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益智（Alpinia oxyphylla Miq.，AOM）是一种传统中药治疗中风后的药物，具有改善认知功能的作用，但其疗效和潜在机制尚不清楚。本研究旨在验证以下假设：AOM能诱导成年海马神经发生，并通过激活脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）信号通路改善中风后认知障碍。为了验证这一假设，我们采用了大鼠瞬时大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型的体内实验和氧-葡萄糖剥夺加复氧处理的神经干细胞（neural stem cell，NSC）体外实验。首先，在体内实验中，AOM治疗显著上调了大鼠海马中BDNF、肌动蛋白受体激酶B（tropomycin receptor kinase B，TrkB）和磷酸化AKT（phosphorylated AKT，p-AKT）的表达，增强了成年海马神经发生，并改善了MCAO后缺血大鼠的空间学习/记忆和认知功能。其次，体外研究证实，对香豆酸（p-coumaric acid，P-CA）是从AOM提取物中鉴定出的最有效化合物，具有激活BDNF/TrkB/AKT信号通路和促进NSC增殖的特性。BDNF/TrkB特异性抑制剂ANA12的联合处理消除了P-CA对诱导BDNF/TrkB/AKT激活和NSC增殖的作用。最后，动物实验表明，P-CA治疗增强了海马神经元的增殖和分化，改善了空间学习和记忆功能，并减轻了瞬时MCAO缺血大鼠的焦虑情绪。综上所述，P-CA是AOM中具有代表性的化合物，其生物活性包括激活BDNF/TrkB/AKT信号通路、促进海马神经发生、改善认知功能以及减轻缺血性脑卒中大鼠的焦虑情绪。
背景
脑卒中是一种因脑部血液流动受阻而导致的高致死率和致残率的主要疾病负担（Johnston等，2018）。脑卒中患者会遭受运动功能障碍、瘫痪、认知障碍（Mijajlovic等，2017），甚至猝死（Donnan等，2008）。目前的治疗策略，包括组织型纤溶酶原激活剂溶栓和机械取栓，对于恢复缺血性脑部的血液流动是有效的，但其治疗窗口分别限制在4.5小时和6小时内。超出黄金治疗窗口的延迟溶栓治疗会增加颅内出血转化的并发症风险，并提高脑卒中患者的死亡率（Gravanis和Tsirka，2008）。迄今为止，尚无用于脑卒中治疗中的神经保护和神经发生的药物。
成人神经发生为寻求修复受损大脑和改善脑卒中后患者功能恢复的治疗靶点带来了新的希望（Wang等，2012；Sun等，2013）。侧脑室衬里的室下区（subventricular zone，SVZ）和齿状回（dentate gyrus，DG）中的亚颗粒区是大脑中成人神经发生的中心区域（Lois和Alvarez-Buylla，1994；Eriksson等，1998）。DG中的新生神经元有助于成人海马神经发生，从而改善学习和记忆功能（Deng等，2010）。成人海马神经发生包括一系列顺序事件，以在DG中生成新的兴奋性颗粒细胞。新生神经元在整合到海马回路之前会经历几个连续的生成阶段。首先，具有星形胶质细胞特性的放射状胶质样前体细胞（1型细胞）表达神经干细胞（neural stem cells，NSCs）的生物标志物。这些细胞会产生具有先胶质（2a型）后神经元（2b型）表型的中间祖细胞。在发育成迁移性成神经细胞样阶段（3型）后，这些新生谱系特定细胞进入成熟阶段，并将其树突延伸到分子层，将其轴突延伸到CA3，最终形成颗粒细胞（Markakis和Gage，1999）。通过标记各种生物标志物，我们可以追踪海马神经发生在不同阶段的过程。