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摘要：
人乳低聚糖（HMOs）是人乳中第三丰富的固体成分，其在不同女性之间的含量差异显著，这种差异受分泌型状态、种族、地理位置、季节、孕妇营养和体重、孕周以及分娩方式等因素的影响。近期研究表明，HMOs在婴儿发育过程中具有多种功能性作用。由于HMOs不被婴儿消化，它们作为某些细菌的代谢底物，有助于建立婴儿的肠道微生物群。通过促进有益肠道细菌的生长，这些糖类发挥益生元的作用，并产生短链脂肪酸（SCFAs），这对肠道健康至关重要。HMOs还能特异性地减少有害微生物和病毒与肠道上皮的结合，从而预防疾病。在婴儿配方奶粉中添加HMOs是安全的，并能促进健康发育、预防感染和建立微生物群。目前的婴儿配方奶粉中常含有与人乳中发现的低聚糖（OSs）结构不同的OSs，因此它们不太可能重现HMOs的独特效果。然而，生产类似HMOs的OSs已成为一种日益增长的趋势，但由于数据有限，尚不清楚与非人源OSs相比，HMOs是否提供额外的治疗益处。更深入地了解人乳腺如何合成HMOs可以指导开发技术，以产生种类繁多且OS组成与人乳密切相关的复杂HMOs。本综述探讨了HMOs的复杂性质及其在婴儿健康中的关键作用，研究了HMO组成的母体差异及其影响因素。重点介绍了近期技术进步，这些进步使得能够开展关于HMO组成及其对婴儿健康影响的大规模研究。此外，还探讨了HMOs在生物过程中的多功能作用，如预防感染、大脑发育以及肠道微生物群和免疫反应调节。讨论了婴儿配方奶粉中HMOs与其他哺乳动物OSs的结构区别，并重点关注了生产更接近人乳中HMOs的精确复制品的趋势。
1 引言
母乳是婴儿唯一推荐的营养来源。它不仅支持新生儿的生长，还含有促进适龄发展和免疫力的生物活性成分。世界卫生组织（WHO）和儿科协会建议出生后一小时内开始母乳喂养，并推荐前六个月纯母乳喂养，之后继续母乳喂养至两岁[1,2]。
随着我们对母乳喂养健康益处的了解不断加深，分析方法的最新发展以及“-组学”技术的创建和整合，为我们提供了有关母乳成分的深入信息[3]。母乳的绝大部分是水，此外还含有范围广泛的固体成分，这些成分既具有营养性质，也具有生物活性。人乳低聚糖（HMOs）是母乳中生物活性成分的一大类，无论在数量还是结构多样性方面都占据显著地位。一个多世纪以来，科学家们一直在研究HMOs，其动力来源于母乳在营养和生理方面的益处的有力证据[4]。HMOs最初是在19世纪末“被发现”的，当时法国生物化学家Georges Denigés观察到，人和牛的乳汁中除了乳糖（Lac）外，还含有许多其他碳水化合物结构。Polonowski和Lespagnol最初将这些未确定的成分称为雌乳糖[5]。
由于糖组学科学的重大进展，已经确定了200多种HMO结构，目前人乳中的低聚糖（OSs）含量比任何家养农场动物的乳汁高100至1000倍[6,7]。一升成熟的人乳中含有10至15克HMOs，这一数量通常超过总蛋白质含量，并且比常用于婴儿配方奶粉的牛乳中OSs的浓度高100至1000倍。人初乳中的HMOs浓度甚至更高[8]。
在HMOs的生成过程中，第一步是通过β1–3或β1–6键将半乳糖（Gal）连接到乳糖-N-二糖（LNB）或N-乙酰乳糖胺（LacNAc）上，从而酶促延长Lac。基于此，HMOs可分为I型或II型链。与LNB连接的乳糖-N-四糖（LNT）包含在I型链HMOs中。另一方面，II型链由乳糖-N-新四糖（LNnT）异构体组成，具有将Lac结合到LacNAc的能力[8,9]。此外，唾液酸（Sia）可通过α2–3或α2–6键装饰核心HMO结构，而岩藻糖（Fuc）可在末端位置通过α1–2、α1–3或α1–4键进行同样的装饰。因此，HMO可大致分为三类：中性OS、唾液酸化OS和岩藻糖基化OS（FucOS）[8]。
母乳喂养的新生儿肠道微生物群主要由拟杆菌属、乳杆菌属和双歧杆菌属物种组成。这是因为这些菌株能够代谢HMOs[10]。大多数双歧杆菌属物种能够代谢母乳中的主要HMOs，如LNT和2′-岩藻糖基乳糖（2′-FL）[11]。双歧杆菌属和拟杆菌属物种，特别是两歧双歧杆菌（B. bifidum）和脆弱拟杆菌（B. fragilis），使用β-半乳糖苷酶、α-岩藻糖苷酶和唾液酸酶等酶来水解HMOs[10]。通过这种方式，母乳喂养的婴儿体内含有高浓度的益生菌双歧杆菌属物种，如脆弱拟杆菌（B. fragilis）、普通拟杆菌（B. vulgatus）和婴儿双歧杆菌亚种（B. infantis）[12]。
作为必要的生物活性成分，HMOs充当益生元、黏膜信号分子和免疫调节剂，对丰富肠道微生物群、增强肠道上皮屏障完整性和支持免疫功能做出了重大贡献[13]。HMOs的主要作用之一是作为益生元，帮助婴儿的肠道微生物群发展有益细菌。因此，HMOs选择性地促进有限数量的优势有益物种的生长，这些物种抑制有害细菌的发展。因此，母乳喂养和配方奶喂养的婴儿肠道中的微生物组成截然不同。配方奶喂养的婴儿微生物组更多样化，因为配方奶无法模仿母乳的成分，并且不包含HMOs[14,15]。1954年，Kuhn和György发现，他们称之为“双歧杆菌因子”的HMOs混合物可促进两歧双歧杆菌（B. bifidum，以前称为乳酸杆菌双歧种）的生长。双歧杆菌发酵HMOs产生短链脂肪酸（SCFAs；丁酸、丙酸和乙酸）。SCFAs调节肠道pH值并增强免疫系统，保护共生菌群免受侵袭性感染和炎症的影响[16,17]。除了作为益生元外，HMOs还具有抑菌和抗生物膜特性。初步研究表明，均质和异质HMOs均可调节细菌增殖和生物膜形成[18]。
在新生儿配方奶粉中添加HMO补充剂是安全的，可促进健康成长，并对微生物群和预防感染有益。由于婴儿配方奶粉中经常含有与人乳中不同的OSs，因此它们不太可能模仿HMOs的独特效果。然而，生产类似人乳的OSs正成为一种越来越流行的趋势。由于缺乏足够的数据来比较HMOs与非人源OSs的效果，因此尚不清楚HMOs是否具有任何治疗益处。了解人乳腺的合成可能有助于指导复杂HMOs的创建[19]。
本文探讨了HMOs的广泛而复杂的特性及其对新生儿健康的至关重要作用。研究了母亲间HMO组成的显著差异及其影响因素。强调了促进对HMO成分及其对婴儿健康结果影响的广泛研究的最新技术进步。此外，还探讨了HMOs在生物过程中的多功能作用，包括预防感染、大脑发育以及肠道微生物群和免疫反应的调控。本文还研究了新生儿配方奶粉中HMOs与其他哺乳动物OSs的结构差异，并强调了生产更接近人乳中HMOs的精确复制品的趋势。
HMOs及影响其在母乳中组成的因素
HMOs是母乳中第三重要的固体成分，仅次于Lac和脂质。目前已发现200多种结构不同的HMOs。HMOs对胰腺和刷状缘酶以及低胃pH值具有抵抗力。大多数HMOs由婴儿的肠道细菌代谢或未改变地排出，其中1%至2%被吸收，进入体循环，并通过尿液排出。此外，HMOs对高温和低温均具有抵抗力，因此不受巴氏杀菌和冷冻干燥的影响[20]。
HMOs是由五种主要单糖组成的复杂聚糖异质性集合，包括半乳糖（Gal）、葡萄糖（Glc）、N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）、岩藻糖（Fuc）和唾液酸（Sia）衍生物N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac），其复杂性归因于糖苷键的多样性。所有HMOs在还原端都包含Lac（Galβ1–4Glc）。这种Lac可以通过两个不同的二糖，即Galβ1-3GlcNAc（I型链）或Galβ1–4GlcNAc（II型链），以β1–3或β1–6键延长。根据组成部分的化学性质，HMOs可分为几个不同的类别[21,22]。含有一个或多个Sia的酸性HMOs与中性HMOs不同，这是该组内可以做出的基本区分。后者可以进一步细分为含有一个或多个Fuc单元的那些和不含有Fuc成分的那些。酸性唾液酸化HMOs可进一步分为酸性非岩藻糖基化HMOs和酸性岩藻糖基化HMOs[4]。基于此分类，研究表明，分泌型女性的母乳由三组主要的HMOs组成：中性岩藻糖基化HMOs（35%–50%）、酸性唾液酸化HMOs（12%–14%）和中性非岩藻糖基化HMOs（42%–55%）（图1）[23]。
图1. 最常见人乳低聚糖（HMOs）的分类：（A）代表性岩藻糖基化中性HMOs；（B）代表性非岩藻糖基化中性HMOs；（C）代表性唾液酸化HMOs [18,24]
在初乳中，人乳低聚糖（HMOs）的浓度范围为20至25克/升（平均9至22克/升），而在成熟乳中，浓度范围为10至15克/升（平均8至19克/升），六个月后，浓度范围降至4至6克/升[25]。人乳中HMOs的浓度和组成因遗传和非遗传因素而表现出差异。导致这种多样性的基本成分是两种酶——分泌型（Se）和路易斯型（Le）酶的活性，这两种酶由母亲体内的Se和Le基因产生。这些基因负责酶的形成。具体来说，Se和Le基因分别负责编码α1–2岩藻糖基转移酶（FUT2）和α1–3/4岩藻糖基转移酶（FUT3）。这些酶在岩藻糖基化HMOs的产生中发挥作用[26]。对于FUT2和FUT3酶已失活的女性，其乳汁中α1–2岩藻糖基化HMOs的含量要么很低，要么完全缺失。由于Se基因两个等位的突变，FUT2的活性可能失活，而FUT3的活性可能降低。这两种突变可能同时发生。路易斯阴性母亲的乳汁中不含α1–4岩藻糖基化HMOs，或仅含极少量。拥有Se基因的母亲会产生FUT2酶，而不拥有该基因的母亲则不会产生FUT2。FUT2和FUT3酶之间的相互作用会形成两种主要的路易斯抗原，即Lea和Leb。这种相互作用还会导致四种常见的乳汁表型的形成：Se+/Le(a−b+)、Se-/Le(a+b−)、Se+/Le(a−b−)和Se−/Le(a−b−)[27,28]。
众所周知，初乳中HMOs的浓度较高，但除哺乳期长短外，导致女性之间差异的其他变量尚未得到研究。有数据表明，不同人群中HMOs的流行率存在差异[29]。这种差异可能主要归因于不同地理区域乳汁组的分布不均[30]。可能影响HMO含量差异的非遗传因素包括母亲的年龄、饮食习惯（从而影响其体重指数（BMI））以及她可能患有的任何严重健康状况（图2）[31]。
图2. 影响母乳中HMOs浓度的因素[31]。
根据McGuire等人的研究结果，在健康哺乳期女性中，来自11个不同国家的瑞典女性乳汁中的3′-岩藻糖基乳糖（3′-FL）浓度至少是冈比亚农村女性乳汁中的四倍。另一方面，瑞典乳汁中的二唾液酸乳糖-N-四糖（DSLNT）浓度几乎是冈比亚农村地区的四分之一[32]。此外，在冈比亚，哺乳期母亲在雨季产生的乳糖-N-新四糖（LNnT）远低于旱季[33]。研究发现，剖宫产后乳汁中的3′-唾液酸乳糖（3′-SL）、2′-FL和6′-半乳糖基乳糖（6′-GL）含量低于阴道分娩[34]。此外，产次也会影响HMOs的浓度。产次对HMO含量的影响可能受到母体体重指数（BMI）与人乳中脂肪酸组成以及脂肪和蛋白质浓度之间关联的影响。这种相关性随着每次后续活产而增加[35]。关于早产对HMOs的影响，与足月分娩相比，早产后的母体乳汁中3′-SL、6′-SL、乳糖-N-四糖（LNT）和乳糖-N-二岩藻糖基-己糖-I（LNDFH-I）的水平升高。此外，3′-SL和6′-SL的比例根据乳汁成熟阶段的不同而有显著差异[36,37]。
此外，除了遗传因素（分泌型状态）和哺乳持续时间等自然因素外，报告的HMO浓度差异还与不同的实验室聚糖分析方法有关。因此，当前关于HMO定量的研究工作对于确定某些HMO结构的平均浓度以及研究其在母乳喂养期间的变化是一个有价值的工具[38]。研究结果表明，HMO的浓度在哺乳期间不断变化，大约15种不同的HMO结构构成了总HMO分数的主体（>75%）。根据当前文献的描述性分析，更确切地说，成熟乳中总HMO组成的主要成分是2′-FL、LNDFH-I、乳糖-N-岩藻糖基-五糖-I（LNFP-I）、乳糖-N-岩藻糖基-五糖-II（LNFP-II）、LNT、3′-FL、6′-SL、DSLNT、LNnT、二岩藻糖基乳糖（DFL）、岩藻糖基-二唾液酸-乳糖-N-己糖（FD-LNH）、乳糖-N-岩藻糖基-五糖-III（LNFP-III）、3′-SL、乳糖-N-新四糖c（LST c）和三岩藻糖基乳糖-N-己糖（TF-LNH）。就相对摩尔丰度比而言，较小的HMO，即六糖，占主导地位[39]。
