点击上方蓝字关注我们
摘要：引言：众多流行病学研究表明，食用富含多酚和黄酮类化合物的食物可以对包括动脉高血压（HTN）在内的多种疾病产生有益影响。我们实验室最近的研究表明，某些黄酮类化合物在多种HTN动物模型中表现出抗高血压特性。我们的目标是评估白桑（Morus alba L.）提取物在一种以一氧化氮（NO）缺乏为特征的实验性HTN模型中的效果。方法：将雄性Sprague-Dawley大鼠分为四组：对照组、在饮用水中给予NO合成抑制剂（L-NAME）六周的HTN大鼠组、给予Morus alba L.提取物的L-NAME大鼠组、以及同时给予卡托普利的L-NAME大鼠组。经过六周的治疗后，我们测量了血压、主动脉内皮血管功能和血小板聚集功能。结果：Morus alba L.提取物部分预防了因NO缺乏导致的动脉高血压的发展，尽管它没有像卡托普利那样完全使血压恢复正常。该提取物降低了主动脉环对苯肾上腺素的过度血管收缩反应，并改善了乙酰胆碱引起的血管舒张，这两种效应都依赖于NO产生的增加。Morus alba L.提取物还降低了高血压动物对ADP和胶原蛋白引起的血小板聚集增加，尽管它没有完全使这一功能恢复正常。结论：Morus alba L.提取物在实验性动脉高血压模型中表现出抗高血压效果，改善了血管反应性，并减少了血小板聚集。这些效果主要与一氧化氮活性的增加有关。
1 引言
动脉高血压是全球主要的公共卫生挑战，也是心血管疾病和肾脏疾病的主要原因[1,2]。治疗高血压的主要方法包括生活方式改变，如饮食调整、增加体力活动和减轻体重[3]。血压降低5毫米汞柱可以显著降低中风风险34%，降低缺血性心脏病风险21%，同时降低心血管疾病死亡率[4]。
近年来，人们越来越关注识别和鉴定食物和饮食中的生物活性成分，以治疗和预防高血压[5]。白桑（Morus alba L.）在东亚国家广泛栽培，其叶子传统上用于养蚕。桑树的各个部分，从根皮到叶子，都已被广泛研究其健康益处，包括抗氧化、降脂、降血糖、抗动脉粥样硬化、抗病毒、抗菌和神经保护作用[6–12]。动物研究表明，摄入桑叶可以使异常升高的血压恢复正常[11,13]。长期用桑叶治疗可以显著恢复受损的血管反应性，包括使减少的扩张和增加的收缩恢复正常水平[9]。这些效果可能归因于抑制血管紧张素转化酶，从而导致血管紧张素II水平降低。桑叶中γ-氨基丁酸（GABA）的存在也可能是其抗高血压作用的另一种潜在机制[11]。
我们实验室之前的研究专注于两种动脉高血压动物模型，将几种富含黄酮类化合物的提取物的抗高血压效果与一氧化氮（NO）水平的增加联系起来[14,15]。基于这项研究，本研究旨在分析白桑叶乙醇提取物在实验性NO缺乏诱导的动脉高血压模型中的心血管、血管、血小板和肾脏效应。该模型特别适合于测试可能增加NO产生和减少氧化应激的物质，因为这两者是L-NAME诱导高血压的两种关键机制。通过抑制一氧化氮合酶，L-NAME处理导致NO生物利用度降低和活性氧（ROS）产生增加，从而导致内皮功能障碍和血管收缩。此外，该模型还允许直接评估化合物对抗NO缺乏相关特定病理生理变化的能力，包括NADPH氧化酶活性增加和抗氧化能力降低。因此，L-NAME高血压模型为评估白桑提取物（MAE）在恢复NO依赖的血管功能和减轻氧化应激诱导的心血管改变方面的潜力提供了理想平台。
2 材料与方法
2.1 白桑叶提取物
本研究准备了三种不同类型的白桑叶提取物。两种是乙醇提取物，分别使用50%和70%乙醇作为提取剂，第三种是水提取物，使用超纯水。白桑品种选自IMIDA种质库（BAGERIM），基于其在先前使用秀丽隐杆线虫的研究中表现出的抗氧化效果和在肥胖小鼠中表现出的抗炎效果[16]。从IMIDA种质库中收集选定的白桑品种叶片，清洗、仔细干燥，然后冷冻干燥直至使用。提取过程从冷冻干燥的白桑叶开始，将提取物在室温下振荡孵育15分钟，然后交替进行15分钟超声处理，使用适当的提取剂，并始终避光。然后将样品在8000×g下离心，过滤上清液，随后在40°C下使用旋转蒸发器浓缩并去除乙醇。作为提取的最后一步，将所有制备的提取物进行冷冻干燥，并在-20°C下储存直至使用。初步实验表明，所有这些提取物在L929细胞培养中均无毒，并表现出抗炎能力和良好的抗氧化活性。由于70%乙醇提取物的生物相容性和低毒性已得到研究，且该溶剂有可能从叶片样品中提取更多活性化合物，因此选择该提取物用于动物研究。