例如，双皮质素（doublecortin，DCX）与海马中的多聚唾液酸神经细胞黏附分子的表达完全重叠，这些被用作成人神经发生的替代标志物（Kempermann等，2015）。DCX在增殖到有丝分裂后成熟阶段表达，并常用作神经发生的生物标志物（Encinas和Enikolopov，2008；Kempermann等，2015；Chen等，2020）。DCX和神经元核（neuronal nuclei，NeuN）常用作神经发生的生物标志物，并与外源性细胞示踪剂5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷（50 -bromo-20 -deoxyuridine，BrdU）共染，以识别新生神经元并指示中枢神经系统中的成人神经发生。BrdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，可通过DNA合成转移到分裂细胞中（Lehner等，2011）。整合到新DNA中后，BrdU将传递给子细胞（Kee等，2002）。NSCs和/或神经祖细胞（neural progenitor cells，NPCs）的增殖和分化可通过BrdU和DCX和/或NeuN共染来标记，以分别识别未成熟或成熟神经元（Wojtowicz和Kee，2006；Gao等，2018）。因此，这些生物标志物有助于探索成人神经发生的潜在机制，并寻求脑卒中后功能恢复的药物候选分子。
许多由NSCs/NPCs、神经发生微环境和微环境产生的外在和内在因素，在缺血后大脑中形成了复杂的网络调节，以调控成人神经发生。Notch信号、Wnt/β-连环蛋白信号通路、音猬因子通路、骨形态发生蛋白、生长因子、神经营养因子和神经递质是被公认为有助于脑卒中后神经发生的细胞信号级联（Bond等，2012；Faigle和Song，2013；Liu等，2018；Wagenaar等，2018；Ho等，2020；Xu等，2020）。其中，脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是一种关键的神经营养因子，参与调节NSCs的增殖、分化、存活和成熟以进行神经发生。BDNF由信号肽、前结构域和成熟BDNF前体形式组合而成。BDNF的前结构域被细胞蛋白酶去除，以促进成熟BDNF的分泌。通过与肌动蛋白受体激酶B（tropomycin receptor kinase B，TrkB）受体结合，BDNF磷酸化激活下游途径，包括MAP激酶/CREB、PI-3激酶/Akt和Ras/Raf/MEK/Erk信号通路（Mohammadi等，2018）。BDNF及其受体TrkB在海马区域高度表达，以形成记忆（Egan等，2003）。BDNF促进新生儿缺氧缺血性脑损伤中的神经功能恢复（Im等，2010）。内皮细胞衍生的BDNF形成促进了缺血纹状体中神经前体细胞的血管介导迁移（Grade等，2013）。BDNF的过度表达提高了移植NSCs的存活率，并促进了实验性缺血性脑卒中动物模型中的神经功能恢复（Lee等，2010；Chang等，2013；Rosenblum等，2015）。在人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）中腺病毒转导BDNF基因可有效促进其移植后的存活，增强内源性NSCs的增殖，并在大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠模型中促进功能恢复（Jeong等，2014）。BDNF增加了牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）的存活和分化，并促进了DPSC移植的脑缺血动物模型中的神经功能恢复（Zhang X.等，2018）。此外，血浆BDNF水平被用作反映MSCs移植中细胞活力和功能恢复的生物标志物（Nakamura等，2019）。