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摘要
背景：对乙酰氨基酚（APAP）诱导的肝毒性是一种可能危及生命的疾病。栀子果实提取物（GJE）以栀子苷（Gen）为主要活性成分，具有抗炎和抗氧化特性，可能有助于解决APAP诱导的肝毒性的潜在发病机制。本研究旨在评估GJE在APAP诱导的肝毒性小鼠模型中的效果。
方法：将24只雄性ICR小鼠分为4组（每组6只）：[1] 对照组，小鼠给予蒸馏水；[2] APAP组，小鼠单次给予600 mg/kg的APAP；[3] APAP+低剂量GJE组，小鼠给予APAP后30分钟，再分别给予两次低剂量GJE（0.44 g/kg/次，含栀子苷100 mg/kg/次），两次给药间隔8小时；[4] APAP+高剂量GJE组，小鼠给予APAP后，再分别给予两次高剂量GJE（0.88 g/kg/次，含栀子苷200 mg/kg/次）。所有小鼠在给予APAP后24小时被安乐死。取肝脏组织进行组织学检查和谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）水平测定。取血清用于测定丙氨酸转氨酶（ALT）和炎性细胞因子（肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6））的水平。
结果：肝脏组织病理学检查显示，APAP组出现中度至重度肝坏死性炎症，而两个治疗组仅观察到轻度坏死性炎症。APAP组的血清ALT水平较对照组显著升高，但在低剂量和高剂量GJE治疗后显著降低。APAP组的血清TNF-α水平较对照组显著升高，且在高剂量GJE治疗后显著降低（分别为135.5±477.2 pg/mL、35.5±25.8 pg/mL、74.7±47.2 pg/mL、41.4±50.8 pg/mL）。血清IL-6的变化趋势与TNF-α相似。APAP组的肝脏GSH水平较对照组显著降低，但在低剂量和高剂量GJE治疗后均显著升高（分别为19.9±4.5 nmol/mg蛋白、81.5±12.4 nmol/mg蛋白、71.4±7.8 nmol/mg蛋白、82.6±6.6 nmol/mg蛋白）。相反，APAP组的肝脏MDA水平较对照组显著升高，但在高剂量GJE治疗后显著降低（分别为108.6±201.5 nmol/mg蛋白、40.5±18.0 nmol/mg蛋白、40.5±16.8 nmol/mg蛋白）。
结论：栀子果实提取物治疗可以缓解APAP诱导的肝毒性，可能通过其抗炎和抗氧化特性发挥作用。
背景
对乙酰氨基酚，又称N-乙酰对氨基酚（APAP），是一种广泛用于缓解各种疼痛和发热症状的药物。在治疗剂量下，该药物通常是安全的；然而，无论是故意还是非故意过量服用，都可能导致肝毒性和急性肝衰竭。在美国，对乙酰氨基酚过量是药物性肝损伤最常见的原因[1]，每年导致56,000次急诊就诊、2600次住院和500例死亡。这一问题在全球范围内也同样严重，因为对乙酰氨基酚过量是全球第二大肝移植指征[2]。Gulmez等人[3]的一项研究显示，在导致肝移植的急性肝衰竭病例中，有六分之一归因于对乙酰氨基酚过量。对乙酰氨基酚中毒的症状分阶段出现，从非特异性症状（如恶心和呕吐）开始，到肝酶升高、黄疸，最终发展为肝衰竭。其影响可能是致命的，并与多器官衰竭相关[1]。根据Chun等人[4]的研究，在未接受治疗的对乙酰氨基酚诱导的肝毒性患者中，有1%~2%死于肝衰竭。
在多种对乙酰氨基酚过量的解毒剂中，N-乙酰半胱氨酸已被广泛接受为主要的标准治疗方法。然而，N-乙酰半胱氨酸确实存在不良反应的风险，并有相对禁忌症。一些病例中报告了类过敏反应，如荨麻疹、血管性水肿、低血压和支气管痉挛[5]。N-乙酰半胱氨酸还与硝酸甘油存在药物相互作用，使得后者成为其使用的禁忌[6]。寻找对乙酰氨基酚诱导的肝损伤的其他治疗途径是尚未满足的治疗需求。
