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摘要
T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）在治疗后复发或产生化疗耐药性时难以治疗；复发或难治性T-ALL患者的预后通常较差。我们报告了一组17例此类患者的病例系列，这些患者接受了表达抗CD7嵌合抗原受体（CAR）和抗CD7蛋白表达阻滞剂（PEBL）的自体CAR T细胞治疗，PEBL可防止CAR T细胞的同种杀伤。尽管白血病负担高且CAR T细胞剂量低，但17例患者中有16例在1个月内达到了微小残留病阴性的完全缓解。剩余1例患者在输注前存在CD7−T-ALL细胞，输注后仍然存在。毒性反应轻微：10例患者发生1级细胞因子释放综合征，3例患者发生2级细胞因子释放综合征；2例患者发生1级免疫效应细胞相关神经毒性综合征。11例患者（中位随访时间15个月）保持无复发，其中包括所有9例接受异体移植的患者。首例患者在输注后55个月仍处于缓解状态，未接受进一步化疗或移植；循环CAR T细胞可检测2年。淋巴耗竭后再生的T细胞缺乏CD7表达，呈多克隆性，并对SARS-CoV-2疫苗接种产生应答；随着CAR T细胞的消失，CD7+免疫细胞重新出现。总之，自体抗CD7 PEBL-CAR T细胞具有强大的抗白血病活性，可能是治疗T-ALL的有效选择。
引言
T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）是急性淋巴细胞白血病（ALL）的一种亚型，也是最常见的儿童癌症。T-ALL起源于T细胞前体的致癌转化[1,2]；在儿童ALL病例中约占10%，在青少年和年轻成人中约占25%30%[3,4]。与B细胞ALL相比，T-ALL具有更多预后不良的特征，且大多数治疗方案下的治疗效果更差[3,4]。尽管70%80%的儿童可以通过强化和延长的化疗治愈[3]，但成人的治愈率仍保持在约60%或更低[5]。对于复发或初始化疗难治的T-ALL患者，造血干细胞移植（HSCT）通常被认为是唯一的治愈选择；然而，该治疗在很大一部分患者中会失败[4,6,7]。此外，HSCT成功的先决条件是在移植前达到完全缓解（CR），且可测量的或微小残留病变（MRD）非常低[8,9]，而在化疗耐药的白血病中，这可能难以实现。Eckert等人[10]报告称，115例复发T-ALL儿童中，有56例未能达到第二次CR或随后复发；在报告时处于无病状态的31例患者中，有30例接受了HSCT。
随着针对B细胞标志物CD19的“第二代”（即包含一个共刺激结构域）嵌合抗原受体（CAR）的开发，复发或难治B细胞ALL患者的治疗得到了革新，使T淋巴细胞转变为强大的抗白血病剂[11,12]。据报道，输注自体抗CD19 CAR T细胞后，患者出现了显著的临床反应[13-22]，这导致其被监管机构批准用于治疗CD19+ B细胞ALL[23]。靶向CD22的CAR T细胞也显示出了前景[24]，特别是与抗CD19 CAR T细胞联合使用时[25]。相比之下，由于T-ALL通常缺乏CD19和CD22表达，其细胞疗法的开发一直滞后。
CD7是一种40 kDa的I型跨膜糖蛋白，在几乎所有T-ALL患者诊断时[26-29]以及化疗期间和复发时[29]均高表达。然而，CD7也在正常T淋巴细胞中表达，包括CAR T细胞[29]。因此，抗CD7 CAR的表达会触发自我细胞毒性（即同种杀伤），这是可靠制备CAR T细胞的主要障碍[29,30]。为了规避这一问题，我们开发了一种抗CD7蛋白表达阻滞剂（PEBL），它允许CD7的合成，但将其保留在细胞内，防止其在细胞膜上表达，从而避免同种杀伤[29]。抗CD7 PEBL消除了CD7的表面表达，但对T细胞功能没有明显影响[29]。我们设计了一种双顺反子逆转录病毒载体，同时包含抗CD7 PEBL和抗CD7 CAR构建体，允许使用标准CAR T细胞制备协议表达这两种基因。本文报道了17例T-ALL患者在两家机构接受自体抗CD7 PEBL-CAR T细胞治疗的结果。我们将抗CD7 PEBL-CAR T细胞的特性与为20例B细胞ALL患者制备的抗CD19 CAR T细胞进行了比较。
图1 | 患者分布。接受抗CD7蛋白表达阻滞剂（PEBL）-CAR T细胞筛查和治疗的患者流程图。
结果
患者