相反，BDNF的反义寡核苷酸抑制缺血大脑中NSCs的增殖和分化（Li等，2017）。抑制成人海马神经发生会恶化认知表现并减少现有的齿状神经元。联合模拟运动和升高BDNF水平以增强成人神经发生，可改善认知功能并保护阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）小鼠模型中的后续神经元细胞死亡（Choi等，2018）。因此，BDNF是脑卒中后治疗中成人神经发生和功能恢复的重要治疗靶点。
传统中药（traditional Chinese medicine，TCM）在中国和东亚地区已被用于治疗脑卒中数个世纪。来自人类受试者的直接经验为药物发现提供了快速通道来源。益智（Alpinia oxyphylla Miq.，AOM）是一种常用于TCM配方中改善认知功能的药用植物，但其疗效和科学基础尚不清楚。近期研究表明，AOM治疗可减轻神经元细胞死亡，改善β-淀粉样蛋白诱导的认知障碍，减少皮层和海马中的神经元异常，并增强小鼠的记忆（Shi等，2014，2015）。AOM通过靶向TrkB受体介导的pERK/pCREB/BDNF信号系统发挥抗抑郁样作用（Yan等，2016）。然而，AOM是否具有促进缺血性脑卒中中学习和记忆功能恢复的神经发生作用尚不清楚。在此，我们报告AOM可通过诱导BDNF信号通路在短暂性脑缺血卒中治疗中促进海马神经发生并增强学习和记忆的功能恢复。此外，我们已从AOM中鉴定出对香豆酸（p-coumaric acid，P-CA）为代表性化合物，其具有促进BDNF信号传导以诱导海马神经发生并改善缺血性脑卒中大鼠模型中的功能恢复的特性。
材料与方法
草药材料与试剂
益智（Alpinia oxyphylla Miq.）购自香港华新制药有限公司（批号：170807），原产地为中国海南省。小鼠多能神经祖细胞或干细胞样细胞C17.2[07062902，欧洲认证细胞培养物保藏中心（ECACC）]购自Sigma-Aldrich公司（美国密苏里州圣路易斯）。胸腺嘧啶类似物BrdU（ab142567）及BrdU（ab6326）、SOX2（ab97959）和BDNF（3B2）抗体购自Abcam公司（英国剑桥）。其他抗体，包括Ki67（D3B5）、NeuN（D4G4O）、DCX（A8L1U）、磷酸化AKT（Ser473）、AKT（C67E7）、β-肌动蛋白（8H10D10）和GAPDH（5174）抗体，购自Cell Signaling Technology公司（美国马萨诸塞州丹弗斯）。TrkB（sc-12）购自Santa Cruz公司（美国德克萨斯州达拉斯）。ANA12由Cayman Chemical公司（美国密歇根州安阿伯）提供。用于高效液相色谱（HPLC）和液相色谱-质谱（LC-MS）分析的溶剂均为HPLC级。质量控制分析所用化合物，包括山柰酚、5-羟甲基糠醛、白杨素、P-CA、诺卡酮、(-)-表儿茶素、儿茶素、原儿茶酸、原儿茶醛和异黄木犀草素，纯度均高于98%，购自中国成都普什生物科技有限公司。
益智提取物及药物溶液制备
将益智干制品原料（2 kg）研磨成碎片，用20 L 70%乙醇浸泡过夜。混合物超声处理三次（每次40分钟）。溶液在60°C下通过旋转蒸发仪浓缩。乙醇蒸发后，溶液冷冻干燥获得益智提取物。为进行定性和定量分析，我们将益智提取物溶于乙醇（10 mg/mL），超声处理30分钟，然后进行HPLC分析和LC-MS分析。