关于母乳中HMO的数量和不同类型，已有大量研究。一项使用反相高效液相色谱的实验发现，在母乳喂养的前14周内，HMO的浓度为9克/升。到产后一年，它逐渐下降到4克/升[40]。在另一项研究中，采用高效阴离子交换色谱结合脉冲安培检测（HPAEC-PAD）发现，产后第4天寡糖（OSs）的峰值浓度为20克/升，随后在哺乳第30天时下降了约20%[41]。因此，采用相同策略，使用高压液相色谱研究HMO浓度。研究人员还分析了HMO组成与婴儿生长发育之间的相关性。研究结果表明，1个月时HMO的多样性和均匀性越高，总脂肪质量和脂肪百分比越低。1个月后LNFP I水平的升高与早产体重减轻0.40公斤、体重减轻1.11公斤和瘦体重减轻0.85克相关。6个月后，LNFPI与脂肪质量减少0.79克相关，而二唾液酸-LNT和LNFPII分别导致脂肪质量增加1.92克和0.42克。岩藻糖基-二唾液酸-乳糖-N-六糖和LNnT水平的升高分别与体脂率增加0.04%和减少0.03%相关[42]。更具体地说，Csernák等人使用石墨化碳液相色谱-质谱（LC-MS）分离并研究了人乳中的3′-SL和6′-SL[43]。在产后期间，收集并分析乳汁样本。在研究期间，初乳中3′-SL的浓度基本保持一致，第一哺乳期期间为205.8至252.4微克/毫升，第二哺乳期期间为134.9至208.8微克/毫升。在成熟乳中，浓度也相对恒定，分别为224.6至248微克/毫升和165.3至180.6微克/毫升。本研究中主要酸性HMO 6′-SL的浓度（53.1–939.1微克/毫升）高于以往研究报道的量[44,45]。尽管6′-SL的浓度在哺乳第一周内没有显著下降，但在第7天至第30天之间开始呈现下降趋势，并持续到研究结束（6个月），这与Thurl等人的研究结果一致[46]。
就乳汁中的HMO浓度而言，初乳（0–5天）的总HMO浓度最高，为17.6克/升，然后持续下降。然而，在初乳之后的过渡期和成熟期，新生儿摄入的母乳量增加。预计乳汁摄入量的增加和HMO浓度的降低将抵消新生儿摄入的HMO量[47]。
因此，人乳中包含大约200种不同的HMO结构，其中相当一部分结构的数量与丰富结构相比较低。在整个母乳喂养过程中，个体HMO既多样又动态。对研究中哺乳阶段的分析显示，总HMO在哺乳早期较高，在初乳期后下降。尽管存在一些特定结构在初乳后阶段波动、保持稳定或增加的例外情况，但大多数个体结构在母乳喂养期间似乎持续减少。初乳后，3′-FL水平显著升高，这一点已由Borewicz等人（2020）[48]、Wang等人（2020）[49]以及最近的Plows等人（2021）和Gu等人（2021）[50]所证实。Plows等人（2021）的一项研究发现，3′-FL在1个月至24个月期间增长了10倍[51]。
最近的发展已经导致了一种含有五种HMO（即2′-FL、LNnT、LNT、DFL、3′-SL和6′-SL）的婴儿配方奶粉的推出。为了实现设计在成分和功能上都与人乳非常相似的婴儿配方奶粉的持续目标，了解基于全球健康母亲的人乳最具代表性的组成是至关重要的。这些信息有助于改进配方。由于需要获得能够准确代表整个人群的估计数字，作者在将HMO纳入婴儿配方奶粉和其他营养组合物时选择了综合概述[47]。
总之，由于遗传、环境和生理变量的影响，HMO所展现的结构多样性对新生儿健康产生了重大影响。HMO能够选择性地促进健康肠道细菌（如婴儿双歧杆菌）的生长，这些细菌能够有效利用岩藻糖基化和唾液酸化的健康维护生物体。非分泌型母亲（其岩藻糖基化HMO水平较低）的存在可能导致儿童肠道微生物群组成发生改变，因为某些细菌菌株的生长受到抑制。HMO能够通过阻止病原体粘附于肠道上皮，从而塑造微生物群并影响免疫系统。由于保护性HMO水平降低，非分泌型母亲的婴儿可能面临更高的感染风险。除了具有抗炎特性外，唾液酸化HMO对免疫系统的发育也有益。唾液酸化HMO对认知能力的发展至关重要，因为它们是大脑中神经节苷脂和糖蛋白的前体。HMO水平的差异可能影响这些物质在发育阶段的可用性。早期HMO的多样性可能影响新陈代谢、肠道健康和免疫力，进而可能影响日后患慢性疾病的可能性。
3 合成与代谢
3.1. 合成
在生物合成过程中，多个基因的多态性导致了母乳低聚糖（HMO）在组成上的显著差异性[52]。人们认为，乳腺中的糖基转移酶负责催化绝大多数（如果不是全部）HMO的形成。这些HMO是从乳糖（Lac）的非还原端生成的[53]。分泌囊泡很可能是乳糖和其他低聚糖（OSs）集中的地方，随后通过胞吐作用与顶端质膜融合并释放[54]。在乳腺中，β1–4-半乳糖基转移酶1（β1–4GalT1）与α-乳白蛋白形成乳糖合酶复合物，以合成乳糖本身[55]。然而，负责创建具有特定糖苷键连接的HMO结构的大多数特定糖基转移酶尚未被发现。人类FUT2（由Se基因编码）和FUT3（由Le基因编码）是理解最透彻的例子。这些酶分别负责在人体乳腺中形成α1–2连接的岩藻糖苷[56]。当Se基因被激活时，表达的FUT2负责通过α1–2连接将岩藻糖（Fuc）添加到HMO的1型链末端半乳糖（Gal）上[57,58]。Le基因促进FUT3的发展，FUT3通过α1–3/4连接将Fuc连接到HMO的1型链的亚末端N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）上[59,60]。根据Se基因和Le基因的不同表达，可将母亲分为四类，即两种基因均为阳性（+）或阴性（−）。Se(+)Le(+)、Se(−)Le(+)、Se(+)Le(−)和Se(−)Le(−)的比例分别为70%、20%、9%和1%[58]；[32,61]。
此外，核心低聚糖的加工增强了人乳中HMO结构的多样性。这一过程激活了四种糖基转移酶：β3-半乳糖基转移酶和β4-半乳糖基转移酶促进Gal的转移，而β1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶（iGnT）和β1,6-N-乙酰葡糖胺基转移酶（IGnT）则参与GlcNAc的转移[62,63]。
除了参与HMO生物合成的众多基因外，据推测还有其他因素也影响HMO的内源性产生。虽然在整个母乳喂养期间，HMO的总浓度显著降低，但季节变化和特定的母体饮食状况可能导致HMO浓度更明显的降低[64]。在冈比亚，雨季哺乳的母亲产生的乳汁中HMO浓度低于干季哺乳的母亲，干季食物供应更充足，能量摄入也更高[33]。
3.2. 代谢
当被母乳喂养的新生儿摄入后，HMO对低胃pH值和婴儿胰腺及刷状缘酶的分解均表现出抗性[65,66]。大约1%的摄入HMO被吸收，进入婴儿的系统循环，并以未改变的形式从婴儿尿液中排出[67,68]。大多数HMO要么被婴儿的肠道微生物群分解，要么以未改变的形式随婴儿粪便排出[69]。由于HMO被吸收并在全身运输，它们可能对胃以外的器官（如肝脏、大脑、呼吸系统和泌尿系统）产生影响，这表明它们的生物活性可能不仅限于肠道[8]。
具有不同分子构型的HMO的完全分解需要糖苷水解酶（GHs）和/或膜转运蛋白。新生儿肠道微生物群具有这些酶和蛋白质转运蛋白，它们是肠道细菌吸收、代谢和利用HMO所必需的。因此，了解编码必要转运蛋白和酶的基因有助于确定HMO消耗和分解的方法和途径。在婴儿肠道微生物群中，几种对HMO代谢最活跃的双歧杆菌物种已发现并鉴定了其中一些基因[13]。此外，根据摄入的HMO量，能够分解HMO的特定细菌会比其他细菌更占优势[70]。这些细菌作为益生菌，影响新生儿的肠道微生物群[71,72]。此外，包括脆弱拟杆菌（B. fragilis）、普通拟杆菌（B. vulgatus）和干酪乳杆菌（L. casei）在内的几种拟杆菌属和乳杆菌属物种已表现出较高的HMO代谢能力[73]。
3.2.1. 糖苷水解酶对HMO的酶促降解
在存在具有降解HMO所需酶促能力的细菌时，HMO成为一种极佳的底物。因此，人们认为这将促进微生物群落的发展，支持双歧杆菌在生命早期阶段在肠道微生物群中占主导地位。为了阐明HMO的整体分解模式，过去十年的研究主要集中在表征双歧杆菌（如短双歧杆菌（B. breve）、长双歧杆菌（B. longum））的酶特性上。此外，对于婴儿配方奶粉中添加的典型益生元——半乳低聚糖（GOS）和果低聚糖（FOS）的分解酶，也给予了适当的关注[74]。GHs是一组复杂的酶系，对于HMO的结构特异性分解至关重要，它们能够切断不同HMO结构之间的糖苷键，释放出组成单糖或二糖，作为进一步代谢的前体[75]。
HMO结构（包括唾液酸化、中性和中性岩藻糖化HMO）的代谢依赖于GH酶，如乳糖-N-生物合成酶（LnbX）、β-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶和岩藻糖苷酶。相反，唾液酸酶是通过靶向α-2,3和α-2,6连接，促进核心结构中N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）释放的酶[76]。从核心结构中释放的Fuc和Neu5Ac可以进一步被细菌代谢[77]。这些肠道微生物群相关的酶可以在细胞外或细胞内找到，对与婴儿相关的肠道微生物至关重要。通过理解这些酶的作用，可以揭示HMO结构的降解过程[22]。β-N-乙酰葡糖胺酶通过切断GlcNAc和Gal之间的连接，进一步分解HMO复合物。文献中已记录了许多此类酶，每种酶对特定的目标HMO有偏好，有些酶可以同等作用于β-1,3和β-1,6连接，而其他酶则偏爱某种特定类型的连接（图3）[78,79]。
图3. 糖苷水解酶的类型及其对母乳低聚糖（HMOs）的作用[19,80]
3.2.2 物种水平的HMO代谢
双歧杆菌的HMO利用策略
双歧杆菌是母乳喂养新生儿肠道中的优势菌，擅长代谢与人乳相关的益生元成分，尤其是HMOs，某些种类在健康婴儿粪便中广泛且数量众多[81]。不同双歧杆菌物种的碳水化合物代谢能力差异显著，其中婴儿双歧杆菌（B. infantis）和两歧双歧杆菌（B. bifidum）因具有遗传编码合成必要糖苷水解酶（GHs）的能力，被归为HMOs的积极消费者，这些酶对分解各种HMO连接键至关重要。交叉喂养是一种微生物间的相互作用，即肠道细菌产生的碳水化合物成分可作为其他肠道微生物成员的底物，这使得短双歧杆菌（B. breve）和长双歧杆菌（B. longum）仅限于利用较简单的HMOs或HMO特异性成分。肠道微生物群从增加的相互作用和有益化合物的产生中受益[82]。
约13.7%的双歧杆菌基因组内容专用于碳水化合物的代谢。如前所述，双歧杆菌有两种主要方式来分解HMO结构：细胞内降解和细胞外降解[81]。HMO降解是一种物种特异性能力，婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌菌株通常与细胞内降解相关，即将完整的HMOs导入细胞内，并使用寡糖转运蛋白将其代谢为单糖成分。这与两歧双歧杆菌菌株最常展现的细胞外降解机制截然不同[83]。长双歧杆菌菌株采用的HMO降解策略依赖于细胞外岩藻糖苷酶和唾液酸酶的存在与否，以及编码LnbX的lnbX基因。拥有lnbX基因的菌株利用细胞外糖苷酶，而缺乏lnbX的菌株则需要寡糖转运蛋白来内化HMOs[84]。
在双歧杆菌中已发现三种不同的宿主聚糖消耗机制。长双歧杆菌婴儿亚种（B. longum subsp. infantis）编码ATP结合盒（ABC）转运蛋白，用于内化完整的寡糖，这些寡糖随后被细胞内的GHs破坏[85]。某些短双歧杆菌菌株采用相似的机制[86]。相反，两歧双歧杆菌分泌多种GHs，并同化产生的单糖或二糖残基[83]。第三种方法由“清道夫”型双歧杆菌采用，包括短双歧杆菌和长双歧杆菌长亚种（B. longum subsp. longum），它们只能消耗HMOs的有限部分，有时依赖于其他物种，如两歧双歧杆菌，后者能对较大的HMOs进行细胞外水解[87]。
