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摘要：
背景与目标：抑郁常导致早衰，从而增加其他慢性疾病的风险，但很少有研究分析衰老的表观遗传生物标志物与抑郁症状之间的关联。同样，关于地中海饮食（MedDiet）依从性和作息类型对抑郁症状的联合影响，以及性别差异在这其中的作用，相关研究也有限。因此，这些是我们在高心血管风险的地中海人群中进行调查的目标。
方法：我们分析了465名患有代谢综合征的老年受试者（55~75岁），并使用贝克抑郁量表（BDI-II）评估其抑郁症状。地中海饮食依从性通过17项地中海饮食评分进行测量，作息类型通过早晨-晚上型问卷（MEQ）进行评估。我们分析了血液DNA甲基化，并确定了表观基因组中年龄加速的生物标志物。我们重点关注了基于表观基因组计算的达尼丁衰老速度（DunedinPACE）。我们拟合了包含交互项的多变量模型。
结果：女性抑郁患病率在统计学上显著较高（p < 0.001）。在整个群体中，地中海饮食依从性与抑郁症状呈强烈负相关（p < 0.01），而MEQ评分与抑郁症状呈负相关（p < 0.05）。在联合分析中，地中海饮食依从性和作息类型均与BDI-II评分在统计学上保持相关（p < 0.05），表现出叠加效应。未观察到交互效应。在女性中，抑郁症状评分较高与年龄加速较快显著相关（使用DunedinPACE生物标志物测量）。这种关联在调整地中海饮食依从性和作息类型后仍然显著。
结论：在患有代谢综合征的老年受试者中，晚睡型作息与更严重的抑郁症状相关，但较高的地中海饮食依从性可能具有叠加效应，潜在地抵消作息类型带来的风险。女性表现出更强的关联，并且重要的是，我们首次在该人群中报告了抑郁症状与加速衰老之间的关联。
1 引言
多种慢性疾病的最普遍风险因素是衰老[1]。人口老龄化给健康、长期护理和福利系统带来了新挑战。鉴于全球人口老龄化的趋势，促进健康老龄化至关重要[2-4]。为了促进健康老龄化，必须考虑健康的广泛定义，即身体、心理和社会健康的最佳状态[5,6]。抑郁是一种影响心理健康的情绪障碍，是老年人中常见的心理健康问题，并且日益成为公共卫生关注的焦点[7]。抑郁的患病率因国家而异，但据估计，全球60岁及以上老年人中约有14%患有心理问题。Rong等发表了过去30年间全球、区域和国家层面150多个国家老年人抑郁障碍的患病率和趋势[7]。此外，在初级保健环境中，老年人的抑郁常常被漏诊[8,9]。抑郁与痛苦相关，可能导致身体、心理和社会健康方面的局限。它经常对其他疾病的进展产生不利影响，并使疾病管理变得复杂[10]。另一方面，一些慢性疾病，如癌症或心血管代谢疾病的发生，会增加抑郁的风险[11-13]。
因此，需要进一步研究老年人群中抑郁的特征和风险因素，同时结合最新的方法论进展。近年来，组学技术取得了显著进步，促进了基因组和表观基因组数据的收集。已经开展了大量关于抑郁遗传学的研究，包括大型全基因组关联研究（GWAS）[14,15]；然而，研究结果相对不一致[16]，这可能是由于与环境因素的实质性相互作用[17,18]。表观基因组学，特别是DNA甲基化研究的应用，似乎更有前景[19]。在表观遗传分析中，通过计算所谓的“表观基因组时钟”来探究所谓的加速衰老，引起了最大的兴趣[20-23]。发现新型甲基化时钟的研究正在迅速发展，并应用于各种健康问题。
目前，最常用的时钟是第一代（Horvath和Hannum时钟）[24]和第二代（GrimAge和PhenoAge）时钟[25,26]。这些甲基化时钟估计一个人的生物年龄，并计算所谓加速衰老，即实际年龄与生物年龄之间的差异。其中许多时钟已与糖尿病、心血管疾病、癌症和全因死亡率等慢性疾病的高风险相关[24-28]。除了这些时钟外，DunedinPACE（基于表观基因组计算的达尼丁衰老速度）是新一代中最值得注意的[29]。这个时钟测量生物衰老的速度，有一些研究表明它与心血管疾病、糖尿病、癌症、全因死亡率以及肝脏和肾脏疾病相关[29-31]。然而，鉴于DunedinPACE出现时间较晚，与其前代相比，利用它的研究较少。有趣的是，尽管有假设认为抑郁可能与更大的生物衰老相关，但研究这一联系的研究非常少。此外，一些研究观察到了不一致的结果[32-38]。因此，我们对在老年人群中测试这一关联感兴趣。研究之间的差异可以由多个因素解释。其中，我们可以提到抑郁定义的异质性[16]、人口统计学特征[39,40]和其他生活方式因素[41-43]。关于人口统计学特征，研究一致显示女性抑郁患病率高于男性[39,40]。因此，在本研究中，我们将进行性别分层分析。