从2019年4月24日至2023年10月6日，共筛查了20例复发或难治性T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）患者，以考虑给予抗CD7蛋白表达阻滞剂（PEBL）-CAR T细胞治疗（图1）。其中，2名患者（18岁和7岁）通过进一步化疗达到了微小残留病变（MRD）阴性的完全缓解（CR），并接受了造血干细胞移植（HSCT）；第三名患者（16岁）在CAR T细胞输注前因疾病进展死亡。本文报道了一组病例，包括17名接受抗CD7 PEBL-CAR T细胞治疗的患者。CAR T细胞在新加坡国立大学的免疫细胞工程实验室制备，并在新加坡国立大学医院（NUH）（n=12）或意大利罗马的IRCCS Ospedale Pediatrico Bambino Gesù（OPBG）（n=5）进行输注。根据新加坡医疗委员会的道德守则和道德指南（新加坡）或医院豁免基础（意大利），CAR T细胞作为创新挽救治疗进行给药，最后一名患者（编号17）除外，该患者是NUH CARTALL临床试验（NCT05043571；补充数据）中首位入组的患者。
筛查标准包括诊断为复发或难治性T-ALL或T细胞淋巴母细胞淋巴瘤，至少经过三线治疗（将HSCT计为一线）后未能达到持久缓解，以及>95%的白血病细胞表达CD7。表1和扩展数据表1展示了患者的人口统计学和临床特征。13名患者为儿童或青少年（218岁；中位年龄11岁），4名为成人（3171岁；中位年龄39岁）。8名患者有早期T细胞前体ALL（ETP-ALL）或近似ETP-ALL[31-33]。10名患者在HSCT后T-ALL复发，4名患者在化疗后复发时持续存在MRD，3名患者为原发性难治性T-ALL。除强化化疗外，既往治疗还包括BCL2抑制剂（n=7）、达雷木单抗（n=5）、达沙替尼（n=3）、蛋白酶体抑制剂（n=5）和奈拉滨（n=3）。入组时白血病细胞的中位CD7表达>99.9%（范围98.6%至>99.9%）。其他免疫表型特征见补充图1。本文使用了在同一新加坡国立大学设施中制备的抗CD19 CAR T细胞治疗的20例B细胞ALL患者的数据进行比较（扩展数据表2和3）。
表1 | 接受抗CD7蛋白表达阻滞剂（PEBL）-CAR T细胞治疗的T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）患者（n=17）的基线人口统计学和疾病特征
图2 | 抗CD7蛋白表达阻滞剂（PEBL）-CAR T细胞的特性。a，在17例T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）患者的抗CD7 PEBL-CAR T细胞（“CD7”）临床级（cGMP）输注产品中，表达CAR的CD3+ T细胞百分比，与20例B细胞急性淋巴细胞白血病（B细胞ALL）患者的抗CD19 CAR T细胞（“CD19”）进行比较。条形图表示中位数；双尾Mann-Whitney检验，P<0.0001。b，制造后与输入CD3+细胞相比的CD3+ T细胞百分比。c，抗CD7 PEBL-CAR T细胞中的CD4和CD8表达。所示为17个抗CD7 PEBL-CAR T细胞产品的平均值±标准差。d，11个抗CD7 PEBL-CAR T细胞产品与2个抗CD19产品相比，具有中央记忆T细胞（TCM，CD45RA−，CD45RO+，CD197+）和效应记忆T细胞（TEM，CD45RA−，CD45RO+，CD197−）表型的CAR T细胞的平均值±标准差。e，制造结束时CAR T细胞中PD-1、LAG-3和TIM-3的表达。比较了11个抗CD7 PEBL-CAR T细胞产品（来自T-ALL组的1、2、3、6、7、10、11、12、15、16和17号患者）与2个抗CD19产品（来自B细胞ALL组的14和18号患者）的平均值±标准差。f，抗CD7 PEBL-CAR T细胞与两个抗CD19 CAR T细胞产品中TCRVβ家族的分布；堆叠柱形图显示了T-ALL的1、2、3、6、7、10、11、12、15、16和17号患者以及B细胞ALL的14和18号患者的输注产品中表达每种TCRVβ的CAR T细胞百分比。g，在4小时和24小时共培养后，以1:1的效应细胞与目标细胞比例，抗CD7 PEBL-CAR T细胞对CD7+ MOLT-4细胞（n=17）的细胞毒性，以及抗CD19 CAR T细胞对CD19+ RS4;11细胞（n=20）的细胞毒性。