在LC-MS分析中，通过比较益智提取物QDa正负扫描的ESI-MS数据（补充图1）和已报道的益智中潜在神经生物活性成分的ESI-MS数据（Zhang Q.等，2018），我们推测益智提取物中含有14种化合物，并收集了这些纯度>98%的化合物，以进一步验证益智提取物中的成分。每种化合物的储备液通过将0.2 mg溶解于2 mL乙醇中，超声处理30分钟制得。取100 µL储备液混合得到混合标准品溶液。通过HPLC和LC-MS实验，在益智提取物中鉴定出10种化合物，包括5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、儿茶素、原儿茶醛、(-)-表儿茶素、P-CA、山柰酚、白杨素、诺卡酮和异黄木犀草素。在确定P-CA为最有效化合物后，我们制备了测试溶液，即将50 mg P-CA溶解于50 mL 0.1%磷酸水溶液和甲醇（70:30）中，超声处理30分钟。
质量控制分析
我们对益智提取物进行了质量控制研究，并使用HPLC对益智溶液的化学特征进行了表征。色谱分离在配备岛津C18色谱柱（4.6 × 250 mm，5 µm）的安捷伦1100系列HPLC系统上进行。研究中使用的色谱参数如下：流动相A（乙腈）和流动相B（0.1%三氟乙酸水溶液），流速1 mL/min，柱温30°C，检测波长220 nm。梯度程序为0至60分钟，流动相A的梯度百分比从5%增加至100%。LC-MS使用配备CORTECS C18色谱柱（4.6 × 50 mm，2.7 µm）的Waters LC/MS ACQUITY QDA进行操作。LC-MS在电离方法-ESI（+/-）条件下测量，扫描范围为100至1,000。使用的色谱参数如下：流动相A（0.1%甲酸水溶液）和流动相B（0.1%甲酸乙腈溶液），流速0.5 mL/min，柱温30°C，检测波长220和254 nm。梯度程序为流动相B在6分钟内从5%增加至95%，并保持95% 3分钟。
定量分析
我们选择P-CA作为益智提取物定量控制的标志化合物。使用岛津LC-2030c HPLC系统和Waters symmetry C18色谱柱（4.6 × 150 mm，5 µm），在309 nm波长下测定P-CA。色谱分析在以下参数下进行：流速1 mL/min，进样量10 µL，柱温35°C，检测波长309 nm，流动相A（0.1%磷酸水溶液）和流动相B（甲醇），持续运行60分钟。在定量实验中，检测了线性、精密度、准确度、灵敏度、重复性和稳定性。在本条件下，根据信噪比约为3和10，分别确定检测限（LODs）和定量限（LOQs）。
为获得校准曲线，在HPLC中分析了10个浓度的P-CA。为确保测量结果的精密度，测试溶液以六份平行制备。一份测试溶液连续注射六次，以检查HPLC系统的重复性。准确度通过回收率试验评估。在验证研究中，将等量的混合样品溶液和加标参照物质溶液混合，并分配成六份溶液进行回收率测试。通过比较实际值与理论值来计算回收率。通过测试测试溶液和参照溶液在室温下放置0、2、4、6、8、12和18小时后主峰面积的变化，来测量测试溶液和参照溶液在储存期间的稳定性。
益智提取物和P-CA研究的动物及实验组
雄性Sprague-Dawley（S.D.）大鼠（12周龄，体重260-290 g）购自香港大学实验动物中心。所有动物均饲养在动物房内，提供自来水和标准饲料，环境稳定（温度25°C ± 2°C，湿度40%，12/12小时昼夜循环）。所有动物实验程序和护理均经大学教学与研究用活体动物使用委员会批准（CULATR编号4664-18）。大鼠在手术前随机分为三组：假手术组、大脑中动脉闭塞（MCAO）模型组和MCAO加益智治疗组。对于P-CA研究，设计了三个浓度的P-CA（低浓度50 mg/kg，中浓度100 mg/kg，高浓度200 mg/kg治疗组）。
手术方案