在生活方式因素中，饮食是研究最多的因素之一[44-51]。总体来说，我们可以认为健康饮食，特别是地中海饮食（MedDiet）与较低的抑郁风险相关[44,47,50]，但也有一些相互矛盾的结果[51]。另一个引起极大兴趣的因素是作息类型。作息类型是指个人的昼夜节律，决定了他们何时最清醒和活跃，以及何时最有可能入睡[52]。在“极端早起型”到“极端晚睡型”的连续体中，个体可以被分为五组或三组。精神疾病被认为在晚睡型个体中更为普遍。关于抑郁，大量证据将晚睡与抑郁障碍联系起来[53-59]，尽管也报告了一些性别[58]和人口特征的异质性[59]。因此，本研究旨在解决地中海地区老年人群中作息类型、地中海饮食依从性和加速衰老方面的这些空白。为了实现这一目标，首先，我们将考虑性别异质性，检验作息类型和地中海饮食依从性与抑郁及抑郁症状的独立和联合关联。其次，我们将研究在这个人群中，抑郁症状在考虑作息类型和地中海饮食依从性前后与加速衰老的关联程度。
2 材料和方法
2.1. 研究设计和参与者
我们在基线时进行了横断面分析，涉及来自PREDIMED Plus-Valencia研究的参与者（n=465），该研究是多中心PREDIMED Plus研究的一个现场中心；PREDIMED Plus是一项正在西班牙进行的随机化一级预防试验[60]。我们收集了每位参与者基线访问期间的数据和样本。我们于2014年3月至2016年12月连续招募了参与者。本研究未进行纵向随访。该试验已在https://www.isrctn.com/ISRCTN89898870注册（访问日期：2024年12月1日）。符合条件的参与者来自瓦伦西亚现场中心的几个初级保健医疗机构，是社区居住的成年人（男性55-75岁；女性60-75岁），体重指数（BMI）在超重或肥胖范围，且患有代谢综合征。纳入和排除标准已在其他地方发表[60]。简而言之，纳入标准包括上述年龄范围、超重或肥胖（超重BMI：27-29；肥胖：30-39 kg/m²）、在基线时至少符合代谢综合征的三个组分，且在入组时无心血管疾病。排除标准包括：无法提供书面知情同意或与研究人员沟通；机构化；有心血管疾病史；活动性恶性肿瘤；任何严重合并症且预期寿命少于24个月；无法遵循推荐的干预措施；在筛查访问前6个月内体重减轻>5 kg；对地中海饮食任何成分过敏；免疫缺陷或HIV阳性状态；肝硬化或慢性肾功能衰竭；目前使用减肥药物；同时参与另一项随机临床试验；以及任何其他可能干扰研究方案完成的情况。
我们对这些在瓦伦西亚现场中心招募的参与者进行了分析，因为作息类型数据和DNA甲基化结果[61]仅在瓦伦西亚现场进行了评估。从瓦伦西亚现场招募的所有参与者（n=465）中获得了人口统计学、临床、生活方式和抑郁数据。其中，获得了额外的作息类型数据（未包含在一般多中心研究中）（n=426）。对414名受试者进行了DNA甲基化分析和加速衰老的计算。
参与者提供了书面知情同意。研究方案和程序根据《赫尔辛基宣言》的道德标准，经瓦伦西亚大学人类研究伦理委员会批准（批准代码：H1373255532771，2013年7月15日；H1509263926814，2017年11月6日）。
2.2. 基线人口统计学、临床、人体测量学、生化和生活方式变量
在基线时，通过问卷评估了社会人口学数据、生活方式（吸烟、睡眠时长等）、用药情况和临床特征，如之前所述[60]。抑郁诊断通过该问卷获得，定义为自我报告的终生医学抑郁诊断[45,46]。此外，我们还收集了抑郁诊断的年龄。2型糖尿病的评估如之前报道[60]。人体测量和血压由受过训练的人员按照PREDIMED Plus协议进行评估[62,63]。使用校准过的秤和壁挂式身高计分别评估体重和身高。体重指数（BMI）通过体重（公斤）除以身高（米）的平方计算得出。腰围在正常呼气后，使用人体测量带测量最低肋骨和髂嵴中点处的周长。血压使用经过验证的半自动振荡计（Omron HEM-705CP，荷兰）测量，个体保持坐位5分钟。过夜禁食后，通过静脉穿刺采集静脉血样本。如之前所述[63]，测定空腹血浆总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、甘油三酯和葡萄糖。此外，如之前所述[61]，还测定了外周血样本的全血细胞计数（包括总白细胞计数和白细胞类型）。