结果与同一患者的细胞在激活但未转导CAR（“无CAR”）时获得的结果进行比较，对于抗CD7产品，在两个时间点均有16个产品可用，对于抗CD19产品，在4小时和24小时分别有14个和13个产品可用。条形图表示平均值±标准差。双尾Mann-Whitney检验，**P=0.0061；P<0.0001；无显著性（NS），P>0.05。h，抗CD7 PEBL-CAR T细胞制造前后，通过流式细胞术（灵敏度0.01%）测量的白血病细胞百分比。灰色区域表示未检测到T-ALL细胞。双尾Mann-Whitney检验，****P<0.0001。
图3 | 患者体内抗CD7蛋白表达阻滞剂（PEBL）-CAR T细胞的扩增。a，流式细胞术点图显示了外周血中抗CD7 PEBL-CAR T细胞的检测。图中展示了输注后不同时间点的CD3和CAR表达情况，图中右下角标注了表达CAR的CD3+ T淋巴细胞的百分比。b，在17例T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）患者中，通过流式细胞术测量输注后2个月内外周血中抗CD7 PEBL-CAR T细胞的绝对数量，并与20例B细胞急性淋巴细胞白血病（B细胞ALL）患者中抗CD19 CAR T细胞的测量结果进行比较。1例T-ALL患者接受了两次CAR T细胞输注，结果分别绘制。c，比较T-ALL（“CD7”）和B细胞ALL（“CD19”）患者在输注后不同时间点的CAR T细胞水平。条形图表示平均值±标准差。双尾Mann-Whitney检验，P=0.0006，**P<0.0001。d，输注后1个月，抗CD7 PEBL-CAR T细胞（T-ALL的1、6、7、15和16号患者）中具有干细胞样记忆T细胞（TSCM，CD45RA+，CD45RO−，CD95+，CD197hi）、中央记忆T细胞（TCM，CD45RA−，CD45RO+，CD197+）和效应记忆T细胞（TEM，CD45RA−，CD45RO+，CD197−）表型的CAR T细胞百分比，与抗CD19 CAR T细胞（B细胞ALL的14和18号患者）进行比较。对于T-ALL的1号患者，还展示了输注后第100天获得的数据（第二列）。e，在17例接受抗CD7 PEBL-CAR T细胞输注的T-ALL患者中，16例患者的骨髓抽吸物中，输注后1个月表达CAR的CD3+ T细胞百分比，与20例接受抗CD19 CAR T细胞的B细胞ALL患者进行比较。条形图表示中位数。双尾Mann-Whitney检验，***P<0.0001。f，通过流式细胞术或数字滴定PCR（ddPCR）测量，T-ALL的1号患者体内抗CD7 PEBL-CAR T细胞的长期持久性（第736天）与抗CD19 CAR T细胞进行比较。流式细胞术和ddPCR的单次测量结果见补充图5。
自体抗CD7蛋白表达阻滞剂（PEBL）-CAR T细胞的制备
CAR T细胞制备的详细信息见补充图2和扩展数据表4。抗CD7 PEBL和抗CD7 4-1BB-CD3ζ CAR基因通过双顺反子γ逆转录病毒载体（补充图3）同时表达，获得的CAR T细胞中位数为96.7%（89.1%-99.1%）。这一比例明显高于使用相似载体（补充图3）和制备方案为20例B细胞急性淋巴细胞白血病（B细胞ALL）患者准备的抗CD19 CAR T细胞产品（中位数51.5%（16.6%-80.3%）；P<0.0001；图2a）。两组的T细胞扩增情况相似（图2b），表明非转导CD7+ T细胞的消除以及CAR驱动的T细胞增殖有助于抗CD7 PEBL-CAR T细胞的富集。抗CD7 PEBL-CAR T细胞的平均CD4与CD8表达比例为1.1:1（图2c）。大多数CAR T细胞具有T效应记忆（TEM）表型，但在所有产品中均可检测到T中央记忆（TCM）细胞（图2d）。程序性细胞死亡1（PD-1）、淋巴细胞激活基因3（LAG-3）和T细胞免疫球蛋白及黏蛋白域3（TIM-3）的表达与活化的增殖T细胞中观察到的典型表达相似（图2e）。T细胞受体Vβ（TCRVβ）链家族的分析显示，CAR T细胞为多克隆（图2f）。抗CD7 PEBL-CAR T细胞对CD7+靶细胞表现出强大的细胞毒性（图2g）。