为了寻找具有保肝活性的植物化学物质，已对植物来源的天然化合物进行了实验研究。先前的研究显示，姜黄素和芦荟在改善对乙酰氨基酚诱导的肝炎方面取得了成功[7, 8]。在众多具有保肝作用的草药制剂中，栀子果实提取物（GJE）及其主要活性成分栀子苷和京尼平[9]已被证明能通过其抗炎、抗氧化和抗凋亡作用减轻肝损伤[4, 10–16]。先前的研究显示，GJE在治疗肝脏疾病方面有多种用途，如通过抑制音猬因子信号传导[11]阻止肝星状细胞活化[10]，从而减轻肝纤维化；改善D-氨基半乳糖和脂多糖诱导的肝衰竭[12]；以及对肝缺血具有保护作用[13]。先前的动物研究已揭示了GJE对抗APAP诱导肝毒性的保护作用的潜在机制。在小鼠胆汁淤积性肝病模型中，GJE能以剂量依赖性的方式通过抑制Toll样受体4（TLR4）/核因子κB（NF-κB）信号传导来减轻肝坏死和小叶炎症，这也是APAP诱导肝损伤中的重要信号通路[17]。此外，来源于栀子（Gardenia jasminoides J. Ellis）的栀子苷被证明能增加接受四氯化碳小鼠的肝脏超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性，并降低肝脏丙二醛（MDA）水平[18]。值得注意的是，SOD和GSH-Px是第二相生物转化中的重要酶，能保护肝细胞免受APAP毒性[19]。在小鼠肝纤维化模型中，栀子苷还降低了炎症细胞因子水平，如白细胞介素（IL）-6、IL-1β和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）[18]。
鉴于GJE在其他肝病模型中显示的抗氧化和抗炎作用，我们假设GJE可能用于减轻APAP诱导的肝毒性。这一假设得到了Yang等人[20]研究的支持，该研究显示，预先给予GJE中的主要成分栀子苷处理，可通过下调CYP2E1表达和抑制TLR4/NF-kB信号通路，成功减轻APAP诱导的肝毒性。然而，在该研究中，小鼠是在用APAP诱导肝毒性之前预先给予栀子苷处理，这不适用于患者已经摄入APAP后的现实情况。因此，在我们的研究中，我们首先用APAP诱导肝毒性，然后再给予GJE治疗。此外，GJE减轻APAP诱导肝毒性的机制尚需进一步阐明。因此，本研究旨在探讨栀子果实提取物对APAP诱导肝毒性小鼠的治疗效果和机制。
材料与方法
动物
共购买24只5周龄（体重30~34 g）的雄性癌症研究所（ICR）小鼠，购自泰国曼谷Nomura Siam International Co., Ltd.。小鼠饲养在标准房间内的木屑中，温度控制在24±1 ℃，湿度为55±10%，光照周期为12小时明暗交替。所有小鼠均喂食标准饲料，并随意饮用紫外线反渗透水。本研究根据泰国国家研究委员会（1999年）的《动物使用伦理原则和指南》以及《2015年科学用途动物法》进行，并按照《动物研究：体内实验报告（ARRIVE）指南》进行报告。本研究方案经朱拉隆功大学医学院动物护理和使用委员会批准（批准号：011/2565）。
将对乙酰氨基酚（泰诺）溶解在蒸馏水中。制备600 mg/kg的对乙酰氨基酚剂量，并通过胃管口服给予APAP组小鼠。根据我们之前的研究（未发表数据），使用水后再用50%乙醇的提取方法相比单独使用水或乙醇，能从GJE中获得最高的栀子苷产量。因此，本研究选择了这种提取方法。栀子果实购自零售店。GJE的制备方法是：首先将研磨后的干燥栀子果实浸泡在蒸馏水中60分钟。然后收集滤液，并将粗提取物再次浸泡在50%乙醇中60分钟。将两步的滤液混合，并使用蒸发器（R-300 BUCHI Rotavapor，瑞士）进行蒸发。