采用经过验证的REGICOR简短体力活动问卷[64]来测量休闲时间体力活动。该问卷包括关于活动类型、频率（天数）和持续时间的问题。与休闲时间体力活动相关的总能量消耗通过计算每种活动的频率、持续时间和强度的总和，再除以30天得出，并以代谢当量（METs）/分钟/天作为连续变量进行估计。还根据中位数得出了一个体力活动的二分类变量。我们使用经过验证的17项筛查问卷来估计地中海饮食的依从性，该问卷用于PREDIMED-Plus研究[65]。该问卷包括17个关于地中海饮食习惯依从性的问题。我们对问题评分0（不符合标准）或1（符合标准），最高得分为17分，得分越高表示地中海饮食依从性越高。该量表是我们之前验证过的14项地中海饮食依从性问卷（14-MEDAS）的更新版本[66]。两个量表的大部分项目相同。更新版本（17-MEDAS）增加了一些额外项目和能量减少的地中海饮食框架。我们已发表了构成17-MEDAS评分的详细问题[61]。随后，将评分分为分类变量：一个基于人群平均值（低于或高于8分），另一个分为三个近似三分位数：低依从性（0-6分）、中依从性（7-9分）和高依从性（10-17分）。
2.3. 抑郁症状的评估
我们选择了贝克抑郁量表（BDI-II）[67]，该量表已在西班牙得到验证[68]，用于评估基线时的抑郁症状。这是青少年和成人（13至80岁）中最广泛使用且验证良好的自评抑郁症状测量工具之一，可提供当前抑郁相关症状的测量。BDI-II由21个问题组成，每个问题采用李克特型量表，评分范围从0（无）到3（总是）。所有问题的评分总和即为总分，总分范围为0至63。总分越高表示抑郁症状越严重。根据总分，有一些标准化的分界值来分类个体：最小抑郁（0–13分）、轻度抑郁（14–19分）、中度抑郁（20–28分）和重度抑郁（29–63分）[69]。
2.4. 晨晚型问卷（MEQ）
我们使用广泛应用的晨晚型问卷[70]来评估个体在昼夜偏好或时型上的差异。MEQ被认为是时型的国际金标准测量工具，也是时间生物学中最常用的测量工具之一。MEQ包含19个问题，涉及偏好的起床和睡觉时间以及日常活动安排。总分越高表示越倾向晨型。我们在一些分析中将MEQ评分作为连续变量使用，同时考虑了不同研究中报告的分界点可能存在的差异[71]。最初提出的MEQ时型分界值如下：绝对晨型（70–86分）、中度晨型（59–69分）、中间型（42–58分）、中度晚型（31–41分）和绝对晚型（19–30分）。我们还对极端和中度晨型及晚型进行了分组，以便进一步分析（低于42分为晚型，高于58分为晨型）。
2.5. DNA甲基化分析和DunedinPACE计算
从血液中分离出基因组DNA。我们使用PicoGreen（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA）测量双链DNA的数量。如之前报道[61]，我们使用Infinium HumanMethylationEPIC BeadChip（850 K）阵列（Illumina Inc., San Diego, CA, USA）分析DNA甲基化。此外，我们还在荷兰鹿特丹的伊拉斯姆斯医学中心的人类基因组学设施中处理了这些阵列，包括使用Zymo EZ-96 DNA甲基化试剂盒（Zymo Research, Irvine, CA, USA）进行亚硫酸盐转化、杂交以及使用Illumina HiScan机器进行扫描。我们还进行了质量控制程序，以评估使用R包Minfi（版本3.18）、Meffil（版本1.1.1）和ewastools（版本1.7.2）[72–74]获得的DNA甲基化数据的质量和可靠性。我们成功对414个样本进行了质量控制，之后计算了DNA甲基化时钟。我们进行了数据归一化[75,76]，包括功能归一化和正态指数带外（NOOB）校正，并获得了相应CpG位点的β值。使用Belsky等人[29]描述的DunedinPACE R包，从β矩阵中计算出DunedinPACE评分。虽然我们的主要目的是使用DunedinPACE生物标志物分析抑郁与加速衰老的相关性，但考虑到这是一个新型生物标志物，且以往研究分析了第二代生物标志物，如GrimAge表观遗传时钟和年龄加速（AgeAccelGrim）[25]，我们还根据Lu等人[25]提出的算法，使用在线Horvath表观遗传年龄计算器[24]，从β值中计算了这个生物标志物。