2.2 动物
实验使用在穆尔西亚大学生物设施中繁殖和饲养的雄性Sprague-Dawley大鼠。大鼠饲养在温度控制的环境中，遵循穆尔西亚大学动物护理设施（REGA ES300305440012）的12:12小时光暗循环。所有动物护理和实验程序均遵循欧洲联盟为保护科学研究中使用的动物而制定的指南（86/609/EEC）。研究方案由穆尔西亚大学动物护理与使用委员会（C1310050303）审查并批准，确保符合动物实验伦理标准。
2.3 实验分组
将8周龄大鼠随机分为四组：1. 对照组（n=8），未接受任何处理的大鼠；2. L-NAME组（n=8），接受慢性L-NAME处理6周的大鼠（N-ω-硝基-L-精氨酸甲酯，10 mg/kg/天）；3. M. alba提取物组（MAE，n=8），同时接受L-NAME和MAE提取物（100 mg/kg/天，灌胃给予）处理的大鼠；4. 卡托普利组（n=8），同时接受L-NAME和卡托普利（血管紧张素转化酶抑制剂）处理的大鼠，剂量为100 mg/kg/天，添加到饮用水中。图1总结了实验设计。
图1. 实验设计概要。
2.4 实验程序
大鼠最初在其常规笼中饲养4–5周。在此期间，它们每周逐渐适应个体代谢笼（Tecniplast，Radnor，PA，美国）两天。在第六周，经过两天的适应期后，进行24小时的食物和水摄入量以及尿量测量。收集尿液样本，离心（1000×g，10分钟）以去除固体物质，并储存在-80°C以供后续分析。
2.4.1 血压测量和血液采集
完成代谢研究后，用戊巴比妥钠（5 mg/Kg，i.p.）麻醉动物，并将其放置在加热台上以维持37°C的体温。如先前所述[14,15]，通过右股动脉置入导管测量血压。之后，收集血液用于血小板聚集研究，如先前发表的文献所述[17]。然后，通过开胸处死动物，取出降胸主动脉，并放置在含有充氧和预热的Krebs溶液的培养皿中，用于血管反应性研究。
2.4.2 血管反应性研究
分析血管反应性的方法已先前详细发表[14,15]。简而言之，将主动脉清洗干净，切成四个环，并安装在含有维持在37°C的生理Krebs溶液（持续充入95% O2和5% CO2）的器官浴（Panlab LE 01004器官浴系统，巴塞罗那，西班牙）中。使用等距力传感器（TRI202P，Panlab）测量主动脉张力，并使用AD Instrument系统（牛津，英国）进行采集。在实验开始前，将环在2 g的静息张力下平衡至少45分钟。实验方案如下：
• 进行苯肾上腺素（Phe，10⁻⁹–10⁻⁴ mol/L）的累积剂量-反应曲线。
• 洗涤并重新稳定后，用亚最大剂量Phe（10⁻⁶ mol/L）预收缩环。
• 进行乙酰胆碱（Ach，10⁻⁹–10⁻⁴ mol/L）的累积剂量-反应曲线，以评估内皮依赖性血管舒张。
• 洗涤并重新稳定后，将环与NOS抑制剂L-NAME（10⁻⁴ M）孵育30分钟。
• 再次进行Ach的累积浓度-反应曲线，以评估NO在内皮依赖性血管舒张中的作用。
• 最后，加入单一剂量的硝普钠（SNP，10⁻⁴ M）以测试非内皮依赖性血管舒张反应。
Phe的反应以克为单位表示，而Ach和SNP的舒张反应以Phe最大效应的百分比表示。所有试剂和血管活性化合物均购自Sigma-Aldrich（圣路易斯，密苏里州，美国）和Panreac（巴塞罗那，西班牙）。
2.4.3 血小板聚集研究
分析血小板聚集的方法已先前详细发表[17]。简而言之，通过离心血液获得富含血小板的血浆后，将血小板悬浮在无Ca²⁺的Hepes缓冲液中，并使用血液分析仪将血小板浓度调整为2 × 10⁸个/mL。血小板保持在19°C的恒温浴中，并在实验开始前立即加入Ca²⁺。使用双通道光学聚集仪（Chronolog，型号700，Chronolog Corporation，Havertown，PA 19083，美国）分析血小板聚集反应。使用两种血小板激动剂评估制备的血小板样本的聚集反应：