对Sprague-Dawley大鼠进行MCAO手术，以诱导脑缺血动物模型。大鼠用4%异氟烷麻醉，并维持2%异氟烷麻醉状态。然后将大鼠置于保暖垫上以保持体温。用剃须膏剃除颈部毛发，并用碘和70%乙醇对颈部皮肤消毒三次。在手术显微镜下，做颈部中线切口，切开浅筋膜。在浅筋膜下，小心进行钝性剥离，以暴露颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），注意不要损伤迷走神经。用6-0尼龙缝线结扎CCA和ECA。切断ECA，并用针头钝化。将一根覆盖硅胶的0.36 mm尼龙缝线小心插入并推入ICA，直至到达左侧大脑中动脉处，感觉到轻微阻力。用6-0尼龙缝线小心结扎ICA和ECA。用3-0尼龙缝线关闭切口。用6-0聚丙交酯缝线缝合肌肉层，用3-0尼龙缝线缝合切口层。MCAO缺血2小时后，移除腔内缝线以诱导再灌注。大鼠保持温暖直至从麻醉中恢复。之后，我们监测大鼠的健康状况，大鼠可自由获取水和食物。
药物制备与给药
体内动物实验方案如图1所示。益智提取物溶于含5%乙醇和5%聚乙二醇400（PEG 400）的水溶液中。在益智治疗组中，于再灌注开始时，以6.3 g/kg的剂量（相当于人类受试者的每日原生草药材料剂量）口服给予大鼠益智提取物。连续13天给予大鼠益智提取物。在P-CA治疗组中，不同剂量（50、100和200 mg/kg，溶于生理盐水）的P-CA连续13天灌胃给予大鼠。假手术组和MCAO模型组灌胃给予1 mL溶剂溶液。手术后每天记录体重。在脑缺血后第14天收集脑样本，用于免疫荧光染色研究和蛋白质印迹分析。
体内BrdU掺入
根据先前描述的方法（Wojtowicz和Kee，2006），连续7天以50 mg/kg的剂量腹腔注射BrdU给大鼠。
图1 | 大脑中动脉闭塞（MCAO）脑缺血-再灌注实验方案示意图。雄性Sprague-Dawley（S.D.）大鼠接受2小时MCAO脑缺血处理，随后进行14天的再灌注。在2小时MCAO脑缺血后开始再灌注时，给大鼠口服AOM提取物（6.3 g/kg，溶于5%乙醇和5%聚乙二醇400）、P-CA（50、100、200 mg/kg，溶于生理盐水）和赋形剂溶液，并每日给药直至再灌注第13天。所有动物连续7天腹腔注射BrdU（50 mg/kg）。行为学测试于第9天至第14天进行。
神经功能严重程度评分行为测试
神经功能缺损通过改良神经功能严重程度评分（mNSS）进行评估。mNSS评分反映了与运动（肌肉状态、异常运动）、感觉系统（视觉、触觉和本体感觉）以及反射和平衡能力相关的神经功能。根据先前报告（Chen等，2001），我们采用了mNSS评分标准，评分范围从0到18（0表示正常，18表示功能最大损伤）。
Morris水迷宫测试
对假手术对照组、MCAO赋形剂组、MCAO加AOM治疗组和MCAO加P-CA治疗组进行Morris水迷宫测试，以评估其认知功能。手术第九天开始隐藏平台训练。在4天的训练中，每只大鼠每天被允许在水箱中寻找平台两次，每次60秒。在整个治疗期的第13天进行探测试验，测试记录时限为70秒（Su等，2017）。记录到达平台的潜伏期时间、距离以及探测尾测试中目标区域的游泳时间，以测试空间学习和记忆功能。
旷场测试
第13天使用80 × 80 × 50厘米的丙烯酸黑盒进行旷场测试。将正方形分为中心和外缘。在起点处，将大鼠放入旷场的中心方格内。每次10分钟的试验由头顶摄像机录像。通过头顶视频记录并使用Smart 3.0系统（RWD，美国特拉华州）分析在整个场地中的距离、时间、中心停留时间及总距离。
新物体识别测试
手术第13天后进行新物体识别习惯化测试。将大鼠放入80 × 80 × 50厘米的丙烯酸黑盒中10分钟。在测试中，首先将大鼠置于开放盒子的样本阶段，允许其探索两个相同的物体，然后返回笼子。60分钟后，在测试阶段，将大鼠放回盒子，此时它们会接触到两个不同的物体：一个是之前遇到过的物体，另一个是对大鼠来说的新物体。总探索时间为20秒（Lueptow，2017）。检查测试阶段对新物体的探索时间。
细胞培养