短双歧杆菌是婴儿肠道中的常见物种，不同菌株根据其遗传组成代谢HMOs。只有编码GH29 α-岩藻糖苷酶的细菌才能利用岩藻糖基化的HMOs，而短双歧杆菌编码GH95 α-岩藻糖苷酶。某些菌株表现出显著降解唾液酸化HMOs的能力，其中短双歧杆菌SC95对唾液酸化HMOs表现出偏好。一种外部β-半乳糖苷酶释放半乳糖和乳糖-N-三糖II，这些随后成为β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的底物，该酶在两歧双歧杆菌中产生N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）和乳糖，在细胞外代谢乳糖-N-新四糖（LNnT）。在另一项研究中，β-半乳糖苷酶BbgIII被证明是一种外部膜锚定的多结构域糖苷酶，属于两歧双歧杆菌JCM1254表达的五种β-半乳糖苷酶中的GH2家族。BbgIII无法水解LNnT和N-乙酰乳糖胺（LacNAc）的岩藻糖基化衍生物，而优先作用于这些聚糖的β-1,4键[88]。尽管婴儿双歧杆菌使用不同的β-半乳糖苷酶，但其在LNnT降解上遵循与乳糖-N-四糖（LNT）降解相似的方法。HMO基因簇包含编码Bga2A的基因，Bga2A是一种GH2 β-半乳糖苷酶，可将LNnT内化并水解为半乳糖和乳糖-N-三糖II。虽然它不水解LNT，但这种酶对乳糖特别活跃，也能有效分解LacNAc和LNnT[89]。
婴儿双歧杆菌通常被认为是婴儿肠道中利用HMOs的主要物种。众多研究表明，婴儿双歧杆菌菌株能在各种特定HMOs上显著增殖，包括2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL）、3'-岩藻糖基乳糖（3'-FL）、LNT、LNnT、3'-唾液酸乳糖（3'-SL）、6'-唾液酸乳糖（6'-SL）、乳糖二岩藻糖基四糖-I（LNFP-I）和乳双岩藻四糖（LDFT），作为唯一碳源。与其他双歧杆菌物种，如长双歧杆菌长亚种、短双歧杆菌和青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）分离株相比，这些菌株表现出更优越的HMO分解代谢能力。这一特性在亚种间保持一致[90]。婴儿双歧杆菌菌株中存在一个独特的43 kb基因簇，专门用于HMO分解。该基因簇编码有效裂解HMOs所需的所有GH酶，包括GH95家族的1,2-α-岩藻糖苷酶、GH29家族的1,3/4-α-岩藻糖苷酶、GH33家族的2,3/6唾液酸酶、GH20家族的β-N-乙酰己糖胺酶、GH2家族的β-半乳糖苷酶和GH42家族的LNT β-半乳糖苷酶[91]。婴儿双歧杆菌菌株在细胞内利用一系列HMOs，包括LNT、LNnT、乳糖-N-生物糖（LNB）、岩藻糖基化HMOs和唾液酸化HMOs。这些复合物被吸收并在细胞质中被外切糖苷酶降解为单糖代谢[92]。根据长双歧杆菌长亚种、长双歧杆菌婴儿亚种和短双歧杆菌的基因组分析，利用糖蛋白上的N-聚糖的能力与产生内切-β-N-乙酰葡糖胺酶（来自GH18和GH85家族）的基因存在相关，婴儿双歧杆菌ATCC 15697的EndoBI-1（GH18）、婴儿双歧杆菌SC142的EndoBI-2（GH18）和长双歧杆菌DJO10A的EndoBB（GH85）等酶已被描述[93,94]。它们具有一个或两个跨膜螺旋，能够广泛去糖基化牛核糖核酸酶B。EndoBI-1和EndoBI-2还能进一步去糖基化人和牛乳铁蛋白。EndoBI-1是一种组成型产生且热稳定（95°C 5分钟）的酶，已证明其能断裂富含甘露糖或其他复杂N-聚糖的蛋白质中的ChbNAc糖苷键[95-98]。
通过长双歧杆菌假种（B. pseudocatenulatum）的基因组测序，发现了与HMO利用相关的特定基因组簇，长双歧杆菌假种是婴儿肠道中常见的一种物种，具有多种据称的健康益处，如结合诱变芳香胺和降低胆固醇水平的能力[99,100]。最近的研究集中在确定长双歧杆菌假种是否能够仅以2%混合HMOs作为其唯一碳水化合物来源生存。源自新生儿的多种长双歧杆菌假种菌株在HMOs上的生长被证明是成功的。在这些菌株中，一些菌株始终利用LNT和LNnT。此外，研究结果还表明，岩藻糖基化HMO的利用受到编码属于GH29和GH95家族的特定α-岩藻糖苷酶的基因存在或缺失的影响[101]。
拟杆菌利用人乳寡糖的策略
拟杆菌是肠道微生物群中的普遍成分，因其能够代谢多种低聚糖（oligosaccharides，OSs）、多糖和宿主衍生的聚糖（包括黏液）而闻名[102]。研究表明，拟杆菌属成员利用包括人乳寡糖（human milk oligosaccharides，HMOs）在内的乳聚糖作为可发酵的碳水化合物来源以促进其生长。某些被称为多糖利用位点（polysaccharide utilization loci，PULs）的基因簇参与黏蛋白的消耗，在以HMOs为培养基时，这些基因簇的表达会增加。通常，PULs负责编码传感器调节子、糖苷水解酶（glycoside hydrolases，GHs）以及两种外膜蛋白（即SusC和SusD）的同源物。这些蛋白有助于淀粉的结合和导入。拟杆菌基因组中的每个PUL似乎都负责检测和利用某种特定的OS或多糖。PULs很可能参与HMO的利用[102]。由于黏蛋白和HMO在结构上具有相似性，拟杆菌可能通过并行代谢过程分解HMO。在初始表面水解之前，拟杆菌在细胞表面结合复杂的OS，包括黏蛋白聚糖。这使得生成的OS能够通过SusC样孔蛋白穿过外膜进入周质空间进行进一步降解[103]。
黏蛋白糖蛋白通过阻止肠道细菌与肠道上皮的直接接触，并允许小分子从肠腔运输到上皮，对保护肠道上皮做出了重要贡献。包括拟杆菌和阿克曼氏菌在内的肠道细菌能够分解黏蛋白糖萼，而其他细菌，如婴儿双歧杆菌（Bifidobacterium infantis），则不能消耗黏蛋白聚糖。基于此背景，Karav等人通过比较非靶向质谱（mass spectrometry，MS）谱图，评估了几种肠道微生物组对结肠黏蛋白分解的影响。将9名被B. infantis EVC001定植的新生儿样本与10名被包括拟杆菌在内的高水平黏蛋白分解类群定植的儿童样本（作为对照）进行了比较。研究表明，被B. infantis定植的婴儿黏蛋白分解减少，表现为释放的结肠黏蛋白衍生O-聚糖的数量和种类均减少，且与双歧杆菌科呈负相关。B. infantis无法分解这些O-聚糖，导致拟杆菌科种群减少[104]。
脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）和普通拟杆菌（Bacteroides vulgatus）均已被证明对HMO处理敏感。利用基质辅助激光解吸电离傅里叶变换离子回旋共振质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry，MALDI-FTICR MS）研究HMO消耗情况显示，与双歧杆菌属表现出的对短链聚糖的偏好不同，拟杆菌能够有效利用多种HMO聚糖[71]。与B. vulgatus相比，B. fragilis对HMO的利用更优，这表明某些拟杆菌物种在新生儿肠道定植过程中可能更擅长利用HMO[105]。Kijdel等人通过生长曲线分析，研究了从新生儿粪便样本中使用优化技术分离出的几种拟杆菌分离株对六种常见HMO（2′-岩藻糖基乳糖（2′-fucosyllactose，2′-FL）、二岩藻糖基乳糖（difucosyllactose，DFL）、3′-唾液酸乳糖（3′-sialyllactose，3′-SL）、6′-唾液酸乳糖（6′-sialyllactose，6′-SL）、乳糖-N-新四糖（lacto-N-neotetraose，LNT）、乳糖-N-四糖（lacto-N-tetraose，LNnT））的消耗能力。分离株在结构上相似的HMO（如唾液酸化或岩藻糖基化糖）上经常表现出类似的生长特性。研究人员观察到同一物种的不同菌株在HMO使用上的差异性，并决定专注于一种能够利用测试HMO的Bacteroides dorei（B. dorei）分离株。出乎意料的是，之前已被确定为降解HMO的大多数GH家族并没有出现明显的上调，这可能是由于它们主要在双歧杆菌属中被特征化。B. dorei对HMO有广泛反应，在所有情况下都显著上调了许多共有的GH家族[106]。类型菌株B. fragilis（Bfra_TS）、B. vulgatus（Bvul_TS）和Bacteroides thetaiotaomicron（B. thetaiotaomicron）（Bthe_TS）在以1%的2′-FL、3′-FL和DFL作为唯一可用碳水化合物时表现出强劲的生长[107]。
根据研究结果，拟杆菌物种由于其与黏蛋白的结构相似性，能够以机会主义的方式水解HMO。另一方面，双歧杆菌已经产生了使其能够选择性利用人乳中特定聚糖结构的基因。这里的证据阐明了为什么双歧杆菌在婴儿肠道中的相对丰度可能高于其他利用HMO的细菌。
乳酸菌利用人乳低聚糖（HMO）的策略
乳杆菌属成员似乎利用这种碳源的能力有限，与双歧杆菌相比，它们对HMO的利用是一个相对未开发的领域。肠道乳杆菌的基因组中通常含有多种糖苷水解酶[108]。
尽管关于HMO利用的大部分信息都涉及双歧杆菌物种，但最近有研究表明，某些乳杆菌物种能够代谢特定的HMO以维持其生长[107,109]。消化道中的乳杆菌通常具有含有多种糖苷水解酶（GHs）的基因组[110]，这可能有助于膳食碳水化合物的利用。除N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）外，糖转运蛋白参与单糖和二糖的转运，这些糖主要与宿主聚糖无直接关联。这是已发现的大量糖转运蛋白的情况。乳杆菌中存在的磷酸烯醇式丙酮酸依赖性糖磷酸转移酶系统（PTS）负责这种单糖的内部化。这些系统主要存在于宿主黏膜中，并且在动物模型的肠道中，与这些系统相关的基因被激活[111]。
关于乳杆菌代谢HMO的知识大多局限于乳酸酪乳杆菌-副酪乳杆菌-鼠李糖乳杆菌群中的菌株。在乳杆菌中，已鉴定出三种α-L-岩藻糖苷酶，但仅在少数物种中发现。对于这种物种，尚未鉴定出针对唾液酸化HMO的唾液酸酶。L. casei的α-L-岩藻糖苷酶对短链岩藻糖基化低聚糖（FucOS）的作用表明其发生细胞内水解[112,113]。
关于先前称为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）的乳酸酪乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）代谢HMO的研究很少。对L. rhamnosus GG的全基因组测序发现了编码α-L-岩藻糖苷酶的基因，而对L. rhamnosus HN001的测序则发现了产生α-L-岩藻糖苷酶的基因[113]。后者在L. rhamnosus和整体乳杆菌中较为罕见，迄今为止，L. casei是已鉴定的唯一其他能够编码可在体外水解岩藻糖基化HMO的α-L-岩藻糖苷酶的乳杆菌物种[112]。
尽管某些嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus，L. acidophilus）菌株具有产生水解特定HMO所需酶的基因，但它们利用HMO的能力通常受到限制，并且高度依赖于菌株。L. acidophilus NCFM是一种特定菌株，能够在各种HMO上显著生长[71]。已证明L. acidophilus NCFM能够利用中性II型HMO乳糖-N-新四糖（LNnT），在以1% LNnT作为唯一碳水化合物源时，通过OD600nm测定的生长量在0.6至1.0之间[109]。Wang等人研究了L. acidophilus在某些碳水化合物底物（如葡萄糖（Glc）、HMO、低聚半乳糖（GOS）、低聚木糖（XOS）和2′-岩藻糖基乳糖（2′-FL））上的增殖能力。48小时后，L. acidophilus NRRL B-4495吸收了HMO，并少量摄取了HMO 2′-FL。菌株LDFT、LNT、LNFP和LNDFH利用HMO，产生乳酸和丁酸等有机酸，以及少量丙酸和戊酸[114]。乳杆菌、短双歧杆菌（B. breve）和长双歧杆菌（B. longum）可能采用一种“清除者”策略，以利用从宿主获取的、由肠道微生物群其他成员产生的短链聚糖[115]。