• 腺苷二磷酸（ADP），浓度为0.75、1.25、2.5、5、10和20 µM。
• 胶原蛋白，浓度为0.75、1.25、2.5和5 µM。
2.5 试剂
化合物、来源和试剂纯度如下：
• ADP，Sigma-Aldrich；ACS级，HPLC > 95%。
• 胶原蛋白，Hart，>95%马肌腱I型原纤维。
• L-NAME，Thermo scientific（沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国），HPLC > 97.5%。
• 硝普钠，Sigma-Aldrich；ACS级，>99%。
• 用于Krebs溶液或环实验或血小板实验中的试剂：Sigma-Aldrich；Bioperformance认证（BioUltra或BioXtra级）。
• 无水乙醇；vWR；TechniSolv级，>99.5%。
2.6 统计分析
结果以算术平均值和标准差表示。统计分析如下进行：对于血管反应性研究，组内差异使用方差分析（ANOVA）进行多重比较评估，当获得显著结果时，应用Duncan检验来识别成对差异。苯肾上腺素的收缩反应以克为单位表示，而乙酰胆碱的舒张反应以苯肾上腺素诱导收缩的百分比表示。对每个环单独进行回归分析以计算50%有效剂量（ED50）值，并使用Student's t检验评估组间ED50值的差异。对于血小板聚集研究，分别计算曲线下面积（AUC）和反应斜率，并使用双因素ANOVA进行多重比较分析组间差异，必要时进行事后Duncan检验。对于其他组间比较，采用单因素方差分析。所有分析中，p值<0.05被认为具有统计学意义。
3 结果
图2展示了各实验组的平均动脉压（MAP）、收缩压（SBP）和舒张压（DBP）。慢性L-NAME处理导致这三个参数均显著升高。同时给予MAE或卡托普利显著降低了这些升高的血压，尽管MAE处理组未完全恢复到对照值。
图2. 各实验组的血压（MAP，平均动脉压；SAP，收缩压；DAP，舒张压）。*，p<0.05，与对照组相比。
图3展示了主动脉环对苯肾上腺素的血管收缩反应。与对照组相比，L-NAME处理组表现出增强的反应。虽然同时给予MAE治疗降低了这种反应，但仍然高于对照动物。卡托普利治疗有效降低了血管收缩反应。
图3. 主动脉环对苯肾上腺素的反应性。
表1列出了有效剂量50（ED50，单位为mM）、pD2（-log M）和最大反应（g）的数据。这些值在高血压动物中升高，而白桑提取物治疗组显示出较低但仍然显著高于对照组和卡托普利组的值。
表1. 主动脉对苯肾上腺素的反应性。
图4和表2展示了乙酰胆碱引起的血管舒张反应。对照组和卡托普利组表现出最高的血管舒张反应（约90%），而L-NAME组仅表现出10%的反应。在L-NAME处理的大鼠中给予MAE治疗显著改善了血管舒张反应，接近60%。在慢性L-NAME处理组中，血管舒张反应几乎完全消失。MAE的有益效果归因于一氧化氮（NO）的参与，因为在环中急性加入L-NAME后，这种效果被消除。在检查ED50或pD2数据时，这种效果更为明显，MAE处理的L-NAME组与未处理的L-NAME组之间存在统计学显著差异。实验结束时，硝普钠引起的血管舒张反应保持在近100%，各组之间无显著差异。
图4. 主动脉环对乙酰胆碱的血管舒张反应。
表2. 主动脉对乙酰胆碱的舒张反应。
图5展示了不同动物组对ADP和胶原蛋白的血小板聚集百分比。虽然各组之间的最大聚集值相似，但总体反应存在显著差异，ANOVA结果证实了这一点。曲线下面积和斜率分析也观察到了类似的模式。本研究没有逐点进行统计比较（这可能会产生大量临床意义有限的结果），而是侧重于计算每组的ED50值以评估总体反应变化。这种方法提供了数据更具临床意义的解释。ED50分析的主要结果表明，长期给予MAE治疗的组与对照组相比，ED50值显著降低（p<0.05），而其他各组之间的ED50值没有观察到其他显著差异。
图5. 对ADP和胶原蛋白的血小板聚集反应
4 讨论