小鼠多能干神经祖细胞或小脑干样C17.2细胞原产于ECACC。细胞在高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，Gibco）中维持培养，使用75平方厘米透气培养瓶，培养基中添加10%热灭活胎牛血清（Gibco）、1%青霉素/链霉素（Gibco）和1% 2 mM L-谷氨酰胺（Gibco）。C17.2细胞在37°C、5% CO2/95%空气的湿润培养箱中培养。
氧-葡萄糖剥夺加复氧模型和药物治疗
为了模拟体外的缺血/再灌注条件，将C17.2细胞暴露于氧-葡萄糖剥夺加复氧（OGD/R）条件。为诱导OGD，这些细胞在无糖DMEM（Gibco）中培养，并在37°C CO2培养箱（Eppendorf New Brunswick Galaxy 48R）中孵育，氧气控制为0.1% O2和5% CO2/94.9% N2。实时条件由培养箱读数监测。C17.2细胞暴露于OGD 4小时，随后用高糖DMEM替换并进行20小时复氧，返回37°C、5% CO2/95%空气的湿润培养箱。OGD后，用相应化合物处理并孵育C17.2细胞20小时。
为了鉴定AOM提取物中促进神经发生的生物活性化合物，我们研究了10种已鉴定化合物在OGD和复氧条件下诱导BDNF/TrkB/AKT表达和促进C17.2细胞增殖的作用。这些化合物包括5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、儿茶素、原儿茶醛、(-)-表儿茶素、P-CA、山奈酚、白杨素、诺卡酮和柚皮素，它们溶于二甲基亚砜中，获得100 mM储备液，然后加入细胞中，使最终浓度为1、10和100 µM。将细胞接种在24孔板（含多聚-D-赖氨酸包被的盖玻片（Trevigen，美国马里兰州盖瑟斯堡））和普通96孔板、6孔板中，密度为2.5 × 10^4细胞/mL。将细胞分为对照组、OGD组和OGD加选定化合物（三个剂量）组。
体外BrdU标记
制备10 mM BrdU储备液，并用细胞培养基稀释成10 µM BrdU标记溶液。在无菌条件下，用0.2 µm滤器过滤BrdU标记溶液。复氧20小时后，将96孔板中的培养基更换为BrdU标记溶液，在37°C、5% CO2培养箱中孵育1小时。之后，移除BrdU标记溶液，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。
免疫荧光
对于体内动物实验，将后固定的脑组织在4°C的30%蔗糖溶液中完全脱水，包埋于O.C.T.中，并切成30 µm厚的切片。用柠檬酸钠缓冲液检索冷冻切片。对于体外细胞实验，BrdU标记1小时后，用4%多聚甲醛固定细胞15分钟。将检索的切片和细胞在室温下用2 M HCl孵育1小时，然后用1% PBST（PBS + 1% Triton）洗涤三次，每次15分钟。之后，用5%山羊血清（GS）在3h PBST（PBS + 3h Triton）中封闭细胞1小时。用一抗（包括BrdU（大鼠，1:400）、Ki67（兔，1:400）、DCX（兔，1:400）和NeuN（兔，1:400））染色切片过夜。C17.2细胞用一抗BrdU（大鼠，1:400）、Ki67（兔，1:400）和SOX2（兔，1:400）共染。4°C过夜孵育一抗后，用3h PBST洗涤样品三次，每次15分钟。所有切片用抗大鼠488（1:800）和抗兔568（1:800）染色2小时，并在室温下用DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）复染细胞核15分钟。脑切片和细胞样品用荧光封片剂（Dako Agilent，美国加利福尼亚州圣克拉拉）封片，而用于高内涵筛选（HCS）实验的细胞保存在PBS中。使用Carl Zeiss LSM 800共聚焦激光扫描显微镜捕获免疫荧光图像，并使用ZEN离线软件进行分析。HCS实验使用GE Healthcare Life Sciences IN Cell Analyzer 6500HS进行，并使用IN Carta离线软件进行分析。