2.6. 统计分析
在测试研究假设之前，我们完成了数据的初步筛选和清洗。我们使用卡方检验分析比例。使用学生t检验和ANOVA检验比较连续变量的原始均值。我们使用多变量回归模型，依次调整潜在混杂因素，分析感兴趣因素与因变量（BDI-II评分、晨晚型或年龄加速）之间的关联。当指示时，模型依次调整如下：模型1，未调整；模型2，调整性别、年龄和糖尿病；模型3，进一步调整BMI、吸烟、体力活动、睡眠持续时间和教育程度。此外，根据统计分析，模型还进一步调整了抑郁诊断、时型和/或对地中海饮食的依从性。为了研究时型和对地中海饮食依从性的交互作用，我们使用了多变量层次回归模型，包括主效应和交互项，并进一步调整了上述协变量。对于加速衰老，我们将分析重点放在以Dunedin-PACE评分为因变量的模型上，并依次调整潜在混杂因素。此外，仅为了与其他研究进行比较，我们还分析了以AgeAccelGrim生物标志物为因变量的模型。对于连续变量作为因变量，我们使用了一般线性模型。对于二分类变量作为结果，我们使用了多变量逻辑回归模型。我们从相应的多元校正模型中估计了连续变量的调整均值。我们对整个人群进行了分析，并根据性别进行了分层。我们使用IBM SPSS Statistics版本26.0（NY）和R中的特定工具进行了统计分析。所有检验均为双尾检验，p值<0.05被认为这些关联具有统计学显著性。
3 结果
3.1. 参与者的一般特征和抑郁症状的患病率
在基线时，表1显示了按性别划分的研究参与者（n=465）的人口统计学、生活方式和临床特征。这代表了PREDIMED-Plus-Valencia研究中招募的所有参与者样本量，包括男性（n=198）和女性（n=267）。他们均患有代谢综合征，平均年龄为65岁（标准差：5岁）。肥胖的患病率较高，且男性和女性之间无统计学显著差异（BMI的p=0.651）。同样，我们未发现基于性别的糖尿病患病率存在统计学显著差异（p=0.753）。我们也未发现性别在对地中海饮食依从性上存在统计学显著差异（p=0.022）。然而，我们在教育水平（女性主要为小学教育）、烟草吸烟（女性消费量较少）和体力活动（女性更多久坐）方面发现了男性和女性之间的统计学显著差异（p<0.05）。关于既往诊断的抑郁患病率，总人口中为8%，平均BDI评分为9分（标准误：0.2）。77%的参与者报告“最小抑郁症状”，15.5%的参与者报告“轻度抑郁症状”，5.2%报告“中度”，1.5%报告“重度抑郁症状”。
对于所有这些抑郁变量和抑郁症状水平，我们发现性别之间存在非常显著的差异，女性的值始终更高（p<0.05）。然而，对于诊断的抑郁，我们还收集了任何一生抑郁障碍的发病年龄。在这一人群中，与男性相比，女性抑郁症的发病年龄并不更早，因为男性和女性抑郁症平均发病年龄（男性51.8岁；标准误：2.5年；女性50.3岁；标准误：2.5年）之间无统计学显著差异（p=0.751）。当我们分析睡眠持续时间时，发现女性的睡眠持续时间短于男性（p<0.05）。同样，她们的MEQ问卷平均评分也较低（p<0.05），表明更倾向于晚型。时型数据仅收集了426名参与者的信息，这些参与者对MEQ的所有问题都给出了完整回答，而MEQ仅在瓦伦西亚站点进行。
表1. 研究人群按性别划分的人口统计学、临床和生活方式特征。
3.2. 抑郁症状与人口统计学、临床及生活方式变量的关联
首先，我们在本研究人群中测试了贝克抑郁量表第二版（BDI-II）的内部一致性，并获得了极佳的结果。我们发现，参与者的克朗巴赫α系数为0.87。其次，我们分析了主要的人口统计学、临床及生活方式特征与男性和女性抑郁症状之间的关联。表2展示了多变量回归模型的结果，该模型已对其他变量进行了调整。
性别与抑郁症状的严重程度密切相关（p < 0.001）。即使在对其他协变量进行调整后，女性的平均回归系数仍比男性高出3.23分（标准误：0.68）。同样，在多变量模型中，考虑到对性别的调整，既往有抑郁症医学诊断与更高水平的抑郁症状相关（β值：3.12；标准误：1.04；p = 0.003）。2型糖尿病也与更高水平的抑郁症状显著相关（糖尿病患者相比非糖尿病患者高出1.64分；标准误：0.06；p = 0.005）。在多变量调整（包括性别）后，我们未发现教育程度、吸烟、体力活动、身体质量指数（BMI）和年龄与抑郁症状之间存在统计学上显著的关联。