近年来，我们实验室专注于研究黄酮类化合物在通过给予NO合成抑制剂L-NAME诱导的动脉高血压实验模型中的作用。先前的研究表明，柠檬提取物、葡萄柚提取物、可可提取物和芹菜素在L-NAME诱导的高血压动物中表现出适度的抗高血压效果[14,15]。虽然自发性高血压的原因是多因素的[17,18]，包括遗传、交感神经系统和肾素-血管紧张素系统，但L-NAME诱导的高血压的主要原因是NO产生减少，这间接导致血管收缩机制（如肾素-血管紧张素系统）过度激活和氧化应激增加[19]。这些机制常被认为是黄酮类化合物有益效果的目标。在我们之前的工作中，我们观察到黄酮类化合物对血压以及肾脏和血管功能有显著影响。基于此背景，我们决定使用成熟的L-NAME高血压模型评估另一种富含黄酮类化合物的物质——白桑提取物（MAE）的效果。本研究的目的是评估MAE在由NO合成抑制引起的动脉高血压实验模型中的血管和肾脏效应。
与其他我们测试过的治疗方法一样，动物对MAE治疗耐受性良好，未观察到不良反应。关于血压——分析的主要结果之一——慢性L-NAME处理显著增加了平均动脉压（MAP）、收缩压（SBP）和舒张压（DBP），这与我们之前的研究结果一致。值得注意的是，MAE治疗显著降低了MAP，表明MAE在很大程度上预防了L-NAME诱导的高血压效应，尽管血压水平仍略高于对照组。这表明MAE可以部分缓解由NO缺乏引起的动脉高血压。相比之下，慢性卡托普利治疗几乎完全预防了高血压，这与我们实验室之前的研究结果一致。卡托普利的抗高血压效果主要归因于其抑制血管紧张素II的形成，这是驱动高血压及其相关并发症的关键机制。
本研究的另一个目的是评估主动脉环的血管反应性。正如预期的那样，L-NAME处理动物的血管收缩反应显著高于对照动物，这与我们之前的数据和文献报道一致[14,15]。这种增强的反应是由于NO产生减少，从而导致对增加血管张力的血管舒张保护作用丧失。有趣的是，同时给予MAE治疗降低了这种增强的血管收缩反应，尽管仍然高于对照动物。这表明MAE可能增加主动脉环中的NO水平。如我们之前的研究所示，卡托普利治疗有效使血管收缩反应恢复正常。MAE的效果进一步得到了ED50和最大反应数据的支持，这些数据与L-NAME组相比有所降低，但未达到正常对照值。在乙酰胆碱引起的血管舒张实验中，也观察到了MAE可能增强NO产生的额外证据。在L-NAME处理动物中，乙酰胆碱引起的血管舒张几乎消失（对照水平的13%），而给予MAE治疗的动物达到了54%的最大血管舒张反应。重要的是，当在实验过程中急性向主动脉环中加入L-NAME时，这些差异被消除，证实了MAE改善了血管NO产生。如预期的那样，所有组中硝普钠引起的血管舒张保持完整，表明对平滑肌功能没有直接影响，确保了实验的可靠性。
关于血小板聚集，慢性L-NAME处理增加了血小板聚集反应。MAE治疗显著改善了这些反应，但与对照组相比并未完全恢复正常。卡托普利治疗使血小板聚集反应正常化，特别是在较低激动剂剂量下。在分析聚集反应的曲线下面积和斜率数据时，也观察到了类似的趋势。有趣的是，只有长期给予MAE治疗的组与对照组相比ED50值较低；然而，这些值仍未达到对照动物观察到的水平。这些发现表明，MAE减少了由慢性L-NAME处理引起的过度血小板聚集，这是一种有益效果，可以改善在血小板聚集增加条件下的血小板功能和血管反应。然而，尚不清楚这种效果是直接与NO产生增加有关还是与其他机制有关。
据我们所知，没有其他研究使用白桑提取物在NO缺乏的动脉高血压模型中进行实验。然而，多项研究已经证明了MAE在治疗高血压方面的潜力，这些机制可能与L-NAME高血压相关[20,21]。例如，MAE已被证明通过一氧化氮依赖性途径诱发内皮血管舒张，并增加内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的磷酸化[22]。此外，体内给予MAE降低了野生型小鼠的血压水平，但对eNOS缺陷型小鼠没有影响[23]。这表明MAE的抗高血压作用是通过eNOS介导的，这可能与L-NAME高血压相关。
5 结论
综上所述，桑叶提取物在由一氧化氮缺乏引起的动脉高血压实验模型中表现出抗高血压效果，并改善了血管反应性和血小板聚集。这些有益效果似乎与增强的一氧化氮活性密切相关[14,15]。
点个在看你最好看