3.2.3. 人乳寡糖（HMOS）代谢副产物
微生物代谢产物与宿主的相互作用是肠道微生物塑造健康的过程之一。肠道对饮食中不可消化碳水化合物的发酵会产生一些可能有益的代谢产物，包括新生儿体内的人乳寡糖（HMOS）。研究最多的微生物代谢产物之一是短链脂肪酸（SCFAs），其中乙酸、丁酸和丙酸尤为受到关注。SCFAs不仅可作为结肠细胞的能量来源，还能影响宿主生理和免疫系统[116,117]。
生命最初几个月内肠道SCFA组成的变化很可能反映了肠道细菌群落的变化。尽管大多数肠道细菌都能产生乙酸（肠道中最普遍的SCFA），但只有一小部分肠道定植菌能够制造丁酸和丙酸[118]。由于这些差异，乙酸在出生时即可检测到，但随着能产生这些酸的细菌在体内定植，丙酸和丁酸的浓度在生命的第一年内逐渐增加[119]。相反，乳酸、琥珀酸和SCFA甲酸——其他较不常见的与SCFA相关的化合物——在生命最初的几个月中更为常见，并随年龄增长至一岁时减少[120]。
丁酸是一种必需的SCFA代谢产物，它通过与人乳寡糖（HMOS）交叉喂养的细菌在人体结肠中产生[121]。丁酸抑制组蛋白去乙酰化酶，并激活G蛋白偶联受体，作为结肠细胞的局部能量来源，具有多种生理效应[122]。另一方面，肠道腔和外周循环中都含有乙酸，它可以通过中枢稳态机制影响饥饿感，并通过GPR43信号通路促进脂肪形成[123]。丙酸被运输到肝脏，在那里执行多种生理过程，并作为糖异生的底物[124]。然而，短链羟基脂肪酸（如乳酸）以及肠道微生物产生的其他代谢产物（如甲酸和琥珀酸）的影响仍然大多未知[118,125]。
Frese等人（2017）的研究支持了HMOS、婴儿双歧杆菌补充和SCFA产生之间的关系。与母乳喂养的婴儿相比，补充了商业婴儿双歧杆菌菌株的婴儿粪便中乳酸、乙酸、丁酸和甲酸的含量显著降低[126]。研究者使用厌氧培养，研究了主要岩藻糖基化和唾液酸化HMOS对各种微生物细菌生长和代谢产出的影响。他们发现，在给予2′-岩藻糖基乳糖（2′-FL）、3′-岩藻糖基乳糖（3′-FL）和乳糖-N-二岩藻五糖（LDFT）时，双歧杆菌属和拟杆菌属细菌繁盛生长。另一方面，德氏乳杆菌、粪肠球菌和嗜热链球菌表现出生长缺乏和pH值降低。多种长双歧杆菌、脆弱拟杆菌和单形拟杆菌菌株表现出神经氨酸酶活性升高，并产生大量乳酸或SCFAs[127]。基于对人体培养微生物群进行的体外实验结果，已证明两种特定的HMOS，即2′-FL和乳糖-N-新四糖（LNnT），能够诱导双歧杆菌和SCFA的合成[128]。
3.2.4. HMO表征的高级分析方法
尽管聚糖结构的研究构成了一个独特的科学学科，即糖组学的一个子领域，但用于从人乳样品中分离寡糖（OSs）的全面分析技术仍在开发中。为了揭示这些寡糖结构的生物学功能，并据此设计更合适的婴儿配方奶粉，阐明这些结构至关重要。由于存在多种异构体，HMOs是具有不同单糖构建模块位置和连接的复杂结构，需要复杂的技术进行深入研究[129]。传统上，牛奶OSs的表征是通过核磁共振（NMR）、高pH阴离子交换色谱结合脉冲安培检测（PAD）或凝集素亲和性进行的。自质谱（MS）用于寡糖分析以来，已经应用了许多其他分析技术。这些技术包括亲水相互作用色谱和多孔石墨碳（PGC）分离，无论是否与MS联用或单独使用基质辅助激光解吸电离（MALDI）MS[130]。
液相色谱（LC）和毛细管电泳（CE）是用于HMO分析最常用的液相分离技术。LC采用多种固定相，提供反相、阴离子交换、多孔石墨化碳和亲水相互作用模式。LC方法的主要限制是需要寡糖标准品来确定保留时间，以便结合公开可用的聚糖库进行结构阐明。然而，这些标准品通常市面上无法获得，或者即使可获得，也往往价格昂贵或纯度不足[131]。对于CE，主要对未带电的碳水化合物进行衍生化，以促进其适当的电泳迁移。使用带电荧光标记物，如9-氨基芘-1,3,6-三磺酸（APTS），可将方法的灵敏度提高到10-12 M范围[132]。2007年，Bao等人设计并验证了一种基于毛细管电泳的技术，用于利用紫外检测测量12种主要酸性HMOS[133]。为了确定人乳样品中HMO标准品和OSs的存在，Volpi及其同事开发了一种CE技术，该技术使用254 nm波长的简单紫外检测。尽管存在乳糖和其他高浓度污染物，如过量的荧光团、蛋白质和盐，但这种CE方法仍能成功分离母乳中的主要中性和酸性OSs[134]。
高效阴离子交换色谱结合脉冲安培检测（HPAEC-PAD）由于其分辨异构体的能力，已被相当频繁地用于分离HMOs[130]。然而，在此之前，需要分离中性和酸性聚糖。反相高效液相色谱（RP-HPLC）是另一种非常流行的HMO分析技术[135]。另一方面，亲水相互作用色谱高效液相色谱（HILIC）有助于HMOs的分离，实现有效的异构体区分，但需要通过还原胺化用2-氨基苯甲酰胺对寡糖进行标记[136]。胶束电动毛细管色谱（MEKC）适用于天然带电的HMOs；然而，现有方法针对酸性HMOs设计，且灵敏度有限[133]。为了解决与MEKC相同的灵敏度限制，已应用多种毛细管电泳变体用于HMO分析。然而，为了满足这些限制，通常需要末端标记[137]。由于需要昂贵或不存在的标准品，基于分离的程序（如衍生化）在比较保留时间方面存在主要缺点。这在HMOs中尤为突出，因此质量鉴定是一种至关重要的分析工具[138]。
除了有效用于牛奶OS分析以进行结构表征外，MS在聚糖分析领域也被广泛应用。基于MS的糖分析中最常用的两种软电离技术是电喷雾电离（ESI）和MALDI。在MALDI电离中，激光束用于在样品被涂层或与能量吸收基质混合后将其电离[139]。使用此技术，分析物产生单质子化离子。相比之下，ESI使用电场将溶液相分析物转化为气相离子，产生多电荷离子[140]。为了提高灵敏度和在电离过程中稳定OSs，使用了全甲基化技术。此外，全甲基化产生可检测的碎片离子，并有助于防止MS分析过程中岩藻糖的重排。当MS与色谱或电泳分离技术结合使用时，可促进HMOs的结构鉴定[141]。然而，这需要额外的过程，并有可能由于衍生化不完全而使分析更加复杂。标准的RP柱（如C18）可能产生异构体分离；然而，它们并不能彻底分离异构体种类[142]。
斯塔尔（Stahl）等人首次报道了采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI TOF MS）对人乳寡糖（HMO）进行离线质谱分析，他们成功地在正模式下检测到中性寡糖作为单钠加合物，同时在正模式和负模式下检测到酸性寡糖。在酸性组分中发现了去唾液酸化片段[143]。例如，奥塞尔（Oursel）等人发表了一项使用液相色谱-质谱（LC-MS）对全甲基化HMO的研究[45]，该研究还比较了该技术与反相液相色谱（RPLC）和多孔石墨碳（PGC）分析的分析技术。通过分别使用PGC柱和RPLC柱，分离了天然HMO和全甲基化物种，并利用离子阱质谱设备鉴定了分离结果。研究发现，由于样品制备所需时间较短，PGC柱在高通量物种检测方面更为有效[144]。基于PGC固定相的LC-MS/MS技术的开发，实现了人乳中游离二糖乳糖-N-新四糖（LNB）和N-乙酰乳糖胺（LacNAc）的鉴定和定量。该技术监测了母乳喂养第一周内浓度的变化，并发现浓度持续下降。通过了解人乳中游离LNB与LacNAc的比例，可以更好地理解HMO的生物合成。当中性和酸性HMO在同一运行中同时评估时，异构体对乳糖-N-四糖（LNT）和乳糖-N-新四糖（LNnT）得到了良好分离。这是通过一种快速且简单的样品制备方法实现的。在这项特定研究中，色谱运行时间长是一个重要的限制因素[145]。所有讨论的研究主要集中在最常见的低分子量寡糖，并且仅报道了少数HMO。在最近且不断发展的工作中，斯坦（Stein）及其同事开发了一个可搜索的注释HMO参考质谱库。采用亲水作用色谱-电喷雾电离质谱/质谱（HILIC-ESI-MS/MS）技术描述了参考标准品，该库目前包含469个正离子和负离子的光谱[146]。由于参考标准品组合包含来自100名哺乳妇女的乳汁，该库能够鉴定人乳中未知的还原性或非还原性寡糖。在标准品不可用的情况下，这一知识为未来工作提供了一个有潜力的替代方案。糖组学研究中使用的另一项新技术是毛细管电泳-电喷雾电离质谱（CE-ESI-MS）。为了分析带负电荷的碳水化合物或用APTS标记的糖，需要将毛细管电泳（CE）系统与负电喷雾电离（ESI）检测相结合。在这种模式下，检测具有很高的选择性；然而，与正ESI模式相比，其灵敏度较低，且更易受到电晕放电的影响。为了解决这一问题，开发了一种CE-ESI-碰撞诱导解离（CID）-MS/MS技术，该技术使用了多个羰基反应性串联质谱标签（TMT）标记的HMO标准品[147]。
综上所述，直接质谱技术由于无需分离要求，可作为HMO分析的快速选择；然而，它们无法区分异构结构，这对于评估是否仅特定类型的连接受到影响可能是必要的。
4 HMO的潜在功能是什么？
鉴于HMO的独特结构，过去十年中，其对婴儿健康和发育的影响已得到广泛研究（图4）[148-150]。
图4. 母乳低聚糖（HMOs）对人类健康的益处[19]
4.1. HMO作为有益细菌的生长因子
根据罗伯弗罗伊德（Roberfroid）等人的定义，益生元是一种选择性发酵的物质，能够使胃肠道微生物群的组成和/或活性发生特定变化，这些变化最终对宿主的健康和福祉产生有益影响[151]。HMO是特定细菌（如婴儿双歧杆菌）的代谢底物。因此，这些细菌具有生长优势并繁荣生长。其他无法利用HMO的细菌则处于劣势，表现出生长减少或无生长。因此，HMO是人们饮食中最初遇到的益生元，通常从出生时开始。细菌利用HMO需要一系列全面的酶、转运蛋白和辅助化合物。一些细菌已经与HMO酶一起发展，并产生分解唾液酸（Sia）的唾液酸酶和分解岩藻糖（Fuc）的岩藻糖苷酶。只有少数细菌能够分解整个范围的HMO。一些细菌只能选择性地利用有限范围的HMO或更复杂HMO上的特定表位[71,152]。例如，具有特定岩藻糖苷酶的细菌可能能够摄取岩藻糖，但不能摄取唾液酸。只有在其他细菌从骨架中消除岩藻糖或唾液酸后，一些细菌才能有效利用HMO，从而形成“社区盛宴”，其中多种细菌可以共同分解完整的HMO集，但前提是它们作为一个社区发挥作用[8]。
在肠道中，HMO能够改变微生物群，促进双歧杆菌、厚壁菌门和放线菌门的生长。在结肠中，HMO能够诱导双歧杆菌、拟杆菌属和毛螺菌科的增殖。同时，HMO减少了对人体健康有害的细菌数量。这些细菌包括肠道中的肠球菌、变形菌门、链球菌和乳杆菌，以及结肠区域的罗氏菌、肠球菌和梭菌（图5）[153]。
图5. 母乳低聚糖（HMOs）促进短链脂肪酸（SCFAs）的释放及特定肠道菌株的生长，这些菌株对个体健康有益[19,149]
图5. 母乳中的高浓度母乳低聚糖（HMOs）是影响婴儿肠道微生物群种类选择的最有力决定性因素之一。双歧杆菌是一种厌氧革兰氏阳性菌，属于放线菌门，通常被认为通过多种过程（包括短链脂肪酸（SCFAs）的产生）对人体有益[154]。1900年，蒂西耶在巴斯德研究所的工作中首次观察到，与喂食配方奶的新生儿相比，喂食母乳的新生儿粪便中双歧杆菌的浓度更高[79]。双歧杆菌属中的重要成员会选择性地摄取婴儿肠道中的这些HMOs[155]。在母乳喂养的婴儿粪便中，双歧杆菌菌株占整个细菌种群的50%至90%，是肠道中最主要的定植菌[81]。特别是婴儿双歧杆菌长亚种（B. longum subsp. infantis），它是一种有效的HMO利用菌种，与婴儿健康优势相关。
由于双歧杆菌具有广泛的碳水化合物活性酶谱，使某些双歧杆菌菌株能够利用母乳中产生的聚糖（如HMOs），因此双歧杆菌已成功适应新生儿肠道[153,156]。根据Gibson等人（2017年）的研究，HMOs作为益生元，通过促进有益肠道细菌的生长，这些细菌产生对肠道健康至关重要的SCFAs。益生元是“宿主微生物选择性利用并赋予健康益处的底物”[157]。