有趣的是，睡眠时长与抑郁症状呈负相关（p = 0.010）。尽管我们同时测量了工作日和休息日的睡眠时长，但由于这些变量之间的高度相关性以及为避免多重共线性，我们仅在拟合模型中纳入了其中一个变量（即工作日的睡眠时长）。此外，我们估计了上述分析变量与确诊抑郁症在多变量逻辑回归模型中的关联，该模型包含了所有这些变量。在此模型中，仅性别与终身临床诊断抑郁症显著相关（优势比 = 3.11；95%置信区间：1.28–7.61；女性与男性比较，p = 0.01）。
表2. 抑郁症状与人口统计学、临床及生活方式变量的关联。
3.3. 昼夜节律类型与抑郁症及抑郁症状的关联
本样本中，晨昏偏好问卷（MEQ）的总分范围为26至76分，分值越高表示越倾向于早起型。整个样本中，MEQ的内部一致性良好（克朗巴赫α系数=0.727）。我们根据方法部分所述的MEQ分数截断值，将昼夜节律类型划分为五类。因此，在整个样本中，五类昼夜节律类型的分布如下：绝对早起型（3.5%）、适度早起型（33.3%）、中间型（58.9%）、适度晚睡型（3.6%）和绝对晚睡型（0.7%）。我们发现，根据贝克抑郁量表（BDI）评估，早起-晚睡分数与抑郁症状之间存在强烈关联（图1）。各昼夜节律类型的平均BDI分数分别为：绝对早起型4.8 ± 0.8分；适度早起型8.6 ± 0.8分；中间型9.2 ± 0.4分；适度晚睡型11.2 ± 2.4分；绝对晚睡型12.3 ± 4.9分（趋势p值=0.005）。在调整性别、年龄和糖尿病后，该关联仍然具有统计学意义（p=0.032），即使在进一步调整身体质量指数（BMI）、吸烟、体力活动、睡眠时长和教育后，该关联仍然显著（p=0.035）。
我们还将极端和适度的早起型及晚睡型进行分组，以便进一步分析，并创建了一个三类变量（晚睡型、中间型、早起型）。这个变量也与抑郁症状水平强烈相关。因此，在晚睡型、中间型和早起型受试者中，重度抑郁的患病率分别为11.1%、1.6%和0.0%，而轻度抑郁的患病率分别为61.1%、77.7%和81.5%（p<0.047）。按性别分层的当前抑郁症状分析显示，男性和女性均呈现出相似的趋势。此外，我们还考察了终身抑郁症诊断与作为连续变量的MEQ分数之间的关联。首先，我们在包括男性和女性的整个人群中测试了这种关联。在未调整模型中，与未诊断抑郁症的患者相比，已诊断抑郁症患者的MEQ分数显示出显著关联（β值=-2.92 ± 1.40分；p=0.023）。然而，在调整性别、年龄和糖尿病后，统计显著性降低（p=0.052）。按性别分层的模型显示，女性中的关联更强且具有统计学意义（p=0.011），而男性中则不然（p=0.551）。图2展示了女性中MEQ分数（作为连续变量）与既往诊断抑郁症之间的关联。该模型（调整年龄和糖尿病）表明，既往诊断抑郁症的女性在MEQ上的得分比未诊断者低-4.25 ± 1.70分。在进一步调整BMI、吸烟、体力活动、睡眠时长和教育后，该关联仍然具有统计学意义（p=0.008）。
图1. 五种昼夜节律类型与男性和女性抑郁症状的关联（n=426）。根据协变量，显示了昼夜节律类型变量的p值。1：未调整；2：调整性别、年龄和糖尿病的模型；3：进一步调整身体质量指数（BMI）、吸烟、体力活动、睡眠时长和教育的模型。误差线：均值的标准误（SE）。
图2. 女性中抑郁症诊断（无，有）与晨昏偏好问卷（MEQ）分数的关联（n=247）。模型1（调整年龄和糖尿病）和模型2（进一步调整BMI、吸烟、体力活动、睡眠时长和教育）中抑郁症的p值。展示了均值和点。误差线：均值的标准误（SE）。
3.4. 地中海饮食依从性与抑郁症状的关联
首先，我们分析了地中海饮食（MedDiet）依从性（作为连续变量）与男性和女性总体抑郁症状之间的关联。我们使用了17项地中海饮食依从性筛查工具（17-MEDAS）评分，其中评分越高表示依从性越好。在所有使用的模型中，地中海饮食依从性与抑郁症状呈高度显著的负相关（依从性每增加1分，抑郁症状减少0.34 ± 0.10分；在调整性别、年龄和糖尿病的模型中，p = 0.001）。即使在进一步调整身体质量指数（BMI）、吸烟、体力活动、睡眠时长和教育后，这一结果仍然具有统计学显著性（beta = −0.35 ± 0.10；p = 0.001）。在按性别分层的分析中，男女之间这种负相关的发现具有可比性，但在女性中更为明显。图3展示了抑郁量表第二版（BDI-II）评分与地中海饮食依从性之间的关联，依从性分为低、中、高三个等级，具体方法见方法部分。同样，我们的模型在调整性别、年龄、糖尿病、BMI、吸烟、体力活动、睡眠时长和教育后，揭示了与抑郁症状的强烈负相关（p = 0.002）。