所有17份起始细胞产品均含有白血病细胞（0.01%-60.3%；中位数1.35%），但在CAR T细胞制备后，均未检测到存活的白血病细胞（图2h和扩展数据表4）。在培养开始时，85.6%（69.8%-96.9%）的CD3+ T细胞为CD7+；在最终产品中未检测到表达CD7的CD3+ T细胞。
体内抗CD7 PEBL-CAR T细胞的扩增
在CAR T细胞输注前，所有患者均接受环磷酰胺加氟达拉滨（n=16）或依托泊苷（n=1）的清淋化疗（扩展数据表5）。输注的抗CD7 CAR表达T细胞的剂量为每公斤体重0.5×106个（总量上限为35×106个）；输注的CAR T细胞中位数为28.3×106个（范围5×106-35×106个）（扩展数据表4）。
输注后，所有17例患者的外周血中均可检测到CAR T细胞（图3a，b）。图3b，c比较了抗CD7 PEBL-CAR T细胞与参考B细胞ALL组中的抗CD19 CAR T细胞水平；抗CD19 CAR T细胞按每公斤体重1.0×106个（总量上限为70×106个）给药，除一名患者按每公斤体重0.5×106个给药外（中位总CAR T细胞数33.3×106个；范围12.8×106-64.2×106个）。抗CD7和抗CD19 CAR均含有4-1BB和CD3ζ信号域（补充图3），且两组使用的清淋方案相似（扩展数据表5）。尽管第7天时抗CD19 CAR T细胞的整体水平更高，但后续样本中抗CD7 CAR T细胞的水平显著升高（图3c），在输注后1个月内达到更高水平（P<0.001；补充图4a）。
输注后1个月，CD8+ CAR T细胞通常占主导地位（补充图4b）。在一例患者中，多达220天的多个时间点测量了CD4和CD8的表达；在整个过程中，CD8表达始终占主导地位（补充图4c）。抗CD7 CAR T细胞为多克隆，且随时间推移，占主导地位的TCRVβ家族发生变化（补充图4d）。输注后1个月，大多数CAR T细胞仍保留TEM表型，尽管在所有研究病例中均可检测到TCM细胞，且在部分病例中可检测到T干细胞记忆（TSCM）细胞（图3d）。输注后1个月，所有研究样本中均存在缺乏与T细胞增殖或耗竭相关标志物表达的CAR T细胞（补充图4e）。骨髓抽吸物中存在抗CD7 PEBL-CAR T细胞；其在T细胞中的百分比显著高于抗CD19 CAR T细胞（P<0.0001；图3e）。脑脊液（CSF）中也可检测到抗CD7 CAR T细胞（补充图4f）。
在系列研究中的首例患者（未接受造血干细胞移植（HSCT）巩固治疗）中，评估了CAR T细胞输注后长达48个月的长期持久性。通过流式细胞术可检测到CAR T细胞长达18个月，但在随后24个月和48个月的两次外周血样本中未检测到（补充图5）。数字滴定PCR（ddPCR）的结果与流式细胞术的结果相似，但在24个月时检测到信号；48个月时变为阴性（补充图5）。总体而言，该患者的长期CAR持久性在B细胞ALL组中观察到的抗CD19 CAR T细胞的范围内（图3f）。相比之下，在另一例HSCT后1-3个月评估的患者中，骨髓和外周血样本中未检测到CAR T细胞。
抗CD7 PEBL-CAR T细胞的安全性
17例患者中无一例发生3级或更高级别的细胞因子释放综合征（CRS）；10例患者发生1级CRS，3例患者发生2级CRS（扩展数据表6）。CRS发作的中位时间为5天（范围3-8天），CRS的中位持续时间为2天（范围1-7天）。2级CRS的管理包括托珠单抗（n=1）、托珠单抗和芦可替尼（n=1）以及托珠单抗、西妥昔单抗和芦可替尼（n=1）。另有两例患者因复发性病毒感染（n=1）或COVID-19长期排毒（n=1）被认为有发生CRS的风险，在CAR T细胞输注当天给予托珠单抗；其中一例患者发生1级CRS，另一例患者未发生CRS。无一例患者接受类固醇治疗或需要转至重症监护室。
仅有两例患者发生1级免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）。其表现为手震颤和感觉过敏，分别在输注后21天和27天出现；症状轻微，分别在5天和7天后自发缓解。
所有17例患者在输注后30天内均发生2级或更高级别的免疫效应细胞相关血液毒性（ICAHT）（扩展数据表6）；8例患者在30天内未能达到绝对中性粒细胞计数>1,000/μl。在同一时期，五例患者发生3级或更高级别的CTCAE（不良事件通用术语标准）感染。这些患者均无需重症监护治疗。所有毒性，包括30天后的毒性，均列于扩展数据表7。