使用高效液相色谱（HPLC）分析对提取物中的栀子苷含量进行定量。使用液相色谱-质谱法鉴定提取物中的栀子苷。在HPLC色谱图中，栀子苷的峰在保留时间9.4分钟时出现（补充图1）。保留时间为9.4分钟时的栀子苷质谱图显示质量为411.13，如补充图2所示。根据结果，质荷比为411 m/z的栀子提取物质谱图代表栀子苷的分子量加上Na+的分子量。这些质谱图与先前报道的栀子苷在203、231、249和379 m/z处的MS2质谱图一致。干提取物中栀子苷的产量为22.67±0.26%。所有方法均符合相关机构、国家和国际指南及法规。
我们根据栀子苷的预定剂量来确定提取物的剂量。在低剂量GJE组中，小鼠应接受100 mg/kg/剂的栀子苷；因此，提取物的剂量为0.44 g/kg/剂（根据100/22.67 * 100/1000计算得出）。对于高剂量GJE组，使用相同的计算方法，小鼠接受0.88 g/kg/剂的GJE提取物，其中含有200 mg/kg/剂的栀子苷。在低剂量和高剂量干提取物给予治疗组小鼠之前，均将其溶解在蒸馏水中。选择栀子苷剂量的依据来源于Yang等人[18]的研究。在他们的研究中，小鼠在用APAP诱导肝毒性之前，预先给予10、30和100 mg/kg的栀子苷处理。他们发现100 mg/kg的剂量效果最佳。在我们的研究中，是先用APAP诱导肝毒性，然后再给予含有栀子苷的GJE治疗。因此，我们选择100 mg/kg的栀子苷作为低剂量参考，并探索200 mg/kg是否会显示出更高的有效性。根据Tang等人的一项急性毒性研究，栀子提取物的LD50估计超过15 g/kg/天，且接受15 g/kg/天剂量栀子提取物的大鼠在尸检时均未显示出任何与治疗相关的变化[21]。因此，本研究中使用的GJE提取物剂量在安全范围内。
样本量计算
由于丙二醛（MDA）是感兴趣的结局指标之一，我们使用Yang等人[20]研究中的数据来计算样本量，该研究调查了栀子苷对对乙酰氨基酚肝毒性的保护作用。样本量计算如下所示：
其中，n为样本量，Zα/2 = 1.96（基于Z表，错误拒绝真零假设（α）的概率=0.05），Zβ = 1.645（基于Z表，未能拒绝假零假设（β）的概率=0.95），σ²为合并方差，x₁为APAP组的平均MDA水平（12.22 nmol/mg蛋白），x₂为APAP+栀子苷组的平均MDA水平（6.39 nmol/mg蛋白），n₁为APAP组的样本量[6]，s₁为APAP组的标准差（3.33），n₂为APAP+栀子苷组的样本量[6]，s₂为APAP+栀子苷组的标准差（1.67）。使用上述公式计算得出的样本量为每组6只。
实验方案
24只小鼠随机分为4组（每组n=6）：（i）对照组，小鼠给予蒸馏水；（ii）对乙酰氨基酚（APAP）组，小鼠通过胃管单次给予600 mg/kg的对乙酰氨基酚；（iii）APAP+低剂量葡萄籽提取物（GJE）组，小鼠单次给予600 mg/kg的对乙酰氨基酚，30分钟后再通过胃管给予2次低剂量GJE（0.44 g/kg/次，含原花青素（Gen）100 mg/kg/次），两次给药间隔8小时；（iv）APAP+高剂量GJE组，小鼠单次给予600 mg/kg的对乙酰氨基酚，30分钟后再通过胃管给予2次高剂量GJE（0.88 g/kg/次，含Gen 200 mg/kg/次），两次给药间隔8小时。在给予APAP 24小时后，所有小鼠均通过腹腔注射过量戊巴比妥钠进行安乐死。采集血液和肝脏样本。根据制造商说明书，使用血液样本检测天冬氨酸氨基转移酶（AST，Reflotron Plus，罗氏诊断，瑞士巴塞尔）、丙氨酸氨基转移酶（ALT，Reflotron Plus，罗氏诊断，瑞士巴塞尔）、白细胞介素6（IL-6，R&D Systems，美国明尼苏达州明尼阿波利斯）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α，R&D Systems，美国明尼苏达州明尼阿波利斯）。