图3. 地中海饮食依从性（三个类别）与男性和女性抑郁症状（BDI-II评分）的关联（n=465）。1：调整性别、年龄和糖尿病的模型。2：进一步调整BMI、吸烟、体力活动、睡眠时长和教育的模型。误差线：均值的标准误（SE）。
当我们研究地中海饮食依从性（作为连续变量）与一生中曾被诊断为抑郁症的关联时，我们发现整个人群的p值在统计学上并不显著（完全调整模型的p = 0.142）。同样，我们也没有在男性（p = 0.531）或女性（p = 0.056）中发现与抑郁症诊断有统计学上显著的关联。
3.5. 昼夜节律类型与地中海饮食依从性对抑郁症状的联合效应
在分别考察了昼夜节律类型和地中海饮食依从性对抑郁症状的影响后，我们现在分析了多元回归模型中包括这两个变量的联合效应。表3展示了分析这些联合效应的统计模型结果（beta ± SE和p值）。模型1、2和3与分别分析效应时使用的模型具有相同的顺序拟合。
表3. 无交互项的多元回归模型中昼夜节律类型与地中海饮食（MedDiet）依从性的联合效应。以及包含交互项的额外建模分析。
在所有调整后的模型中，昼夜节律类型和地中海饮食（MedDiet）依从性这两个变量均保持统计学显著性，各自均为抑郁症状的独立预测因素。在完全调整后的模型（模型3）中，这两个变量均呈现出统计学上显著的加性效应，即早晨型昼夜节律与较低的抑郁症状相关（−0.89 ± 0.45；p = 0.046），每向早晨方向推进一个类别，抑郁症状就有所降低。同时，更高的地中海饮食依从性也有助于降低抑郁症状（−0.29 ± 0.11分；p = 0.007），依从性每增加一分，抑郁症状就有所减少。在比较了主要效应后，我们另外建立了一个回归模型，其中包括昼夜节律类型和地中海饮食之间的交互项。然而，我们并未观察到统计学上显著的交互作用，这表明在拟合的三个模型中，加性联合效应不存在异质性。
3.6. 抑郁症状与年龄加速之间的关联
如方法部分所述，我们计算了DunedinPACE评分作为我们选定的年龄加速生物标志物。这是一种新型的血液DNA甲基化生物标志物，通过单一血液样本测量生物衰老的速率，并指示个体相对于每年标准衰老速率的老化速度。评分高于1表示“更快”的生物衰老，而评分低于1则表示“更慢”的生物衰老。414名参与者提供了DNA甲基化数据和随后的DunedinPACE生物标志物估算值。在这一样本中，DunedinPACE评分的范围从0.66到1.53。首先，我们分析了男性和女性中抑郁症状（BDI-II评分）与DunedinPACE生物标志物之间的关联。然而，在调整性别、年龄和糖尿病后，我们得到的结果仅具有边缘显著性（p = 0.078）。随后，我们对男性和女性进行了单独分析，并发现女性中BDI-II评分更高与衰老更快之间存在统计学上显著的关联（beta = 0.003 ± 0.001；p = 0.040）。在同一调整性别、年龄和糖尿病的回归模型中，男性未获得统计学上显著的结果（p = 0.905）。此外，我们测试了男性和女性中抑郁症状严重程度与DunedinPACE年龄加速生物标志物之间的关联。在女性中（p = 0.026），但在男性中（p = 0.289），我们在调整年龄和糖尿病的模型中获得了统计学上显著的关联（图4）。在进一步调整BMI、吸烟、体力活动、睡眠时长和教育后，这一关联仍然具有统计学显著性。
此外，当考虑对昼夜节律类型和地中海饮食依从性的额外调整后，抑郁症状严重程度更高与加速衰老（DunedinPACE生物标志物）之间的关联仍然具有统计学显著性（p = 0.027）。最后，为了进行比较，我们使用经典GrimAge表观遗传时钟和年龄加速（AgeAccelGrim）分析了抑郁症状与年龄加速之间的关联，如方法部分所述。对于这一生物标志物，我们观察到了类似的趋势，即年龄加速与抑郁症状严重程度相关增加，但结果未达到统计学显著性（全体人群p = 0.375，女性p = 0.132）。