总体而言，CAR相关毒性与20例接受抗CD19 CAR T细胞治疗的B细胞ALL患者中观察到的相似（补充图6），尽管抗CD7组的2级或更高级别ICANS发生率显著较低；该组无此类事件发生，而抗CD19组有6例（Fisher确切检验，P=0.022）。接受抗CD7 PEBL-CAR T细胞治疗的患者中性粒细胞和单核细胞恢复较慢；然而，如预期所料，B细胞恢复较快（补充图7）。
抗CD7 PEBL-CAR T细胞的抗肿瘤活性
在淋巴耗竭前，17例患者中有16例患者的骨髓（中位数为14.1%；范围为0.0177.9%）和外周血（5.0%；0.0384.1%）中可检测到白血病细胞（图4a）。剩余1例患者在桥接化疗后达到微小残留病（MRD）阴性，但纵隔仍有病灶，可通过正电子发射断层扫描-计算机断层扫描（PET-CT）成像检测到。在16例MRD阳性的患者中，8例还有髓外白血病的证据（扩展数据表1）。入组时，有4例患者被诊断为中枢神经系统（CNS）白血病CNS3，1例患者为CNS2；桥接化疗后，所有患者脑脊液中均未检测到白血病细胞。
输注后1个月内，17例患者中有16例患者的骨髓和外周血均达到了MRD阴性的完全缓解（CR），这是通过流式细胞术（检测灵敏度：1/10,000个细胞或以上）34,35以及影像学缓解来确定的（图4a，b）。总体而言，抗CD7 PEBL-CAR T细胞的MRD反应与抗CD19 CAR T细胞观察到的反应相似，尽管T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）组的疾病负担显著更高（图4a）。1例患者在CAR T细胞输注后骨髓中有49.8%的白血病细胞，外周血中有19.9%的白血病细胞，但残留T-ALL细胞中<1%为CD7+。该患者在输注前的白血病负担较高（骨髓中77.2%为白血病细胞，外周血中84.1%为白血病细胞）；入组时98.6%的白血病细胞表达CD7，但在计划输注前立即检测时，这一比例已降低至88.9%。
截至本分析时（2024年3月15日），CAR T细胞输注后355个月（中位数为15个月），11例患者存活且无白血病证据（图4c和补充图8）。这11例患者中包括所有9例在输注后4481天（中位数为63天）接受造血干细胞移植（HSCT）的患者；供者为单倍体相合（n=4）、同胞全相合（n=1）或无关全相合（n=4）供者。除CAR T细胞和HSCT外，未给予其他抗白血病治疗。2例患者在未进行HSCT巩固的情况下，分别在CAR T细胞输注后7个月和55个月持续处于CR。
在剩余的6例患者中，3例出现T-ALL复发，其中2例患者为CD7−（图4c和补充图8）。1例患者（3号）是唯一未在1个月内达到MRD阴性的患者，且在CAR T细胞输注前已出现CD7− ALL细胞。第2例患者（6号）在CAR T细胞输注后达到了MRD阴性的CR。提供了HSCT巩固治疗，但患者拒绝；输注后3个月发生CD7−复发（CAR T细胞输注前未检测到CD7−细胞）。重要的是，这两例患者复发的T-ALL细胞不表达CAR，排除了制造过程中白血病细胞转导导致CD7消失的可能性。在第3例患者（10号）中，输注后12个月出现CD7表达的复发，最初在CNS，随后全身复发。这3例患者在CAR T细胞输注前的白血病负担均较高，骨髓和外周血中均超过50%（图4d）。6号患者为近早期T前体ALL（near-ETP-ALL），伴有NUP214::ABL1；其他2例患者为非ETP-ALL，无已知的复发性白血病特异性遗传改变（扩展数据表1）。
另外3例患者在骨髓和外周血中MRD阴性的情况下死亡。1例患者死于播散性真菌感染。她在CAR T细胞输注前的白血病负担非常高：骨髓中77.2%，外周血中62.8%。初次输注后，白血病细胞比例降低至44.3%和30.1%；前3周内外周血中CAR T细胞的水平是本系列中观察到的最低水平。她在第一次输注后25天接受了第二次输注，CAR T细胞扩增良好（14天后达到每微升1,402.2个），达到了MRD阴性；然而，绝对中性粒细胞计数仍<每微升1,000个。她在第二次输注后48天死亡。另1例患者在CAR T细胞输注后6个月死亡。他在CAR T细胞输注前有CNS白血病，并曾接受颅部放疗。输注后2个月，他出现视野缺损，磁共振成像检测到视神经增强；他的神经状况逐渐恶化。输注后第21天和第30天，脑脊液中可检测到CAR T细胞（<每微升1个），但在随后第64天和第83天的样本中未检测到。第3例患者在CAR T细胞输注后3个月死亡；他在CAR T细胞输注前也有CNS白血病，并曾接受颅部放疗。他变得越来越嗜睡，下肢无力加重；磁共振成像检测到颞叶有占位性病变。输注后第37天、第47天和第61天收集的脑脊液样本中可检测到CAR T细胞，但始终<每微升1个。在这两例患者中，考虑了孤立性CNS复发的可能性，但流式细胞术未检测到脑脊液中的白血病细胞。