肝脏谷胱甘肽测定
将肝脏组织样本在放射性免疫沉淀测定缓冲液（RIPA缓冲液，pH 7.4）中匀浆，随后在4°C下以10,000 x g离心15分钟。根据制造商说明书，使用谷胱甘肽（GSH）测定试剂盒（Cayman Chemical Company，美国密歇根州）测定GSH含量。通过微孔板读数器检测405–414 nm处GSH的光密度（O.D.），测量肝脏GSH水平。肝脏GSH结果以nmol/mg蛋白表示。
肝脏丙二醛测定
将肝脏组织样本在RIPA缓冲液（pH 7.4）中匀浆，随后在4°C下以1,600 x g离心10分钟。根据制造商说明书，使用硫代巴比妥酸反应性物质（TBARS）测定试剂盒（Cayman Chemical Company，美国密歇根州）量化丙二醛（MDA）浓度。通过测量530–540 nm范围内的O.D.，评估肝脏MDA水平。肝脏MDA结果以nmol/mg蛋白表示。
肝脏组织病理学
肝脏样本在10%甲醛中固定24–48小时，并使用标准技术处理，然后嵌入石蜡块中。将切片切成5 μm厚，并用苏木精和伊红（H&E）染色。为了评估对乙酰氨基酚诱导的肝毒性的严重程度，根据Mark E. Blazka等人[22]描述的分级标准，对肝脏的组织病理学变化进行分级：
• 0级：正常组织学。
• 1级：肝细胞最小程度的充血和坏死，局限于中央静脉周围的区域；许多肝小叶未受影响。
• 2级：中央静脉周围区域的中度充血和出血，延伸至中间带细胞；大多数肝小叶受影响。汇合性坏死区域仅限于中央静脉周围的肝细胞。
• 3级：肝脏中央静脉和中间带区域的广泛充血和出血。涉及中央静脉区所有肝细胞的汇合性凝固性坏死；中央静脉区之间坏死区域的桥接常见。
统计分析
组间连续变量的比较采用单因素方差分析（ANOVA），对于正态分布数据，随后进行最小显著差异（LSD）事后分析；对于非正态分布数据，采用Kruskal-Wallis检验，随后进行Dunn事后分析。使用Fisher确切检验比较各组小鼠各病理等级的比例。p值小于0.05表示具有统计学显著性。正态分布数据以均值±标准差（SD）表示，非正态分布数据以中位数±四分位数间距（IQR）表示。所有比较均使用SPSS for MAC版本22.0（SPSS Inc.，美国伊利诺伊州芝加哥）进行分析。
结果
对乙酰氨基酚和栀子果实提取物对肝脏组织病理学的影响
对照组的肝脏组织学表现正常。对乙酰氨基酚（APAP）组的大多数小鼠表现出肝小叶中央区的轻度充血和肝细胞坏死，其中一只小鼠在肝小叶中央区和中间区出现严重充血和出血，并伴有融合性坏死。经低剂量栀子果实提取物（GJE）治疗后，大多数小鼠的肝脏组织学表现正常，而两只小鼠在肝小叶中央区表现出轻度至中度充血和出血。高剂量GJE组的所有小鼠肝脏组织学表现均正常。平均严重程度评分在APAP组高于对照组、低剂量GJE组和高剂量GJE组（分别为1.33 vs. 0 vs. 0.5 vs. 0，所有比较p<0.05，如图1；表1所示）。
对乙酰氨基酚和栀子果实提取物对血清转氨酶、血清炎症标志物和肝脏氧化应激标志物的影响
血清转氨酶 如图2A所示，APAP组的血清天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平显著高于对照组（p<0.001）。与APAP组（589.1±93.5 U/L）相比，低剂量GJE组（194.1±10.4 U/L）和高剂量GJE组（114.7±3.5 U/L）的AST水平显著降低（所有比较p<0.001）。同样，如图2B所示，APAP组的血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平也显著高于对照组（p<0.001）。治疗后，低剂量GJE组（64.2±1.9 U/L）和高剂量GJE组（47.0±3.6 U/L）的血清ALT水平均显著低于APAP组（185.6±36.8 U/L，所有比较p<0.001）。