图4. 女性（n = 216）中抑郁症状（4个标准化类别）与年龄加速（DunedinPACE生物标志物）之间的关联。1：调整性别、年龄和糖尿病的模型。2：进一步调整BMI、吸烟、体力活动、睡眠时长和教育的模型。3：进一步调整昼夜节律类型和地中海饮食的模型。误差条：均值的标准误（SE）。
4 讨论
本研究在西班牙地中海地区高危心血管疾病的老年人中开展，证实了昼夜节律类型对抑郁症状的重要性，与其他研究结果一致[59,77]。我们观察到，抑郁症状的出现率与较晚的昼夜节律类型相关[52–55,59,77]。昼夜节律类型被认为会影响心理健康[78,79]，现有证据表明，晚型昼夜节律者患心理健康障碍，主要是抑郁症状的风险增加[52–55,59,77–82]。然而，其潜在机制仍在研究中[83–85]，需要进一步探索。我们研究了地中海饮食（MedDiet）和昼夜节律类型对抑郁症状的独立和联合效应，并发现了它们之间存在稳健的关联。无论将地中海饮食作为连续变量还是分类变量分析，较高的地中海饮食依从性均与抑郁症状呈强烈负相关。众多先前研究已探讨了饮食与抑郁症状之间的关联[43–51]。根据饮食的不同，研究结果存在差异[48–51]，且已确定许多因素为潜在混杂因素。一个可能的原因是抑郁或抑郁症状的定义存在异质性[16]，以及所研究的饮食模式或成分的定义存在变异性[48,49]。在许多与营养或遗传学相关的流行病学研究中，抑郁和抑郁症状被报告为一种“最小表型”状况，依赖于简短的问卷或自我报告的分类[16]。此外，基于贝克抑郁量表第二版（BDI-II）评分的抑郁定义临界值可能因已发表的研究而异[16,68,86]。因此，例如，即使在先前在PREDIMED-Plus队列中进行的营养研究中，也考虑了多个BDI-II临界值来识别抑郁[45,46,69]。尽管抑郁和抑郁症状定义的异质性也影响了分析昼夜节律类型及所有与抑郁相关因素的研究，但晚型昼夜节律与更严重抑郁症状的关联比饮食与抑郁症状的关联更为稳健。昼夜节律类型随时间相对稳定的特点可能对此有所贡献。根据一项为期7年的纵向研究结果，该研究发现昼夜节律类型是一种稳定的、类似特质的构念，在分析期间仅略有提前[87]。尽管众所周知，随着年龄的增长，人们的昼夜节律类型会趋向于早型[88]，但总体而言，人们的昼夜节律类型比饮食更稳定，因为昼夜节律类型更难改变。然而，饮食是一个更动态的因素，其组成可能每天都在变化。此外，在抑郁的背景下，确定饮食是原因还是结果具有挑战性。饮食灵活性与昼夜节律类型稳定性之间的差异可能有助于解释本研究中的某些发现。因此，我们发现昼夜节律类型与抑郁诊断变量之间存在统计学上显著的关联。这是一项自我报告的终身医学诊断（本样本年龄范围为20至70岁）。然而，与地中海饮食与当前抑郁症状的强烈关联相比，地中海饮食与已诊断抑郁之间的关联在统计学上的显著性有所降低。除了昼夜节律类型的稳定性和饮食的变异性外，还有其他因素有助于饮食模式或饮食特征的全面定义。在先前研究饮食与抑郁症状关系的荟萃分析中，饮食定义的有效性是一个重要方面[48,49,89–91]。因此，基于宏量营养素、饮食多样性或西方模式的饮食等定义模糊的饮食与抑郁表型之间的关联不一致。相反，包括地中海饮食在内的传统饮食和其他健康饮食模式表现出更稳健的负相关[48–50,89–91]。在本研究中，我们使用17项地中海饮食依从性筛查工具（17-MEDAS）[65]观察到抑郁症状与地中海饮食依从性之间存在强烈的负相关。在地中海地区，该问卷已得到明确验证[65]，并且是先前由我们团队验证的14项地中海饮食依从性筛查工具（14-MEDAS）的更新版本[66]。这一更新版本提供了额外的证据来支持这些统计关联。
然而，这是一项横断面研究，需要更多的纵向研究来分析抑郁发病率[92]。此外，尽管地中海饮食干预试验的结果支持这种健康饮食模式的保护作用[93]，但按性别、年龄组、地理来源和其他条件分层的更多研究将为更个性化的干预提供额外证据。我们横断面研究的一个相关发现是，我们同时使用早晨-夜晚型问卷（MEQ）检查了地中海饮食依从性和昼夜节律类型的影响。这是PREDIMED-Plus多中心研究中唯一在基线时测量昼夜节律类型的地点。在多变量回归模型中（包括其他潜在混杂因素），我们观察到昼夜节律类型和地中海饮食均具有叠加且独立的效应。因此，较高地中海饮食依从性可能抵消晚型昼夜节律与较高抑郁风险的不良关联。