Western Blot分析
用含1%蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（CST）的放射免疫沉淀测定缓冲液提取蛋白质。用BCA蛋白质测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国）检测蛋白质浓度。通过11%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳分离蛋白质裂解物，转移到聚偏二氟乙烯膜上，并用一抗进行免疫印迹，包括BDNF（Abcam，小鼠，1:1000）、TrkB（Santa Cruz，小鼠，1:100）、AKT（CST，兔，1:1000）、p-AKT（CST，兔，1:1000）、β-肌动蛋白（CST，小鼠，1:5000）和GAPDH（CST，兔，1:5000）。随后孵育辣根过氧化物酶偶联的二抗（1:2000）。使用化学发光ECL Select试剂盒（GE Healthcare，美国伊利诺伊州芝加哥）检测信号，用Gel-Doc系统（Bio-Rad，美国加利福尼亚州赫克勒斯）捕获图像，并用Image Lab软件（Bio-Rad，美国加利福尼亚州赫克勒斯）进行分析。
统计分析
使用Prism 8（GraphPad Software，美国）进行数据分析。所有数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。对于设计的两组实验，使用学生t检验；对于多组比较，使用双因素方差分析，并在适当时使用Tukey多重比较检验来确定两组之间的差异。统计显著性定义为p < 0.05。
结果
AOM提取物质量控制研究
我们首先进行了质量控制研究，采用高效液相色谱法（HPLC）鉴定AOM提取物的化学成分。我们优化了色谱条件，并获得了分离良好的色谱图（图2）。我们比较了AOM提取物和混合标准品的保留时间。这些化合物的结构和保留时间总结在表1中。结合液相色谱-质谱（LC-MS）的结果（图3和补充表1），我们在AOM提取物中确认了10种化合物，包括5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、儿茶素、原儿茶醛、(-)-表儿茶素、P-CA（假设为某特定化合物，原文未给出全称）、山奈酚、白杨素、诺卡酮和柚皮素。这些已鉴定的化合物可分为五类黄酮、三类酚酸、一类愈创木烷类化合物和一种其他化合物。
随后，我们建立了一种HPLC方法，用于定量分析AOM提取物中的标志化合物P-CA。我们考察了该方法在P-CA检测中的线性、重复性、精密度、准确度和稳定性。标准曲线为y=7.5275×10⁷x-1.5917×10⁴，相关系数（r）为0.9998。检测限（LODs）和定量限（LOQs）分别为0.003163 µg/mL和0.01265 µg/mL。测试溶液的相对标准偏差（RSD）在重复性实验中为3.41%，在精密度实验中为1.75%。准确度通过总回收率评估，范围为90%至108%，RSD为0.39%。测试溶液在18小时内的稳定性实验的RSD为4.15%，日间精密度和日内精密度的RSD分别为2.48%和2.06%。这些结果表明，该HPLC方法具有高度的灵敏度和可靠性，并确定AOM提取物中P-CA的浓度为4.6 µg/g。
AOM治疗增加体重并改善MCAO后缺血大鼠的空间学习和记忆能力