血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α） APAP组的血清TNF-α浓度（135.5±477.2 pg/mL）显著高于对照组（35.5±25.8 pg/mL，p=0.001，如图2C所示）。与APAP组相比，高剂量GJE组的TNF-α水平显著降低（41.4±50.8 pg/mL，p=0.006），而低剂量GJE组（74.7±47.2 pg/mL，p=0.09）则无显著差异。
血清白细胞介素-6（IL-6） 如图2D所示，APAP组的IL-6水平（245.7±411.2 pg/mL）显著高于对照组（85.2±76.2 pg/mL，p=0.004）。与APAP组相比，高剂量GJE组的IL-6水平显著降低（120.7±58.8 pg/mL，p=0.04），而低剂量GJE组（126.4±112.7 pg/mL，p=0.21）则无显著差异。
肝脏谷胱甘肽（GSH） 如图2E所示，APAP组的肝脏GSH水平显著低于对照组（p<0.001）。与APAP组（19.9±4.5 nmol/mg protein）相比，低剂量GJE组（71.4±7.8 nmol/mg protein）和高剂量GJE组（82.6±6.6 nmol/mg protein）的GSH水平均显著升高（所有比较p<0.001）。
肝脏丙二醛（MDA） 如图2F所示，APAP组的肝脏MDA水平显著高于对照组（p=0.02）。与APAP组（108.6±201.5 nmol/mg protein）相比，高剂量GJE组的MDA水平显著降低（40.53±16.8 nmol/mg protein，p=0.008）。低剂量GJE组（42.7±55.4 nmol/mg protein）的肝脏MDA水平有降低趋势，但与APAP组相比无显著差异（p=0.07）。
讨论
在本研究中，我们探讨了栀子果实提取物在对乙酰氨基酚（APAP）诱导的小鼠肝毒性模型中的作用。我们发现，与APAP组相比，经栀子果实提取物处理的小鼠血清中肝脏转氨酶和炎症标志物（包括白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α））水平显著降低。同时，栀子果实提取物处理的小鼠在肝脏组织学、肝谷胱甘肽（GSH）水平和丙二醛（MDA）水平方面也表现出显著改善。
在治疗剂量下，90%的对乙酰氨基酚通过硫酸化和葡萄糖醛酸化途径代谢，形成无毒代谢产物，而剩余10%的药物由细胞色素P450（CYP450）酶，尤其是CYP2E1代谢，生成一种名为N-乙酰对苯醌亚胺（NAPQI）的有毒产物，该产物进一步与谷胱甘肽结合形成无毒代谢产物。APAP过量会耗尽硫酸化和葡萄糖醛酸化途径，过量的APAP由CYP2E1代谢为NAPQI，导致肝细胞中GSH储备耗竭，并形成共价结合的蛋白质加合物[1]。加合物的形成导致超氧化物产生增加，触发自由基的释放，随后发展为线粒体氧化应激。因此，线粒体应激诱导线粒体通透性转换（MPT）孔开放，释放促凋亡蛋白如BAX。这导致膜电位和ATP合成受损，引起DNA断裂和肝细胞坏死[1, 23, 24]。最终，促炎细胞因子的激活随之而来，如APAP肝毒性中IL-6、IL-8和TNF-α水平升高所证实[25, 26]。