新生儿肠道中双歧杆菌的播种、扩展和优势地位的确切机制尚不完全清楚；然而，HMOs被视为一种重要的营养素，可促进HMO分解代谢型双歧杆菌种群的增殖[158,159]。HMOs是复杂的化合物，需要细菌的糖苷水解酶（GHs）和转运机制进行分解代谢，因此它们是一种仅供特定微生物群利用的专门营养。研究表明，母乳喂养婴儿中HMO的摄入量与特定双歧杆菌菌株的增殖以及粪便中乙酸和乳酸浓度的升高之间存在相关性。人乳对婴儿肠道微生物群形成的影响尚不明确，这归因于其中存在溶菌酶、乳铁蛋白和抗菌肽等生物活性成分[160–164]。
众多研究表明，高水平的HMO利用型双歧杆菌与粪便中HMO的显著减少呈正相关[165,166]。为了在体外分解代谢HMOs，使用了来自长双歧杆菌的特定β-半乳糖苷酶。该酶能够与新生儿粪便样本中鉴定出的化学物质相匹配[167]。Borewicz等人（2019年，2020年）研究了母乳中HMOs与健康新生儿粪便微生物群组成变化之间的关系。他们发现，粪便微生物群组成的变化与新生儿利用HMOs（特别是2′-岩藻糖基乳糖（2′-FL））的能力有关。婴儿体内乳杆菌和双歧杆菌的高水平与2′-FL摄入量较高相关。摄入更多乳-N-六糖的婴儿体内双歧杆菌丰度更高[48,168]。拟杆菌与称为3′-唾液酸乳糖（3′-SL）、6′-SL、LST a、LST b和LST c的唾液酸化HMOs的分解有关。这项研究证实了Yu等人（2013年）的发现，即脆弱拟杆菌（B. fragilis）、普通拟杆菌（B. vulgatus）和单形拟杆菌（B. thetaiotaomicron）将这些作为唯一的碳源[127]。
De Leoz等人（2015年）对两名阴道分娩的婴儿的粪便进行了采样研究。新生儿B接受母乳喂养并补充配方奶，而新生儿A从出生起就接受母乳喂养。采用16S rRNA测序研究微生物组成。结果表明，从非HMO利用型细菌到HMO利用型细菌（拟杆菌科和双歧杆菌科）的转变。但在新生儿A中，双歧杆菌物种占主导地位，而在婴儿B中，HMO水平急剧下降[165]。
随后的研究探讨了双歧杆菌属对HMOs的利用。Ward等人报告称，婴儿双歧杆菌ATCC 15697将HMOs作为其唯一的碳源[169]。此外，Garrido等人证明，婴儿双歧杆菌分离株在混合HMOs和单个HMO糖上茁壮成长，而某些研究的双歧杆菌双歧亚种（B. bifidum）菌株无法以2′-FL和6′-SL作为唯一碳源生长[170]。双歧杆菌主要代谢HMOs，某些菌株表现出增强的发酵能力和对特定种类的增加摄取。因此，多项研究致力于阐明双歧杆菌分解代谢HMOs的过程，表明HMOs的利用在婴儿双歧杆菌菌株中始终得到保留，这些菌株能够发酵所有类型的HMOs[86,158]。例如，婴儿双歧杆菌ATCC 15697能够代谢多种HMOs，包括唾液酸化和岩藻糖基化的分子[86]。由于基因组中特定区域（称为HMO簇I）表达了大量HMO利用基因，因此糖苷水解酶[110]和家族1溶质结合蛋白（SBPs）（HMO的ABC转运蛋白组分之一）[111]被上调。
Yu、Chen、Kling等人（2013年）发现，在体外厌氧发酵过程中，双歧杆菌有效地消耗了2′-FL和3′-FL，并且几乎无法利用岩藻糖基化HMOs的产气荚膜梭菌和大肠杆菌的生长因乳酸和SCFA浓度的增加而受到显著抑制[171]。
益生菌和益生元的组合，即合生元，具有潜在的协同作用，可能增强婴儿配方的功能性质。Lee等人评估了含有路氏乳杆菌（L. reuteri）、低聚半乳糖（GOS）和低聚果糖（FOS）的配方在健康足月新生儿中的安全性。当代婴儿配方合成经常整合益生元和益生菌以提供协同作用（合生元）。FOS/GOS和L. reuteri DSM 17938的混合物与仅含益生菌的对照配方相比，显示出双歧杆菌计数的增加[172]。Alliet等人发现了相同的结果，表明与仅接受益生菌的对照组相比，补充了2′-FL和L. reuteri DSM 17938的婴儿配方中粪便双歧杆菌计数显著增加[173]。
4.2 母乳低聚糖的抗感染特性
通过作为可溶性诱饵受体，HMOs阻止感染，而细菌、病毒、真菌和原生动物寄生虫则附着在糖萼上以侵入宿主。这些受体通过与病原体结合，阻止它们附着在上皮细胞表面的受体上，从而实现安全通道[174,175]。
4.2.1 细菌感染
HMOs作为益生元，为有益微生物提供了相对于病原体的选择优势，从而保护婴儿免受感染性疾病的侵害。由于致病细菌代谢HMO种类的能力较弱，因此共生菌可以通过竞争性排斥增殖并击败危险的入侵者[176]。此外，双歧杆菌HMO代谢产生的有机酸创造了一个酸性环境，抑制有害细菌的生长[177]。HMOs不仅通过作为可溶性受体诱饵间接阻止病原体入侵，而且还直接阻止。覆盖在上皮细胞上的碳水化合物层称为糖萼，由与蛋白质或脂质连接的聚糖组成[178]。致病细菌用于附着在上皮细胞表面的聚糖与HMOs的化学结构相似[179]。因此，识别并结合HMOs而不是细胞表面聚糖的病原体和有毒物质将穿过胃肠道而不会引起疾病。寡糖（OSs）可能通过竞争性结合宿主细胞表面受体来抑制感染[180]。
新生儿腹泻致死最常见的原因之一似乎是空肠弯曲菌[181]。由于2′-FL作为空肠弯曲菌的可溶性诱饵受体，它减少了80%的定植[182,183]。肠道致病性大肠杆菌（EPEC），婴儿腹泻疾病的主要原因，在预先与HMO成分混合物孵育后，其定植的可能性大大降低[184]。
除了减少病原体粘附和入侵外，HMOs还可以改变上皮细胞表面基因表达并阻止病原体发育以减轻感染。用HMOs预孵育后，Caco-2Bbe肠道细胞中介导肠道上皮细胞对单核细胞增生李斯特菌粘附的基因会因eIF2信号传导和未折叠蛋白质反应被激活而下调[185]。研究发现，HMOs可影响B族链球菌（GBS）的生长和生物膜形成，剂量范围为1至2 mg/L，导致高达96%至98%的延迟。乳糖-N-新四糖（LNT）和乳糖-N-二岩藻糖基新四糖-I（LNDFH-I）表现出最强的抑制能力[186]。
4.2.2. 病毒感染
病毒感染对公共健康构成重大威胁，尤其是考虑到流感疫苗和轮状病毒疫苗的存在。病毒的进化变异以及抗病毒药物的稀缺性阻碍了疫苗接种和长期治疗的疗效。人乳低聚糖（HMOs）在预防多种病毒感染方面发挥着重要作用。它们促进免疫系统的成熟，调节Th1/Th2细胞因子反应，并通过促进上皮细胞成熟以及影响微生物群的多样性和共生肠道细菌的生长来提供对病毒感染的保护。HMOs通过模拟糖缀合物的糖链发挥抗病毒作用，这些糖链是细胞表面不附着于细胞的碳水化合物[187]。在感染早期，病毒会识别宿主血型中的唾液酸化糖蛋白和碳水化合物作为受体。通过使用与这些聚糖具有结构相似性的任何碳水化合物作为受体诱饵，可以避免早期感染。人乳中含有分泌型血型碳水化合物，包括唾液酸化糖蛋白和岩藻糖基化Lewis抗原，有助于抵御病毒感染。
HMOs与上皮细胞表面聚糖具有结构相似性，可以通过充当可溶性诱饵受体或通过与上皮表面相互作用间接阻碍病毒附着，从而抑制病毒病原体的定植[188]。在病毒感染过程中，碳水化合物与凝集素之间的相互作用等是非常必要的[189]。先天性免疫系统中存在模式识别受体，负责识别病原体。另一方面，病毒表面凝集素识别人类上皮细胞表面的聚糖，这对于感染过程中识别宿主至关重要。已对HMOs进行了研究，以探索其通过模仿上皮细胞表面聚糖来抵御病毒入侵的潜力。它们具有免疫调节作用，可减少流感、轮状病毒、呼吸道合胞病毒、HIV、诺如病毒以及可能与病毒感染相关的坏死性小肠结肠炎（NEC）的感染[190]。
HMOs可以增强新生儿对由轮状病毒和诺如病毒引起的两种致命胃肠道疾病的免疫力[191]。机制研究表明，HMOs通过模仿受体位点以阻碍病毒进入宿主细胞[192]，并通过产生γ-干扰素和IL-10增强免疫力以降低病毒毒力[193]，从而提供对病毒感染的保护。岩藻糖基化和唾液酸化的HMOs通过充当诱饵受体来减少轮状病毒感染，但在猪轮状病毒模型中，3′-唾液酸乳糖（3′-SL）和6′-唾液酸乳糖（6′-SL）降低病毒感染性的效果更为显著[191]。
一旦摄入，HMO就会包裹在喉咽部周围。具体而言，据预测，它将减少病原体在入侵部位呼吸道粘膜上皮细胞上的附着[194]。该研究调查了HMOs对病毒感染进展和细胞因子表达的影响。结果表明，当HMOs的浓度低于母乳中的浓度时，它们可以增强对呼吸道病毒的先天性免疫力，并可能影响先天性免疫反应。固定的附着物，如3′-SL和6′-SL，会阻碍流感病毒的血凝作用，从而阻止感染[195,196]。已发现含有HMO部分的额外唾液酸残基对流感病毒表现出结合亲和力。根据一项临床前研究的结果，2′-岩藻糖基乳糖（2′-FL）可能改善小鼠对疫苗接种的反应，从而增强体液免疫反应和细胞免疫反应。这可能是由于该化合物对免疫细胞形成的直接影响[197]。
HMOs可以通过抑制诺如病毒附着于上皮组织表面来对抗它们。这些化合物模仿血液活性黏蛋白型O-聚糖，并有能力与病毒聚糖受体竞争。尽管我们对HMOs的理解有限，但2′-FL三糖，一种次要但普遍存在的HMO，能够有效地抑制病毒结合[193,198]。与人类诺如病毒相似，已发现对某些轮状病毒基因型的敏感性与个体的血型状态相关。动物实验已显示轮状病毒与HMOs的选择性相互作用。幼猪被喂养HMOs或它们的组合，然后暴露于猪轮状病毒毒株。喂养低聚半乳糖（GOS）和低聚果糖（FOS）组合的仔猪腹泻持续时间缩短。喂养HMOs的猪NK细胞增加了两倍，嗜碱性粒细胞增加了五倍[193]。
4.2.3. 真菌感染
系统性念珠菌病侵袭率高达10%，妊娠早期婴儿死亡率达20%，肠道真菌对新生儿健康有显著负面影响[199]。
本研究旨在评估人乳低聚糖（HMOs）在保护人类早产儿肠上皮细胞（pIECs）免受白色念珠菌（一种常见的早产儿肠道定植真菌）侵袭方面的效果。在15 mg/mL的生理剂量下，HMO治疗使白色念珠菌对pIECs的侵袭率降低了14%~67%，平均降低52%。酵母接种后菌丝发育延迟，菌丝长度缩短了30%。因此，与菌丝形成相关基因的总表达水平降低了23%。在菌丝诱导过程中，HMOs还减少了能够附着于pIECs的白色念珠菌细胞数量[200]。
4.3. HMOs调节上皮细胞反应
HMOs既可直接影响微生物，也可通过改变宿主细胞的反应间接影响微生物。已证明HMOs可调节肠上皮细胞的凋亡、增殖和分化[201]。肠屏障再生是通过在绒毛基部生成上皮细胞，然后这些细胞迁移到肠腔并分化而实现的。肠上皮细胞负责食物吸收，而杯状细胞则分泌粘液以保护肠腔免受有害微生物的侵害[202]。调节上皮细胞增殖是必要的，以防止细胞增殖过度刺激，这可能导致肠道癌症的发生[203]。
HMOs已证明可改变肠上皮细胞的基因表达，从而改变细胞表面糖萼。除了之前证明的作为可溶性诱饵受体的作用外，HMOs还可通过重编程上皮细胞来改变糖萼受体的表达，从而影响微生物-宿主相互作用[204]。中性HMOs通过分化和/或死亡阻碍肠道细胞增殖，可能影响肠屏障的发育。它们在体外诱导分化，增强上皮屏障处理营养物质的能力[205]。Perdijk及其同事证实，唾液酸化HMOs在体外对肠道细胞稳态有影响，这强调了HMOs对上皮细胞的有益作用[206]。
在婴儿双歧杆菌发酵后，HMOs也对上皮细胞产生间接影响。根据一项研究，婴儿双歧杆菌条件培养基（BCM）提高了HT-29或Caco-2Bbe细胞中连接粘附分子和闭合蛋白的表达，这可以促进肠屏障功能[207]。此外，BCM通过上调claudin-1蛋白的产生来加强肠屏障[208]。BCM还可能通过NF-κB途径抑制IL-1b激活，从而保护Caco-2Bbe细胞[209]。
肠道细胞对HMOs的吸收可影响上皮细胞的蛋白质表达。酸性低聚糖通过非特异性细胞旁通道转运，而中性低聚糖则通过涉及受体途径的细胞旁或跨细胞途径转运[210]。此外，在生物体内也显示了HMOs对基因表达的影响，揭示向大鼠添加唾液酸化HMOs可改变肠道基因表达并调节肠道糖组的组成[211]。
根据一项研究结果，以2′-岩藻糖基乳糖（2′-FL）进行膳食干预后，接种流感疫苗的小鼠体液免疫和细胞免疫反应均有所增强。这是通过增加迟发型超敏反应的数量、增加疫苗接种后特有的免疫球蛋白增殖的血药水平，以及增加CD4+和CD8+ T细胞的产生，以及在给予2′-氟尿嘧啶的小鼠脾细胞中增加干扰素-γ的产生来实现的[197]。
4.4. 其他
4.4.1. 大脑发育
