肠道微生态的稳定性，影响宿主的健康和疾病（Wu et al., 2021）。我们推测，阿克曼氏菌增加了肠道黏液层的厚度，这对维持肠道完整性有益（Derrien et al., 2008; Yan et al., 2021），这可能为双歧杆菌的定植和生长提供了适宜的肠道环境。双歧杆菌是一种公认的肠道益生菌，通过增强紧密连接蛋白的表达对肠道屏障产生保护作用（Tang et al., 2023），表明其对防止有害细菌和内毒素转移具有保护作用。母体妊娠期双歧杆菌治疗可促进胎盘形态发生、营养物质运输和胎儿生长（Lopez-Tello et al., 2022）。此外，在后代中，双歧杆菌可塑造肠道菌群并促进免疫系统发育（Cheng et al., 2022）。在之前的一项两样本孟德尔随机化研究中，双歧杆菌与PE相关（Li et al., 2022）。在本研究中，我们在WOA处理的PE小鼠胎儿中检测到四种主要的双歧杆菌菌株（B. bifidum、B. longum、B. breve和B. animalis），其中B. bifidum被确定为最关键的细菌菌株。我们发现，补充B. bifidum可降低PE小鼠的母体高血压和尿蛋白水平，增加胎儿体重和胎盘效率，并减轻胎盘损伤。我们的发现首次表明，双歧杆菌的富集在PE的改善中发挥作用。
此外，肠道菌群组成的改变可显著影响其代谢产物。短链脂肪酸（SCFAs）是肠道菌群的一种重要代谢产物，与胎盘功能密切相关（Husso et al., 2023）。例如，肠道菌群产生的SCFAs有助于巨噬细胞分化并抑制胎盘炎症，从而抵抗PE的发展（Huang et al., 2023）。此外，在本研究中，WOA富集的益生菌如阿克曼氏菌和双歧杆菌可产生SCFAs。阿克曼氏菌可通过SCFAs调节胎盘中的巨噬细胞极化和螺旋动脉重塑，从而缓解PE（Jin et al., 2022）。一项临床研究表明，补充双歧杆菌双歧亚种和双歧杆菌长亚种可显著增加血液透析患者的SCFAs水平（Wang et al., 2022）。高水平的SCFAs可降低肠道炎症并增强肠道屏障完整性，从而防止病原菌的入侵（Pertiwi et al., 2024）。除了对肠道的保护作用外，SCFAs还可被吸收进入血液（Doan et al., 2024）。结肠对SCFAs的吸收涉及载体介导机制和简单扩散。参与SCFAs摄取的转运体包括钠偶联单羧酸转运体（SMCTs）和单羧酸转运体（MCTs），它们位于肠道上皮细胞和基底外侧膜（Hsu et al., 2024）。吸收后，SCFAs可通过循环系统扩展到多个远端器官系统（Sun et al., 2017）。因此，我们推测，肠道菌群产生的有益代谢产物可通过血液循环到达胎盘，并缓解PE引起的胎盘损伤。
除了肠道菌群相互作用的影响外，WOA成分的直接作用也可能共同促进双歧杆菌的富集。我们发现，VA干预在体内和体外均增加了B. bifidum的丰度。目前，VA是食品、饮料、化妆品和制药工业中重要的香料，表明其在孕妇中使用的安全性（Lubbers et al., 2021）。在本研究中，通过高效液相色谱（HPLC）对WOA成分的定量分析显示，香草酸（VA）、表儿茶素、白藜芦醇苷和异槲皮苷为主要成分，其中VA含量最高。其中，VA的分子量最小，表明其吸收速度更快，更容易进入血液循环系统。此外，VA是一种具有多种药理特性的酚酸化合物，包括抗高血压、抗炎和抗氧化活性（Ni et al., 2024）。据报道，VA通过上调L-NAME诱导的高血压大鼠主动脉内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表达来恢复正常血压，凸显了其在高血压管理中的潜力（Kumar et al., 2014b）。此外，妊娠期间增加的铁需求最初通过动员母体储存（主要来自肝脏）来满足。随着这些储存的耗尽，肠道成为铁吸收的主要来源，以确保母亲和胎儿有足够的供应（Millard et al., 2004）。据报道，VA通过限制肠道上皮细胞中的铁死亡来抑制炎症并保护肠道屏障，表明其有潜力调节肠道铁吸收（Ni et al., 2024）。基于这些发现，我们推测WOA在PE小鼠中恢复血管生成、抗高血压和降低尿蛋白的效果可能与VA的生物活性密切相关。为了验证这一假设，我们在小鼠模型中评估了口服VA对PE的影响。如预期所料，VA干预显著降低了高血压，恢复了尿蛋白水平，并逆转了PE小鼠的胎盘血管生成失衡（图S5）。有趣的是，VA在降低模型小鼠血压方面比WOA更有效（图S6）。此外，VA显著提高了胎盘促血管生成因子（VEGF和PlGF）的水平，同时抑制了抗血管生成因子（sFlt-1）的水平，支持了WOA通过调节VA在PE模型小鼠中保护血管功能的理论。据我们所知，目前尚无关于砂仁非挥发成分对恢复血管生成贡献的研究报道。本研究的数据为基于VA成分的砂仁在缓解PE症状中的新应用提供了有力支持。然而，关于表儿茶素、白藜芦醇苷和异槲皮苷在PE中干预的药效学研究也值得进一步研究。表儿茶素已被证明可与NF-κB结合，表明其有潜力抑制NF-κB磷酸化，从而缓解PE中的内皮功能障碍（Rahayu et al., 2016）。表儿茶素还被报道可降低精氨酸酶和NADPH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）氧化酶的活性，表明其在抗高血压和抗氧化方面的潜力（Gonzalez-Garrido et al., 2013）。此外，异槲皮苷主要通过抑制ACE、增加缓激肽、PGI2（前列腺素I2）和一氧化氮（NO）的生物利用度来缓解自发性高血压大鼠的高血压（Gasparotto Junior et al., 2011）。此外，异槲皮苷还被报道可减少自发性高血压大鼠中的ROS（Gasparotto Junior et al., 2011）。这些研究表明它们在改善PE方面的潜在价值，值得我们进一步研究。
在本研究中，我们首次证明WOA和VA对PE具有保护作用。WOA主要通过抑制胎盘铁死亡、保护肠道和胎盘屏障以及重塑肠道菌群来缓解PE。我们的发现进一步支持了肠-胎盘轴，并表明砂仁有潜力被开发成一种安全有效的孕妇功能性食品。
5. 结论
本研究首次表明，砂仁通过VA的活性富集肠道中的B. bifidum含量，从而缓解PE小鼠的症状。此外，砂仁通过调节与肠-胎盘轴相关的多条途径来预防流产。本研究为砂仁作为PE治疗药物的系统开发和临床应用提供了新方向，具有重要的理论意义和实践价值。
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