栀子果实作为一种抗炎和抗氧化物质，在多种肝脏疾病中的应用已得到广泛研究。栀子苷是栀子提取物的主要成分，可增强GSH过氧化物酶的活性，并降低肝脏中MDA的水平。研究发现，栀子苷治疗可降低肝纤维化小鼠模型中IL-6、IL-1β和TNF-α的水平。此外，栀子苷还通过下调BAX表达和裂解半胱天冬酶-3来减少肝细胞凋亡[18]。先前的体内外研究表明，栀子苷可通过调节Nrf2/AMPK/mTOR信号通路来减轻非酒精性脂肪肝病中的氧化应激和炎症反应[12]，并增加酒精性脂肪变性中肝细胞核因子-4α和过氧化物酶体增殖物激活受体-α的DNA结合活性[27]。同样，我们的研究表明，栀子果实提取物中的栀子苷可降低APAP诱导的肝毒性小鼠血清中IL-6、TNF-α和肝脏MDA的水平，并增加肝脏GSH水平，这证明了栀子苷的抗炎和抗氧化特性。
我们的研究结果也与之前关于栀子苷作为对乙酰氨基酚肝毒性预防治疗的研究一致。Yang等[20]的研究显示，在给予APAP前预处理三种不同剂量（10、30和100 mg/kg）的栀子苷对小鼠APAP诱导的肝毒性具有保护作用，其中100 mg/kg的栀子苷效果最明显。在该研究中，栀子苷处理的小鼠观察到了类似的生化标志物变化模式，如血清天冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平降低、CYP2E1表达抑制、GSH恢复、MDA水平降低、TNF-α和IL-1β释放减少、巨噬细胞和中性粒细胞浸润减少、TLR4/NF-κB信号通路抑制以及肝细胞坏死减轻，与APAP组小鼠相比。此外，我们也观察到了栀子果实提取物（GJE）和栀子苷对APAP诱导的肝毒性的剂量依赖性效应。然而，我们的研究在设计上与他们的研究不同。在他们的研究中，小鼠在APAP诱导肝毒性之前给予栀子苷。相比之下，我们的研究首先诱导小鼠肝损伤，然后给予治疗，这反映了更具临床相关性的方法。
由于TNF-α是由TLR-4激活触发的重要促炎细胞因子，栀子苷对TLR4/NF-κB通路的抑制[20]可能解释了本研究中观察到的血清TNF-α水平降低。先前的一项体外研究也表明，栀子苷可以激活PI3K/Akt/mTOR信号通路，从而减少TNF-α和IL-6等炎症细胞因子的产生[13, 28]。此外，栀子苷对CYP2E1表达的抑制可能减少NAPQI（APAP的主要有毒代谢产物）的产生，从而减轻APAP诱导的肝毒性[20]。另一项体外研究提示，栀子苷通过增加Nrf2的核转位和上调超氧化物歧化酶（一种重要的抗氧化酶）的表达来增强肝细胞的抗氧化能力[14]。这些机制可能解释了高剂量GJE组（含有栀子苷）中肝脏MDA水平降低的原因。尽管在APAP诱导的肝毒性中尚未直接研究，但栀子果实提取物已被证明在胆管结扎模型中能减轻肝细胞损伤和肝纤维化[10]。另一项动物研究也表明，栀子果实提取物通过抑制TLR4/NF-κB通路，改善了α-萘基异硫氰酸酯（ANIT）诱导的胆汁淤积性损伤中的肝细胞坏死和肝脏炎症[17]。
我们的研究首次评估了栀子果实提取物在APAP诱导的肝毒性中的治疗效果。我们发现，栀子果实提取物通过减轻肝脏坏死性炎症和氧化应激，以及恢复GSH，来减轻对乙酰氨基酚诱导的肝损伤。然而，我们的研究也存在局限性。由于我们在研究中使用的是栀子果实提取物而非纯化的栀子苷，因此我们不能绝对确定栀子果实提取物中的其他成分是否在其治疗作用中发挥了作用。尽管如此，本研究中对栀子果实提取物的高效液相色谱分析显示，其他物质仅占提取物的一小部分。因此，我们假设栀子苷可能是栀子果实提取物发挥作用的主要成分。此外，我们没有使用N-乙酰半胱氨酸（NAC）作为阳性对照；因此，我们无法确定栀子果实提取物的效果是否与NAC等标准治疗相当。然而，这可以成为未来研究的重点。
总之，我们的研究结果提示，栀子果实提取物凭借其抗炎和抗氧化特性，可能作为APAP介导的肝毒性的新型治疗药物。需要进一步的研究来证实栀子果实提取物在临床环境中的效果。