HMOs是代谢副产物，可促进大脑发育，促进神经元通信和突触形成，从而为大脑发育和认知功能提供重要营养素[212]。大脑的发育和功能活动在很大程度上依赖于与蛋白质和糖脂结合的唾液酸（Sia）[213]。鉴于母乳中唾液酸的大量需求和丰富浓度，其在早期生命中至关重要[214]。如今，几个基础研究模型提供了证据，表明唾液酸乳糖对大脑和认知发育有影响。膳食补充2′-FL可改善啮齿类动物的学习和记忆能力，影响认知领域[215]。除了HMOs的益生元功能和微生物群对脑-肠轴的影响外，最近的研究还表明，岩藻糖基化的HMOs（如2′-FL）在体外模型中可减少结肠运动收缩[216]。
研究表明，母乳中HMO A-四糖（由A型血型的母亲产生）含量较高的后代，其表达性和接受性语言技能发展更好[217]。在一项对485名马拉维母乳喂养婴儿的研究中，婴儿接受FUT2阳性母乳，发现总唾液酸化HMOs（尤其是总岩藻糖基化HMOs的浓度）与语言发展呈正相关。相反，非唾液酸化和非岩藻糖基化HMOs的结构则呈现出不利关系[218]。类似地，一项涉及76人的试点研究发现，1个月时母乳中6′-唾液酸乳糖（6′-SL）的水平与18个月时的综合认知评分呈正相关[219]。
涉及肠道微生物群代谢产物的肠-脑通信途径可能很重要。因此，在这个不断发展的领域，需要采用特定HMOs进行严格控制的干预研究，以证明其因果关系。
4.4.2. 坏死性小肠结肠炎（NEC）
NEC是一种严重且常致命的肠道疾病，影响5%10%的低出生体重早产儿，导致超过25%的死亡率。存活的婴儿常出现神经功能障碍，而母乳喂养的婴儿出现这些问题的可能性较低[220,221]。尽管过去1015年婴儿配方奶有所进步，但配方奶喂养和母乳喂养新生儿患NEC的风险差异仍然持续存在。HMOs继续增强母乳的预防特性[222]。
如前所述，摄入的HMO化合物能抵抗胃酸和肠道吸收。它们几乎完整地进入小肠，被认为可直接与肠腔微生物和肠上皮细胞相互作用[65]。Kuntz等人表明，HMO可抑制肠上皮细胞的生长[201,223]。与此发现一致，另外还发现HMOs可促进由人类肠类器官生成的和NEC实验模型中产生黏蛋白-2（Muc2）的杯状细胞的发育[224]。Autran等人[225]和Van Niekerk等人[226]进行的人类观察性研究发现，母乳中低浓度的二唾液酸-N-四乙酰基神经氨酸（DSLNT）与早产儿患NEC的风险增加相关。Masi等人[227]报告，与年龄匹配的对照组相比，患NEC婴儿的母乳中DSLNT含量显著较低。食用低DSLNT母乳的婴儿双歧杆菌属的相对丰度较低。此外，Wejryd等人发现，与非NEC婴儿相比，NEC新生儿母亲的母乳中HMO多样性和乳-N-二岩藻六糖I（仅由分泌型和Lewis阳性女性产生）的水平均较低[228]。
母乳中HMO谱与NEC风险之间的关联引起了人们对向易感新生儿提供HMOs作为预防措施的兴趣。然而，由于遗传影响和分娩时的妊娠阶段，改变母乳中的HMO谱具有挑战性。利用捐赠的人乳有几种可行的应用。
4.4.3. HMO与过敏
过敏反应是工业化国家的一个重大公共卫生问题；然而，目前还没有证明有效的治疗过敏反应的方法。过敏性疾病与免疫耐受破坏、微生物群失调和上皮通透性增加之间存在相关性。由于这些问题可在生命第一个月内被识别，因此提出这样一个观点：这些生物系统可能在婴儿早期就被预先编程，从而可能降低之后发生过敏反应的可能性。HMOs通过其益生元特性和免疫调节作用，提供了错综复杂的途径，可改变个体对过敏的易感性。在这一特定背景下，迄今为止仅进行了少数临床前和临床研究[229]。Nowak-Wegrzyn及其同事进行了一项干预性研究，旨在确定对牛奶过敏的婴儿是否能接受一种经过深度水解并补充了两种HMOs的配方奶。根据研究结果，含有2′-FL和乳糖-N-新四糖（LNnT）的乳清配方奶在临床上具有低致敏性，可有效治疗新生儿和幼儿的牛奶蛋白过敏[230]。在研究β-乳球蛋白诱导的小鼠牛奶过敏模型时，Liu等人最近发现，补充2′-FL四周可降低血清中IgE和β-乳球蛋白特异性IgE的水平，并增加抗炎细胞因子IL-10、TGF-b和IFNg的水平，与未补充2′-FL的过敏小鼠相比，从而预防过敏的发生[231]。在模拟食物过敏的小鼠模型中，HMOs被证明是治疗或预防过敏症状的有效候选药物。事实上，与未补充的过敏小鼠相比，补充2′-FL的过敏小鼠过敏症状（如腹泻和体温过低）减轻，且抗原介导的肥大细胞蛋白酶1产生受到抑制。研究人员还观察到被动性皮肤过敏反应减弱[232]。
补充方法、浓度和HMO类型的差异都会导致临床试验结果不一致，这使得理解HMOs如何影响过敏性疾病变得更加困难。创新方法可能有助于阐明这一问题。
4.4.4. 心血管疾病
当前正对现已步入成年早期的早产儿的心血管健康状况进行持续研究。早期接触母乳可能通过阻止发生的病理生理变化，对预防心血管疾病具有益处，从而可能避免成年后心血管疾病风险的发展。随着对人类乳汁成分理解的深入，人们越来越认识到人乳在短期和长期心血管健康中可能发挥的作用。这些信息还可能揭示人乳作为心血管保护剂的机制[233]。尽管已证明婴儿会吸收人乳低聚糖（HMOs），且HMOs在控制免疫和炎症反应中起着重要作用，但HMOs对于心血管系统及其早期发育是否特别关键仍不得而知。动物研究表明，HMOs在促进由一氧化氮（NO）介导的血管扩张中具有特殊作用。这可能是其参与避免坏死性小肠结肠炎（NEC）的因素之一。因此，通过NO机制促进血管扩张也可能有助于维持新生儿血流动力学，并支持心血管系统和心脏的正常发育[234]。
研究表明，母乳喂养对母亲的心血管健康有积极影响，这些益处可能与促进极度早产新生儿心血管发育的益处相重叠。可能存在剂量-反应关系，这对婴儿的代谢健康，包括维持脂质稳态和葡萄糖分解具有有益影响。需要更多研究来验证这些方法[235]。
5. 人乳低聚糖生产的创新方法：替代来源和应用
由于生物工程微生物领域的最新突破，这些微生物利用基础糖类生产复杂的人乳低聚糖，使得人乳低聚糖现在能够大规模且以相对较低的成本生产[236]。尽管合成但结构上等效的人乳低聚糖现已被纳入初步的婴儿配方中，但其在母婴环境之外的应用目前正在研究中。
与用于人类营养的饲养动物乳汁相比，后者仅含有极少量的低聚糖（OSs）[237]，而人乳中含有相当数量的多种人乳低聚糖。为了弥补动物乳汁衍生的母乳替代品与婴儿营养之间的差距，可以采用多种技术方法。例如，可以浓缩动物乳汁中富含OS的部分，从而获得某些OS，如唾液酸乳糖。然而，由于初始含量较低，这种方法在技术上具有难度。相反，可以通过化学、酶促或生物技术方法合成单个人乳低聚糖[238]。
目前，利用细菌发酵的几种生物技术是经济上最可行的技术[19]。市场上可获得少量不同的人乳低聚糖，它们是母乳中最常见的人乳低聚糖之一[4]。大多数人乳低聚糖存在于人乳中，但在其他哺乳动物的乳汁中含量较少且结构较简单[239]。非人灵长类动物的乳汁在低聚糖的数量和结构多样性上表现出相当大的差异。人乳中低聚糖数量和组成极其独特的原因尚不清楚。然而，这种特殊性给研究人乳低聚糖的生物学意义带来了重大挑战[240]。
人乳低聚糖分离和合成技术的进步极大地影响了人乳低聚糖的研究，使得可获得的人乳低聚糖种类和数量更多。这促进了体外和体内科学研究，揭示了人乳低聚糖的可能益处。已发表的数据引起了新的关注，促使更多资源的投入，并加速了人乳低聚糖分离和合成技术的发展（表1）[236]。
表1. 不同方法生成人乳低聚糖（HMOs）的优势与挑战[56,236,241]。
5.1 从人乳捐赠者和乳制品流中分离低聚糖
在研究过程中，人乳通常被分离出来用于多种目的，包括结构表征、体外发现研究和分析标准的开发。人乳这一复杂基质中包含多种生物成分，这些成分包括碳水化合物、脂质、蛋白质、细胞和代谢物。通过使用有机溶剂或膜过滤使蛋白质沉淀，并通过离心或溶剂萃取从低聚糖（oligosaccharides, OS）组分中去除脂肪[129]。凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography, GPC）、离子交换色谱（ion-exchange chromatography, IEC）和亲和色谱（affinity chromatography, AC）是以往多项实验中成功分离微量人乳低聚糖（human milk oligosaccharides, HMOs）所采用的方法。近年来，制备型高效液相色谱（high-performance liquid chromatography, HPLC）已发展成为一种从天然来源中提取大量化合物的有价值方法[242]。
从人乳中分离的HMOs除用于研究外，还有潜力供人类食用，特别是营养不良的新生儿。对于无法获得母乳或需要补充剂的婴儿，世界卫生组织（World Health Organization, WHO）和联合国儿童基金会（United Nations Children's Fund, UNICEF）建议使用捐赠人乳[241]。捐赠乳的处理现在非常重视确保安全性和保留乳汁的营养及生物学特性。然而，为了进一步提升人乳中某些成分以提供特定的健康益处，引入了额外的加工步骤。例如，Prolacta Bioscience开发了一种由人乳制成的奶油补充剂，该补充剂增加了食物的热量密度，使极低出生体重的早产儿能够更早出院[243]。最近发现乳清透过液中含有低聚糖，这为工业合成与人乳中低聚糖相似的低聚糖提供了一种可行选择。研究表明，牛奶中的低聚糖能穿过乳制品行业通常使用的超滤膜，从而存在于乳清透过液中[244]。
人乳衍生的HMO产品，包括特定的HMO或低聚糖组合，获得了其他地方无法获得的多种HMO。然而，分离过程需要大量具有内在变异性的捐赠人乳，这带来了显著的成本和伦理难题。因此，需要其他来源来生成供人类食用的HMO，包括饮食或药理成分，以解决这些限制[241]。
由于HMO的有限可用性和与其使用相关的伦理限制，HMO的获取不足以满足干预性临床研究的需求，更不用说作为成分商业化。可能与人乳低聚糖具有结构相似性的牛乳低聚糖（bovine milk oligosaccharides, BMOs）和羊乳低聚糖（caprine milk oligosaccharides, CMOs）能够执行彼此相似的生物功能。已发现来自人乳和牛乳的唾液酸化低聚糖在促进营养不良新生儿生长方面同样有效[245,246]。
BMO的表征一直是持续的研究重点，但由于其复杂性和低浓度，其研究仍然具有挑战性。分析技术的最新进展使得能够全面注释迄今未表征的低聚糖，这对于评估建立这些低聚糖商业来源的可行性至关重要[247,248]。BMO包含HMO中存在的基本单糖；然而，其数量显著较低，在牛初乳中为0.7至1 g/L，在成熟牛乳中仅为微量[249]。尽管如此，其有限的可用性使得工业利用不可行[250]。鉴于成熟牛乳中的数量有限，必须确定浓缩这些关键营养成分的技术[236,251,252]。
近年来，CMO因其羊奶作为乳制品行业重要原料的地位、被视为新生儿配方奶粉的合适蛋白质来源以及相比牛乳含有更多量和更多样性的低聚糖而备受关注[253]。CMO在成熟乳中的含量为0.06至0.35 g/L，在初乳中为0.2至0.65 g/L。已有78种CMO化合物，其中40种已在文献中得到充分表征。与BMO类似，超过80%的CMO由唾液酸化低聚糖组成，包括Neu5Gc和Neu5Ac唾液酸。CMO中Neu5Gc与Neu5Ac的比例远高于BMO[254]。
研究人员致力于通过利用基于膜的技术来增强BMO和CMO。这是因为可以从乳制品加工中收集副产品，用于提取低聚糖（图6）。富集过程中的主要问题是在大量乳糖（Lac）中发现痕量BMO或CMO。王和余研究了从乳制品副产品（包括脱乳糖透过液、乳清和透过液）中富集BMO和CMO的膜分离过程[255]。
图6. 通过膜技术从乳制品中提取低聚糖[241]。
乳制品流和人乳中低聚糖（OS）的有限可用性和组成变异性使得除了乳糖（Lac）外，从乳制品流中提取牛乳低聚糖（BMO）和羊乳低聚糖（CMO）成为一个繁琐的过程。一个更具成本效益的替代方案是生产富含低聚糖的产品，如富含BMO的乳清；然而，需要进行成本效益分析以确定最佳制造技术和工业用途。
5.2 化学合成