图4e显示了接受抗CD7 CAR T细胞治疗患者的总生存率和缓解失败/复发的累积发生率。与未接受CAR T细胞治疗的复发或难治性T-ALL患者的历史队列相比，接受CAR T细胞输注的患者治疗结果显著改善（P=0.012；补充图9）。
免疫细胞重建
如果抗CD7 PEBL-CAR T细胞能够诱导T-ALL肿瘤细胞杀伤，那么它们也可能抑制淋巴耗竭后正常T细胞和自然杀伤（NK）细胞（表达CD7）29,36,37的重建。在接受抗CD7 PEBL-CAR T细胞的患者中，T细胞和NK细胞均有所恢复，但恢复率通常低于接受抗CD19 CAR T细胞的患者（图5a，b和补充图10a，b）。值得注意的是，恢复的T细胞和NK细胞缺乏CD7表达（图5c），这解释了它们如何逃避抗CD7 CAR介导的细胞毒性。再生的T细胞为多克隆性，TCRVβ家族随时间的表示各不相同（图5d）。输注后1个月，非CAR T细胞具有记忆表型，在所有样本中均可检测到TSCM、TCM和TEM细胞（图5e）。CD4+和CD8+非CAR T细胞的百分比可变，与B细胞ALL患者的情况相似（补充图10c）。
为了进一步评估CD7− T细胞的功能，我们对本系列中第一例未接受HSCT且随访4.5年的患者进行了额外研究，重点关注其序列样本。CAR T细胞在输注后持续存在至第736天（图3f和补充图5）。CD7+ T细胞在第367天出现，占非CAR T细胞的0.1%，并逐渐增加，在第1464天达到60.8%（补充图11a~c）。幼稚T细胞在第736天出现（此时CAR T细胞已无法检测到）并表达CD7；在第1464天，幼稚和记忆亚群的分布与健康人外周血T细胞相似（图5e）。CD7+ NK细胞在第543天变得可检测到（占NK细胞的0.6%），并逐渐增加，在第1464天达到87.6%。
该患者在CAR T细胞输注后未发生任何相关感染，并在CAR T细胞输注后25个月接种了SARS-CoV-2疫苗，当时78%的非CAR T细胞仍为CD7−。我们使用覆盖SARS-CoV-2刺突蛋白的肽池刺激全血，纵向分析了该患者SARS-CoV-2疫苗诱导的T细胞扩增动力学。通过干扰素-γ（IFNγ）（图5f）和白细胞介素-2（IL-2）（图5g）的分泌来评估刺突特异性T细胞反应的大小，并与之前报道的一组包括8例接受抗CD19 CAR T细胞治疗的B细胞ALL患者和26名健康个体38进行了比较。接受抗CD7 CAR T细胞治疗的患者的T细胞在疫苗接种后用刺突肽池刺激后也表达了活化标志物，其范围与接受抗CD19 CAR T细胞治疗的患者和健康个体中观察到的相似（补充图10d，e）。
图4 | 抗CD7 PEBL-CAR T细胞的抗白血病活性。a，通过流式细胞术测量17例T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）（“CD7”组）患者在输注抗CD7 PEBL-CAR T细胞前和输注后1个月的骨髓和外周血样本中的微小残留病（MRD）水平。将数据与20例接受抗CD19 CAR T细胞治疗的B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）患者（“CD19”组）的数据进行比较。灰色区域表示未检测到ALL细胞。**P = 0.0086，***P < 0.0001（双尾曼-惠特尼检验）。b，第16例T-ALL患者在CAR T细胞输注后18天进行的全身氟代脱氧葡萄糖-18（FDG）正电子发射断层显像-计算机断层扫描（PET-CT）成像显示，肝脏和脾脏的FDG摄取显著减少，而在CAR T细胞输注前16天，这些部位显示有广泛的病灶浸润。c，泳道图总结了17例接受抗CD7 PEBL-CAR T细胞治疗患者的治疗结果。d，输注前骨髓中MRD水平与复发的关系。P = 0.0118（双尾曼-惠特尼检验）。e，17例T-ALL患者的总生存期和无缓解/复发累积发生率的Kaplan-Meier曲线。