在本研究中，除抑郁和抑郁症状外，另一个高度相关的因素是性别。女性被诊断患有抑郁的患病率超过男性的两倍，且抑郁症状的严重程度也显著高于男性。这种性别特异性关联已在多项先前研究中报道[39,40,94]。仍需更多研究来更好地解释这种复杂的性别特异性差异，这可能与女性更易患内化障碍（如抑郁）而男性更易患外化障碍（如反社会人格）有关。我们还观察到本研究中调查的关联（女性中更高）存在一些性别特异性差异，主要与昼夜节律类型和生物年龄加速相关。
据我们所知，这是第一项在西班牙地中海人群中分析抑郁症状与年龄加速之间关联的研究。同样，在全球范围内，分析表观遗传年龄加速/生物衰老速度与抑郁症状之间关联的研究仍然很少[32–38]。目前，考虑到多项研究已证明表观遗传生物标志物在年龄加速方面与慢性疾病和死亡风险增加之间存在强烈关联[20–31]，生物衰老的生物标志物和年龄加速的估计受到了极大关注。此外，基于DNA甲基化的表观遗传生物标志物具有动态性，可通过特定干预措施进行修改[95]。然而，已开展的研究结果不一。再次强调，抑郁定义的异质性、研究人群的社会人口学特征、对潜在混杂因素的调整和表观遗传时钟的多样性可能对结果不一致产生影响。因此，首批关于表观遗传生物标志物的研究之一在“跨生命周期多样性社区中的健康老龄化研究”中分析了所谓的第一代三个时钟[32]的白人和非裔美国参与者。使用的三个表观遗传生物标志物是通用表观遗传年龄加速（AgeAccel）、内在表观遗传年龄加速和外在表观遗传年龄加速。然而，未发现这些生物标志物与抑郁症状（BDI-II评分）之间存在统计学上显著的关联。然而，Liu等人[33]在一项同卵双胞胎对照研究中分析了6个DNA甲基化生物标志物（包括Horvath的DNA甲基化年龄加速、Hannum的内在表观遗传年龄加速、外在表观遗传年龄加速、GrimAge加速和PhenoAge加速）与抑郁症状之间的关联，并考虑了潜在混杂因素（遗传和环境），发现某些生物标志物（Hannum、外在表观遗传年龄加速和PhenoAge）之间存在统计学上显著的关联。使用第一代和第二代DNA甲基化生物标志物的其他研究也报告了类似的混合结果。然而，据报道，第三代生物标志物DunedinPACE的表现优于前述生物标志物，最近使用DunedinPACE与第一代和第二代生物标志物相比，在抑郁表型方面获得了统计学上显著的关联。因此，Perret等人[35]提出了五个表观遗传生物标志物：Horvath的全组织（Horvath1）、Horvath的皮肤和血液（Horvath2）、儿童颊部表观遗传年龄（PedBE）、DunedinPACE和应激反应活性。然而，只有DunedinPACE与抑郁表型显示出显著的关联。考虑到先前的结果，在本研究中，我们将重点放在DunedinPACE生物标志物上。此外，我们还估算了GrimAge加速生物标志物以进行比较。如预期所料，我们观察到DunedinPACE生物标志物与女性抑郁症状之间存在强烈的关联。抑郁症状水平越高，年龄加速越快。这一结果在调整年龄和糖尿病的模型中具有统计学显著性，并且在额外调整BMI、吸烟、体力活动、睡眠时长和教育后，仍然具有统计学显著性。即使在考虑昼夜节律类型和地中海饮食依从性后，该关联仍然具有统计学显著性，表明抑郁症状对DunedinPACE加速衰老生物标志物具有其独立的影响。然而，当我们使用GrimAge加速生物标志物拟合相同模型时，尽管获得了相似的趋势，但并未获得显著的结果。我们的结果支持先前的研究，即第一代/第二代表观遗传时钟不是抑郁或功能衰退的良好预测指标。它们还支持使用DunedinPACE生物标志物作为发现抑郁相关表型的有益方法，这表明选择正确的表观遗传生物标志物对衰老研究至关重要。
我们的研究有优势和局限性。主要优势在于研究人群在生活方式变量方面表型明确，包括地中海饮食依从性、使用经过验证且内容丰富的MEQ问卷和BDI-II问卷，以及与吸烟、体力活动、睡眠时长和疾病表型相关的其他协变量。此外，我们从血液中提取了DNA，在表观基因组范围内经过验证的阵列中测量了DNA甲基化，并计算了最相关的衰老生物标志物，包括DunedinPACE和GrimAge加速生物标志物。尽管有这些优势，但本研究也存在一些局限性。首先，我们进行的是一项横断面研究，因此难以在所检查的关联中建立因果关系。然而，我们正在收集纵向数据，以更好地了解这些和其他纵向关联。第二，应在具有高危心血管疾病的地中海地区老年人群中开展额外研究，以检验本研究结果的外部有效性。未来样本量较大的研究应重点关注本研究中提示的性别特异性关联，以更好地理解其潜在意义和机制。