人乳低聚糖（HMO）的制造以及碳水化合物化学的课题已得到充分研究。但与其他生物聚合物合成相比，碳水化合物的合成面临更大的困难。HMO的生物活性取决于精确的立体化学连接和适当的结合。糖苷键的立体选择性合成需要生成具有区域选择性保护的羟基基团和活化的糖基衍生物[256]。
HMO的化学合成涉及羟基基团的选择性保护、糖基供体活化为亲电中间体以及保护性基团的去除以供后续过程或最终目标分子使用。主要技术包括线性合成、汇聚合成、一锅合成和固相合成。
Schmidt和Thiem（2010年）使用唾液酸乳糖衍生物和甲基乳糖成功合成了LST。合成过程分为五个阶段，每个阶段使用不同的保护和去保护过程。最终产品产率为49%[257]。由于该技术仅需要一个纯化步骤，因此简化了流程，从而能够在千克规模上合成最常见的结构较简单的HMO——2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL）。该方法并非旨在应用于婴儿配方奶粉，而是对分析和测试过程非常有益[258]。
劳动密集型且多步骤的纯化方法导致化学合成HMO的产率较低，范围从20%到55%，这增加了制造成本。此外，去保护过程中使用的有害化学物质限制了化学合成在HMO生产中的应用[258]。因此，化学合成方法主要用于生成结构精确的HMO，用于功能和结构-活性关系研究。近年来，化学合成已用于提供化学酶合成的特定前体。
5.3 酶促合成
酶促合成无需繁琐的羟基基团保护和去保护步骤即可实现区域选择性和立体选择性，是化学合成的可行替代方案。
为了促进糖苷键的合成，糖基转移酶（GTs）负责将活性核苷糖供体转移到糖基受体上。在酶促合成过程中，二糖单元如Galβ-1,4-Glc、Galβ-1,3-GlcNAc和Galβ-1,4-GlcNAc作为受体发挥重要作用。另一方面，核苷糖如UDP-Glc、UDP-GlcNAc、UDP-Gal、GDP-Fuc和CMP-Neu5Ac是主要供体。由于它们的化学性质和稳定性较差，因此难以确定适合大规模生产的GTs。研究人员利用高通量筛选、重复批式合成和酶固定化技术研究了核苷糖的合成，以降低成本[259]。然而，核苷糖供体的稳定性有限且成本高昂，继续在大规模生产中构成重大障碍[260]。糖苷水解酶（GHs）也可通过促进转糖基化而非水解来用于糖苷生产[261]。已创建水解活性降低的工程化GHs，以提高区域选择性、底物特异性和产率，从而有效催化转糖基化形成HMO[261-263]。
另一方面，对于唾液酸糖的合成，已使用唾液酸转移酶。通过使用来自不同来源和供体的这些酶与乳糖反应，已生产出较简单的结构，如3'-唾液酸乳糖（3'-SL）和6'-唾液酸乳糖（6'-SL）。例如，一种多杀巴斯德氏菌（Pasteurella dagmatis）唾液酸转移酶表现出双重唾液酸酶活性，并从κ-酪蛋白糖巨肽（cGMP）转移唾液酸，以适量产生两种唾液酸乳糖[264]。通过使用基因工程改造的多杀巴斯德氏菌酶和胞苷-5'-单磷酸-N-乙酰神经氨酸（CMP-Sia）作为供体，以两倍于先前的产率生产了相同的产品[265]。一些研究人员研究了在乳基质中直接制备各种HMO。例如，通过使用两种来自原生动物锥虫属（Trypanosoma rangeli）的突变型转唾液酸酶对乳糖进行酶促唾液酸化，获得了3'-SL[266]。
在另一项研究中，Zeuner等人（2019年）将产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）岩藻糖苷酶的氨基酸序列片段与双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）的氨基酸序列片段融合，以缩合3'-FL和LNT，实现了LNFP II的产率为39%，同时降低了杂合酶的水解活性[267]。
该方法比化学方法生成更多结构复杂的HMO，并促进了实验室规模试验中HMO生物功能的研究。尽管酶促合成具有较高的效率，但这些程序可生成的HMO结构范围受到底物特异性和糖苷酶可用性的限制。一个主要焦点是开发提供更高特异性和活性同时降低制造成本的稳定酶。
5.4 化学酶促合成
由于HMO的多样性和复杂性，其表征、定量和生物功能研究继续是一个重大问题。标准化HMO库的统一获取对于解决学术界多年来面临的长期挑战至关重要[268]。
随着对孤立酶和化学合成方法的研究，已开发出用于生产复杂HMO的化学酶促方法。这种技术已研究了五到十年，利用HMO的结构特性（仅由五种单体组成）在供体和受体分子之间形成特定位置的连接。因此，酶的区域选择性和立体选择性有助于避免一些在常规合成方法中资源密集且耗时的保护和去保护步骤[269]。
化学酶促方法从化学合成的目标物质开始，该物质可以通过一种或多种与糖生物学相关的酶进一步修饰。如果首先生成受体，其结构使得能够识别某些糖基单元以供后续酶促衍生化[236]。
目前，文献中很少有使用化学酶促方法合成HMO的例子。由Xi Chen领导的研究小组使用顺序一锅多酶（OPME）糖基化技术，从化学生成的3-叠氮丙基乳糖苷合成了LNT、LNnT及其唾液酸和岩藻糖衍生物。对于生产更复杂的HMO，OPME方法是一种可行技术，因为它消除了对耗时的中间相纯化的需求[270]。例如，已在实验室规模上研究了创建库或OS组合集，以生产多天线不对称HMO。在使用各种糖基转移酶进行酶促修饰之前，首先基于通过β1–3或β1–6连接将GlcNAc结合到乳糖的半乳糖部分上化学合成核心结构。因此，通过岩藻糖基化和/或唾液酸化延长原始结构，创建了60种新结构[271]。
化学酶促技术提高了实验室中生产的HMO的多样性、产量和纯度。尽管难以扩大规模以实现经济上的商业应用，但该方法能够创建大型库，以进行更多结构与功能关系的研究。
5.5 微生物生物工程
微生物发酵长期以来一直是食品和药物化合物制造的重要过程。例如，使用天然或改良微生物的微生物发酵现在用于生产维生素、氨基酸和抗生素。由于没有任何细菌能够自然产生HMO，因此需要使用代谢工程技术从细菌中产生HMO。能够合成复杂HMO的微生物菌株的开发已引起学术界和工业界的关注。为了简化微生物发酵中的酶选择和工程，必须具备酶促或化学酶促合成的能力。酶是创建代谢途径所必需的。然而，由于遗传不稳定性和代谢负荷，许多改良菌株不适合商业生产，导致在大规模发酵过程中出现低产或无产变异[272]。为了避免生产特性损失，可以在菌株形成过程中实施干预措施，如染色体整合、基因删除或构建质粒成瘾系统，而不是依赖单点突变[272,273]。
与其他HMO相比，2'-FL具有相对简单的结构，并且是人乳中最常见的HMO之一。例如，选定的代谢工程宿主大肠杆菌（E. coli）已被改造以产生2'-FL[100,274,275]。尽管广泛使用了基因改造的大肠杆菌菌株，但它们的使用存在一些风险，包括产生某些内毒素以及在某些地方需要使用抗生素。因此，使用一般公认安全（GRAS）的细菌和酵母菌株是发酵操作的最佳选择。例如，使用一种经过基因改造以最大化2'-FL生产的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）重组菌株[276]。Hollands等人（2019年）采用发酵技术提高产品分泌到培养基中，以15和24 g/L的浓度生产2'-FL[277]。
已合成了其他HMO，但产量较低至中等。尽管3'-FL是一种较小且结构简单的HMO，但其研究不如其异构体广泛。唾液酸化HMO虽然不太常见，但表现出多种重要的生理特性。使用甘油和乳糖作为底物，以25 g/L的浓度合成了3'-SL[278]。该技术涉及在基因改造的大肠杆菌中过表达转移酶、差向异构酶、合成酶和合成酶酶。使用类似的方法，以30 g/L的浓度合成了6'-SL[279]。
制造过程包括上游和下游处理，但最重要的步骤是发酵，包括产品发酵、种子培养和生产菌株生长。发酵过程中使用了简单糖、作为HMO生产底物的乳糖、作为碳源的甘油、作为营养素的无机盐以及某些痕量元素作为诱导剂、pH控制剂、消泡剂、络合剂或其他加工助剂。发酵过程一直持续到达到所需的HMO水平。产品浓度（滴度）、产率和生产力（速率）是重要的过程性能指标。发酵后的步骤称为下游处理或分离和纯化，通过从目标HMO中分离发酵液中的细胞生物量、残留培养基、碳水化合物和其他副产物来生成最终的高纯度产品[241]。
根据益生菌或食品发酵微生物（如酵母或乳酸菌）的基因工程生产HMO，可以促进其在胃肠道或食品中的增殖。
总之，HMO的一个显著特征是其独特的结构特征，包括乳糖核心、各种分支模式和包括岩藻糖和唾液酸残基在内的多种单糖组成。由于这些分子的结构多样性和它们所发挥的微妙生物学作用，很难复制人乳低聚糖（HMO）的详细结构和功能。这给科学界和技术界带来了许多挑战。HMO的异构体多样性和单糖之间的特定糖苷连接（通常是区域和立体特异性的）是HMO结构复杂性的来源。如上所述，为了合成HMO结构，需要精确的酶活性；然而，当前的方法没有选择性，无法产生所需的结果。尽管糖基转移酶在酶促合成中显示出希望，但要生产高特异性的酶，仍然存在重大挑战。这些限制包括成本和可扩展性[238]。相反，复制HMO的生物学作用提出了重大挑战。HMO因其能够选择性地促进有益肠道细菌（如婴儿双歧杆菌）的增殖，同时抑制病原体对肠道上皮的附着而闻名。来自植物或动物乳的非人OS不具有针对特定效应的专门聚糖结构，研究表明，它们无法成功复制HMO的免疫调节或抗感染能力[8,127]。此外，某些制造或天然来源的OS具有益生特性，但与HMO不同，它们可能无法影响免疫系统或预防感染，导致食用非HMO OS配方的新生儿错过了人乳的全面健康益处。
5.6 其他哺乳动物乳中的低聚糖
人乳和动物乳包含多种低聚糖（OSs），由于其相似的生物功效而备受关注。人乳中的OS含量高于非人哺乳动物乳。特别是，人乳显示出独特的OS组成，与其他哺乳动物乳相比，人乳中发现的OS数量最多（247种）、结构表征的OS最多（162种）和量化的OS最多（40种）。人乳中的OS浓度显著更高，是非人哺乳动物乳的10到100倍[280]。然而，农场动物乳中也存在OS，但数量相对较少。其中包括3'-唾液酸乳糖（3'-SL）、6'-SL，以及主要是其他中性非岩藻糖基OS，如半乳糖基乳糖。一般来说，它们的浓度从初乳到成熟乳呈指数级下降[281]。
牛乳中的主要OS是3'-SL，其浓度估计在50到100 mg/L之间。相比之下，母乳中3'-SL的含量大约是其两倍。重要的是，研究发现，牛乳中3'-SL的浓度在分娩前两周左右从约100 mg/L上升到约700 mg/L。然而，从初乳中的约800 mg/L显著下降到分娩后三天的约100 mg/L[282]。Albrecht等人（2014年）发现，骆驼、猪、马、羊和牛乳中分别有48、40、40、38和35种OS结构。这远低于人乳中的数量。其他动物OS与人乳共享结构成分，但复杂性和浓度较低。与人类乳不同，家畜含有更高比例的唾液酸化OS（80%–90%），其中3'-SL和6'-SL几乎存在于所有样本中[283]。Shi等人发现人乳中有八种独特OS，四种动物乳（牛、羊、骆驼）中也有：人乳中这些独特OS的浓度是骆驼乳的六倍，是牛乳和羊乳的二十倍，是羊乳的七十五倍。牛、羊、骆驼和人乳中分别有30、42、32、34和35种低聚糖[284]。然而，山羊乳的情况相当不同。岩藻糖基中性OS的比例为15.6%到18.2%，非岩藻糖基中性OS的比例为7.3%到18.9%，唾液酸化MO的比例为68.2%到74.1%[285]。Wang等人的相关研究的主要目的是使用HPAEC-PAD评估乳糖含量和动物乳与人乳之间的关键OS变化。研究结果表明，与人乳相比，动物乳中12种人乳低聚糖（HMO）的含量较低。山羊乳中的酸性OS与人乳极为相似，且只有山羊乳含有2'-FL，这是一种人乳中含量丰富的中性OS。此外，驴乳的乳糖浓度与人乳最为相似[280]。Zhang等人使用UPLC-QqQ MS和MALDI-TOF MS/MS鉴定了人、骆驼、山羊和牛乳中八种OS类型及其绝对浓度。研究结果表明，这四种物种的OS水平在定性和定量上存在差异。与牛乳和山羊乳相比，骆驼乳中常见OS的数量最多。人乳中岩藻糖基OS的数量和绝对浓度更高，而动物乳中唾液酸化OS的数量更多，但绝对浓度相对较低[286]。