图5 | 抗CD7 PEBL-CAR T细胞输注后的免疫细胞重建。
a，在17例T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）患者（‘CD7’组；排除第30天未达到微小残留病（MRD）阴性的第3例患者）中的16例，通过流式细胞术检测CAR T细胞输注后100天内或直至造血干细胞移植（HSCT）时的外周血非CAR CD3+ T细胞绝对数量，并与B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）患者（‘CD19’组；n=20）进行比较。b，输注后1个月非CAR CD3+ T细胞水平。所示为均值±标准差（s.d.）值。**P=0.0024（双尾曼-惠特尼检验）。c，流式细胞术点图显示抗CD7 PEBL-CAR T细胞输注前后T细胞和自然杀伤（NK）细胞中CD7的表达。d，堆叠柱状图显示CAR T细胞输注后表达不同T细胞受体可变β链（TCRVβ）家族的非CAR T CD3+细胞的百分比。所示数据来自健康供体（‘PB’）的外周血T细胞、第14和第18例B-ALL患者的数据，以及第6、7、15和16例T-ALL患者输注后1个月的数据，还有第1例T-ALL患者的序贯数据。e，输注后具有初始（CD45RA+、CD45RO−、CD95−、CD197hi）、干细胞记忆（TSCM；CD45RA+、CD45RO−、CD95+、CD197hi）、中央记忆（TCM；CD45RA−、CD45RO+、CD197+）和效应记忆（TEM；CD45RA−、CD45RO+、CD197−）表型的非CAR T细胞的百分比。所示数据来自健康供体（‘PB’）的T细胞、第14和第18例B-ALL患者，以及第6、7、15和16例T-ALL患者输注后1个月的数据，还有第1例T-ALL患者的序贯数据。f，第1例T-ALL患者在CAR T细胞输注后25个月接种严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）疫苗后的刺突肽介导的干扰素γ（IFNγ）反应，与抗CD19组的8例患者和26名健康个体的反应进行比较38。参与者在第0天和第21天接种BNT162b2 mRNA疫苗。在第0、11、21、31、42和90天采集血样。通过三重测试量化全血经刺突肽池和二甲基亚砜（DMSO）对照刺激后分泌到血浆中的IFNγ38。g，如f所述分析白细胞介素-2（IL-2）反应。在f和g中，箱线图的上下限分别对应第25和第75百分位数，中线表示中位数；须线从最小值延伸至最大值。
讨论
我们为17例复发或难治性T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）患者输注了抗CD7 PEBL-CAR T细胞，这些患者已用尽所有可能的治愈性治疗选择。我们使用的双顺反子载体和当前良好生产规范（cGMP）方案产生了高比例的CAR T细胞，这些细胞即使在骨髓和外周血中白血病细胞水平较高的患者中也能产生显著的白血病缓解效果。尽管肿瘤负荷较高、CAR T细胞扩增活跃，以及来自恢复的CD7+免疫细胞的额外刺激，但未出现严重的CAR相关毒性。这种明显矛盾的原因尚不清楚，但我们推测，在制备过程中，非转导T细胞对CAR T细胞的预激活可能降低了其细胞因子分泌潜力，而不影响其抗肿瘤活性。值得注意的是，在抗CD7 CAR T细胞存在的情况下，CD7− T细胞（和自然杀伤（NK）细胞）得到了恢复；随着CAR T细胞的消失，CD7+免疫细胞重新出现。
我们选择CD7作为靶点，因为其在T-ALL中表达高且稳定29。其他研究者已开发出针对其他T细胞标志物的CAR T细胞，如T细胞受体β链恒定区1（TRBC1）、CD1a和CD5（参考文献39-43）。本研究中17例患者中仅有5例患者的白血病细胞表面表达TCR；其中2例患者表达TCRγδ，第三例患者仅有53%的细胞表达TCRαβ。8例患者表达CD1a，表达范围在21%至75%之间。15例患者表达CD5，但仅有9例患者的表达超过90%（补充图1）。此外，根据定义，CD5在早前T细胞前体急性淋巴细胞白血病（ETP-ALL）中缺失或弱表达31。其他研究者也使用CAR T细胞靶向CD7。Pan等44,45使用来自造血干细胞移植（HSCT）供体的同种异体T细胞治疗了20例患者；其中8例患者要么有髓外残留病灶，要么在输注后11个月内复发，另有5例患者在缓解期死亡。Zhang等46报道了7例接受自体抗CD7 CAR T细胞治疗的T-ALL患者；其中5例患者要么疾病难治，要么在输注后9个月内复发46。这两项研究都使用了与我们原始的PEBL相似的技术来防止CAR T细胞的自相残杀29。尽管这些研究和我们研究中的患者数量相对较少，无法进行确定性比较，但我们的大多数患者仍处于缓解状态，其中2例患者未接受HSCT或进一步治疗而持续完全缓解（CR），包括1例患者已接近5年持续CR。仅1例患者在CAR T细胞输注前>10%的白血病细胞为CD7−时，抗CD7 PEBL-CAR T细胞未能诱导微小残留病（MRD）阴性的CR；CAR T细胞输注后剩余的所有T-ALL细胞均为CD7−。另2例患者T-ALL复发，其中1例复发时CD7−。在接受抗CD19 CAR T细胞治疗的患者中已报道有CD19−复发47，而在接受抗CD7 CAR T细胞治疗的T-ALL患者中，克隆逃逸是否会更频繁发生仍不清楚。重要的是，CAR T细胞输注后的CD7− T-ALL细胞缺乏CAR表达，这排除了CD7阴性是在CAR T细胞制备过程中诱导的可能性，因为慢病毒载体表达抗CD19 CAR时曾有过此类描述48。
其他研究者已应用基因编辑来防止CAR T细胞的自相残杀49-51。Chiesa等51对编码CD7、TCRβ链（以避免移植物抗宿主病（GVHD））和CD52（以允许使用阿伦珠单抗预防排斥反应）的基因进行了碱基编辑。报告的3例患者中有2例达到了MRD阴性的CR并接受了HSCT；其中1例患者有随访数据，其在HSCT后9个月仍处于缓解状态51。与健康供体来源的同种异体细胞相比，患者来源的细胞特性更难以预测，而前者作为现货产品在临床上具有价值，特别是对于疾病快速进展的患者。虽然删除TCR表达可以避免GVHD52-54，但排斥反应的问题尚未得到令人信服的解决，而Chiesa等使用的方法充其量只能延缓这一问题。因此，同种异体CAR T细胞仅作为通往HSCT的桥梁。我们的研究表明，即使在白血病负荷较高的患者中，无论年龄大小（本研究中有一例患者71岁），也有可能制备出有效的自体抗CD7 CAR T细胞。然而，这些因素的影响需要在更广泛的研究中进一步阐明。
一些研究者认为，CD7下调是不必要的，尽管存在自相残杀，但仍可以制备出针对T细胞抗原的有效CAR T细胞55-57。在最近报道的60例CD7+白血病或淋巴瘤患者中，包括35例T-ALL患者，47例患者在输注此类CAR T细胞后达到了CR57。在接受HSCT的37例患者中，1年无进展生存率为67.2%，而未接受HSCT的10例患者为15.0%。在早期的一项研究中，研究者发现，未进行CD7下调制备的CAR T细胞扩增率比进行CD7删除的低45倍55，且输注后CAR T细胞的中位持续时间仅为30天57。我们认为，至少这样的方法增加了CAR T细胞产品的不可预测性。考虑到制备PEBL-CAR T细胞的过程（与CAR T细胞制备过程相同）相对简单，这似乎是不必要的风险。
我们的结果表明，抗CD7 PEBL-CAR T细胞可以规避限制当前复发或难治性T-ALL治疗的耐药机制。对于复发或难治性急性淋巴细胞白血病（ALL）患者，如果其达到MRD阴性的CR，通常会建议其接受HSCT；我们的9例患者在CAR T细胞治疗后接受了HSCT，且均保持缓解状态。支持早期HSCT巩固治疗的一个论点是，它可以降低肿瘤负荷较高的患者复发风险，并应减轻输注后免疫介导的细胞因子释放综合征（ICAHT）和血细胞计数降低的潜在风险。在我们研究的初期，对于在抗CD7 CAR T细胞存在的情况下恢复的免疫细胞的功能也存在不确定性。一个反驳论点是，HSCT具有较高的发病率和死亡率风险，对于在输注抗CD7 CAR T细胞后达到MRD阴性CR的患者，尤其是CAR T细胞治疗前白血病负荷较低的患者，应省略HSCT。我们对抗CD7 CAR T细胞的抗白血病效果和恢复的免疫细胞的免疫能力（这些细胞为多克隆，并对抗原刺激有反应）的观察进一步支持了这一观点。省略HSCT的选择将扩大这种治疗的适用范围，因为许多患者可能不适合接受HSCT。本研究中描述的免疫细胞工程化过程应在任何具备CAR T细胞制备能力的中心都能轻松实施，并且也应适用于自动化即时制备58,59，这可以进一步促进治疗的可及性。