山羊乳中的OS（gMOS）浓度显著高于牛乳（bMOS）或羊乳（sMOS），且结构多样性更大[287]。一项研究发现，个体山羊乳与八只山羊混合乳中的总gMOS水平存在显著差异，分别为58.9 mg/L和178.1 mg/L，而人乳和其他家养乳制品物种中的gMOS水平则相对较低。山羊乳的渗透压低于人乳，但高于其他乳制品动物[254]。主要gMOS的浓度在哺乳初期最高，并随着哺乳期的延长而下降，这与Claps等人的研究结果一致。在穆西亚-格拉纳达山羊中发现的主要酸性gMOS是6'-SL，而在萨能、加尔加尼卡和马耳他山羊的个体样本和混合乳中，3'-SL的含量均较高[288,289]。
由于OS组成因物种而异，据报道，马初乳具有独特的OS含量。迄今为止，已报道有43种马乳OS（EMOs），其中12种为酸性，31种为中性[290]。Difilippo等人使用CE-LIF、CE-MS、HILIC-MS和外切糖苷酶降解方法研究了马初乳中的EMOs。在马品种之间和品种内部发现了EMO流行率和丰度的差异。初乳样本中的主要OS是β6'-和3'-半乳糖基乳糖（3'-GL）、3'-SL和二唾液酸乳糖[291]。
与其他灵长类动物相比，人乳低聚糖（HMOs）具有更高的复杂性和多样性，特别是在岩藻糖基化和唾液酸化方面。HMOs的平均聚合度为7到9，表明其寡糖结构更大且更复杂。灵长类动物乳中的OS在物种之间（包括人类）显示出相当大的变异和复杂性。此外，灵长类动物中的岩藻糖基化和唾液酸化水平存在显著差异；黑猩猩乳的岩藻糖基化率为50%，大猩猩乳为15%，长臂猿乳的含量最高，为60%，这可能与微生物相互作用和免疫反应的差异有关。Tao等人利用质谱（MS）和HPLC-Chip/TOF MS对七种猴类乳样进行了详细分析，以确定OS的结构和浓度。研究表明，猴乳OS由于环境限制而独立发展，而非遗传亲缘关系。生态变量（如社会群体大小）也可能影响其多样性，强调了其在灵长类动物营养和免疫中的适应性意义[292]。
动物乳中OS的定量受遗传多样性和泌乳进展的影响，这使得难以比较不同物种之间的研究结果。因此，获取补充数据对于全面了解动物乳中OS的组成至关重要。
婴儿配方奶粉中的低聚糖、安全性问题和临床试验
人乳具有多种优势，这可归因于人乳低聚糖（HMOs）和生物活性物质的存在。然而，鉴于并非每个婴儿都能喝到母乳，提供尽可能丰富的营养成分至关重要（图7）。由于工业上难以大规模合成HMOs，因此婴儿配方奶粉中经常添加模仿人乳中聚糖的益生元化合物，如低聚半乳糖（GOS）和低聚果糖（FOS）[293]。我们对HMO合成的理解取得了显著进展，并且这一进展仍在持续；然而，目前只有有限数量的HMOs能够以足够的量生产，用于补充新生儿配方奶粉（表2）[294]。
现在，在婴儿配方奶粉HMO补充剂的制造过程中，使用基因工程宿主菌株（如大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌或酿酒酵母）作为生物生产设施。细菌使用基本碳源和乳糖生产HMOs，然后将产生的产品释放到发酵培养基中。经过精制成满足某些食品市场部门需求的粉末后，从细胞游离发酵过程中产生的上清液中分离出该产品。因此，这些开发的HMOs可用于改善食品（如婴儿配方奶粉）的营养成分，从而促进HMO对饮食影响的临床前和临床研究[4,295]。
图7. 低聚糖在制药、膳食补充剂和婴儿配方奶粉等多种行业中的可能用途[19]。
2017年，Puccio等人进行了首次临床试验，评估了含有两种人乳低聚糖（HMO）（2'-FL和LNnT）的婴儿配方奶粉的效果[297]。测试配方奶粉喂养的婴儿表现出与年龄相适应的生长，在出生后的前几个月内缓解了肠绞痛，并减少了父母报告的下呼吸道感染。通过进行亚组分析，进一步研究了HMO的免疫作用[298]。
美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲食品安全局（EFSA）均已确定，将2'-FL和LNnT作为婴儿配方奶粉的成分使用是安全的。随着生物工程和制造技术的发展，2'-FL已被纳入商业婴儿配方奶粉中。然而，为了评估与母乳相比，在配方奶粉中添加某些HMO的利弊，需要进行大量研究[299]。从这一角度来看，文献中已发表了许多临床研究，以探索HMO在新生儿中的利用及其提供的健康益处。
进行了一项随机对照研究，以调查与对照配方奶粉相比，含有2'-FL和FOS的新生儿配方奶粉的胃肠道耐受性。在新生儿小于8天时提供配方奶粉，并持续约一个月。婴儿表现出相似的大便稠度、人体测量指标和进食频率，偶尔出现吐奶或呕吐。配方奶粉耐受性良好[300]。一项比较含有和不含有HMO的新生儿配方奶粉的研究表明，含有HMO的配方奶粉增加了双歧杆菌水平，降低了埃希氏菌水平，并提高了消化链球菌科水平。然而，在12个月时未观察到变化，这表明HMO补充可能减轻婴儿期未母乳喂养的负面影响[301]。
表2. 根据欧洲食品安全局（EFSA）的规定，婴儿配方奶粉中结构相似的合成人乳低聚糖（HMO）或低聚糖组合的最高允许浓度，以每升克数（g/L）为单位测量[296]。
本研究的目的是调查在婴儿配方奶粉中添加2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL）对免疫功能生物标志物的影响。在婴儿的情况下，与仅含有低聚半乳糖（GOS）的对照配方奶粉相比，同时含有2'-FL和GOS的配方奶粉显示出较低的血浆炎症细胞因子和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平。母乳喂养的婴儿与喂食含有2'-FL和GOS的配方奶粉的婴儿之间未观察到明显变化。根据研究结果，似乎补充2'-FL会导致免疫发育的改变和增强[298]。在Vandenplas等人的研究中，他们调查了部分发酵婴儿配方奶粉（IF）对健康新生儿发育、安全性和耐受性的影响，该配方奶粉包含后生元、2'-FL、由短链GOS（scGOS）和长链FOS（lcFOS）组成的特定益生元组合以及乳脂。随机IF组在胃肠道耐受性或副作用方面没有统计学显著差异。在健康足月婴儿中，部分发酵的IF包含后生元、特定OSs、2'-FL和乳脂，可促进新生儿正常发育，且安全、耐受性良好[302]。Parschat等人开发了5HMO-Mix，这是一种由五种HMO组成的混合物，旨在复制天然浓度。该混合物由52%的2'-岩藻糖基乳糖、13%的3-岩藻糖基乳糖、26%的乳糖-N-四糖（LNT）、4%的3'-唾液酸乳糖（3'-SL）和5%的6'-唾液酸乳糖（6'-SL）组成。该研究评估了5HMO-Mix配方奶粉对健康新生儿生长的安全性、可接受性和影响。结果表明，体重、身长或头围的生长无显著差异[303]。Alliet等人对一项试验进行了研究，该试验比较了含有罗伊氏乳杆菌（CG）的基于牛乳的配方奶粉以及相同配方奶粉中添加1.0 g/L 2'-FL（EG）的效果，试验对象为289名14天及以下直至6个月大的健康新生儿。四个月龄时的体重增长是主要结果。除了耐受性良好并支持适龄发育外，含有罗伊氏乳杆菌和2'-FL的婴儿配方奶粉还有助于改变肠道微生物模式，使其更接近于母乳喂养的新生儿[173]。
Lasekan等人进行了一项研究，以评估含有五种类似于人乳中HMO混合物的基于牛乳的配方奶粉对新生儿生长和胃肠道耐受性的影响。研究表明，在人乳中添加LNT、3'-SL、6'-SL和2'-FL可改善健康足月婴儿的正常发育、耐受性和安全性。该研究旨在改进新生儿配方奶粉的HMO组成[304]。
另一方面，Wallingford等人研究了在婴儿配方奶粉中添加2'-FL对生长、不良事件发生率以及婴儿微生物组（包括代谢2'-FL的微生物基因表达）的影响。在比较人乳或婴儿配方奶粉±2'-FL与母乳喂养婴儿的研究中，添加2'-FL对生长没有负面影响或显著影响。在基线时，粪便样本中的微生物基因组丰富度或香农多样性没有显著差异。喂养16周后，配方奶粉组在丰富度和多样性方面优于母乳喂养的婴儿。GH20和GH2家族减少，而GH42和GH112家族在试验配方奶粉组中增加。然而，当添加2'-FL时，母乳喂养婴儿的微生物组发生变化，表明双歧杆菌参与了HMO的内部代谢[305]。在另一项使用2'-FL的临床研究中，结果表明该配方奶粉安全、耐受性良好，并促进了菌群增长[306]。
Vandenplas等人评估了降低蛋白质含量（2.20 g/100 kcal）并在广泛水解配方奶粉（EHF）中添加两种HMO是否能促进对牛乳蛋白过敏（CMPA）新生儿的健康发育。补充HMO的配方奶粉显著降低了CMPA婴儿的上呼吸道和耳部感染频率，并在12个月龄时降低了30%至40%的下呼吸道和胃肠道感染风险。此外，该配方奶粉还显著降低了下呼吸道感染的风险。这表明在第一年生命中，该配方奶粉对呼吸道和耳部系统感染具有预防作用[307]。在类似的临床试验中，Gold等人旨在评估添加两种HMO的氨基酸基础配方奶粉（AAF）是否能促进CMPA婴儿的正常发育，并且耐受性良好。研究表明，患有中重度CMPA的婴儿在服用含有两种HMO的配方奶粉后，发育状况可接受，并出现一定程度的追赶生长。肠道微生物组的特征显示，首先富集了利用HMO的双歧杆菌，随后富集了拟杆菌和产丁酸盐的菌群。尽管如此，变形菌门的数量有所减少，而变形菌门是肠道菌群失调的症状。在婴儿中，补充2'-FL和LNnT有助于在一定程度上缓解肠道微生物菌群失调状况[308]。
相反，婴儿配方奶粉中OS多样性的缺乏源于获取类似于人乳中OS结构的技术困难。牛乳中含有OS，其中一些OS的结构与人乳中的OS相同或几乎相同。然而，牛乳中这些OS的含量较低，阻碍了将牛乳作为婴儿配方奶粉OS来源的努力，直到最近才有所改变[244]。Meli等人研究了包含由乳清透过液制成的BMO混合物的婴儿配方奶粉。测试了两种配方奶粉：一种仅含有BMO，另一种含有BMO以及益生菌罗伊氏乳杆菌（LPR）和长双歧杆菌（Bl999）[309]。另一方面，鉴于大多数婴儿配方奶粉是使用来自牛乳的成分制成的，因此可以合理推测，母乳喂养婴儿和配方奶喂养婴儿所摄入的这些碳水化合物结构的数量是不同的。Martín-Sosa及其同事进行了一项研究，以评估人乳和牛乳样品中在泌乳不同阶段获得的OS结合唾液酸和主要唾液酸低聚糖的水平。该研究的目的是发现两种乳之间的差异，并确定这些变化在泌乳过程中的影响。根据研究结果，人乳、牛乳和婴儿配方奶粉中的OS含量存在差异。因此，与母乳喂养的婴儿相比，奶瓶喂养的婴儿摄入的唾液酸低聚糖在质量和数量上均较低[310]。
总之，临床研究产生了大量证据表明，HMO可改变肠道微生物群，并与额外的健康益处相关（表3）。特别是对婴儿配方奶粉中增加HMO可能产生的潜在健康影响进行了关键研究。
表3. 临床试验考察补充HMO对婴儿的影响
7 当前阻碍与未来机遇
随着时间的推移，研究人员已在人乳中鉴定出100多种结构独特的低聚糖（OSs）。允许快速且高通量分析HMO的新技术使得进行大型母婴观察研究成为可能。这些研究调查了母体因素与HMO组成之间的相关性，以及HMO组成与多种新生儿健康结果之间的联系。尽管HMO组成存在一般模式，但每位女性在母乳喂养期间会产生不同浓度的多种HMO的独特特征，这些特征可能会发生变化。婴儿不能很好地消化HMO，但它们作为某些肠道微生物的代谢底物，影响肠道微生物群的自然发育。与这一机制相关，越来越多的证据表明，这些HMO具有预防感染和其他疾病、帮助构建母乳喂养婴儿的大脑甚至可能改善认知功能的作用。作为抗粘附剂，HMO抑制不同的微生物粘附在婴儿的上皮表面，从而避免或减少胃肠道以及可能还有呼吸道和泌尿道的感染性疾病。作为抗菌剂，HMO直接阻止细菌生长，并有能力作为合成新型急需抗生素的天然模型。此外，HMO调节免疫细胞和上皮反应，这可能影响婴儿对过敏、哮喘和其他疾病的易感性。
目前添加到大多数新生儿配方奶粉中的OSs在结构上与人乳中的OSs不同。因此，这些非HMO似乎不太可能复制HMO的结构特异性效应。看来，趋势正在从使用非HMO转向合成人乳中存在的OSs。随后的临床前和临床研究将确定目前可用的三糖和四糖的有效性。更深入地了解人乳腺中HMO的合成过程，有助于指导新技术的开发，以产生广泛复杂的HMO，从而最接近地模拟人乳的OS组成。从长远来看，母乳喂养仍然是为婴儿提供营养和护理的最佳选择。