我们研究了AOM对瞬时脑缺血大鼠模型中体重、神经功能缺损、空间学习及记忆的影响。大鼠经历2小时大脑中动脉闭塞（MCAO）脑缺血后，再灌注14天。手术后，给大鼠连续13天口服AOM（6.3 g/kg/天）。如图4A所示，手术后，MCAO对照组大鼠的体重随时间依赖性下降。AOM治疗组大鼠的体重显著高于MCAO对照组。同时，我们评估了神经功能障碍评分。MCAO对照组的神经功能缺损评分显著高于假手术对照组。AOM治疗组有降低神经功能严重程度的趋势，但与MCAO对照组相比无统计学差异（图4B）。我们进一步通过Morris水迷宫和新物体识别测试评估了空间学习以及长期和短期记忆功能。在Morris水迷宫测试中，经过4天的训练后，我们通过记录到达平台的时间、目标象限的距离和到达平台的潜伏期来测试空间学习和长期记忆功能。第4天时，AOM治疗组到达隐藏平台的时间少于MCAO对照组（图4C）。在探测试验中，AOM治疗组在目标区域的游泳路线显著长于MCAO对照组（图4D）。统计分析显示，AOM治疗组大鼠在目标象限的距离、到达平台的潜伏期和适应期的总距离等参数均有显著改善。AOM治疗组大鼠在目标区域的距离和时间更长，到达平台区域的时间更短（图4E）。我们还使用旷场试验测量焦虑（图4F，G）和新物体识别测试检测短期记忆（图4H）。在旷场试验中，AOM治疗增加了中心区域的距离、时间和进入中心的次数，提示具有抗焦虑作用。然而，各组之间的运动活性无显著差异，整个区域的总距离相似。在新物体识别测试中，AOM治疗组对熟悉物体的记忆更好，对探索新物体表现出更多兴趣，优于MCAO对照组。这些结果表明，AOM可以改善缺血性脑卒中后大鼠的生活质量，促进空间学习/记忆和识别能力，并减轻焦虑。
图2 | 混合化学标准品（A）和AOM提取物（B）的高效液相色谱图。高效液相色谱检测参数：岛津C18色谱柱（4.6 × 250 mm，5 µm）；流动相：乙腈（ACN）-0.1%三氟乙酸-水，60分钟内梯度洗脱从5%至100%。柱温：30℃；流速：1.0 mL/min；紫外检测波长：220 nm。
AOM通过诱导BDNF途径促进大鼠MCAO后缺血状态下的成年海马神经发生
我们随后通过免疫荧光和蛋白质印迹分析，研究了AOM对MCAO后缺血大鼠海马中细胞增殖和分化的神经发生作用。Ki67是标记增殖阶段细胞的生物标志物，而BrdU是胸腺嘧啶的类似物，用于标记新生细胞。我们采用BrdU/Ki67双重免疫荧光染色来检测处于增殖阶段的新生细胞，并使用DAPI进行细胞核鉴定。此外，我们还通过免疫荧光实验，分别使用DCX和NeuN来识别新生未成熟神经元和新生成熟神经元。我们调查了缺血后脑区中BrdU/DCX和BrdU/NeuN的双重免疫染色成像。结果显示，AOM提取物显著增加了MCAO大鼠齿状回（DG）和室管膜下区（SVZ）中BrdU/Ki67、BrdU/DCX和BrdU/NeuN双重阳性染色细胞的数量。这些结果表明，AOM可以促进MCAO后缺血大鼠海马、SVZ和纹状体的神经发生（见补充图2-5）。
神经营养因子BDNF是改善学习和记忆功能过程中海马神经发生的关键细胞信号调节因子（Egan等，2003）。功能性TrkB信号传导在成年海马神经干细胞（NSCs）的增殖以及新生神经元的存活和功能整合中起着关键作用（Bergami等，2008；Li等，2008）。因此，我们检测了AOM是否能调节BDNF/TrkB/AKT信号传导，以改善海马区域的神经发生（图5）。在海马区域，假手术对照组与MCAO溶剂对照组之间BDNF和p-AKT的表达没有统计学差异。而AOM治疗组海马区域中BDNF、TrkB和p-AKT的表达水平显著高于MCAO溶剂对照组。这些结果表明，AOM可以激活BDNF/TrkB/AKT信号通路，并促进MCAO后缺血大鼠的成年海马神经发生。
表1 | AOM提取物中鉴定出的代表性化合物
对香豆酸作为BDNF诱导剂促进神经干细胞中的神经发生
随后，我们从AOM中筛选出了具有诱导BDNF信号传导和促进经4小时氧糖剥夺（OGD）加20小时再氧合处理的C17.2细胞神经发生活性的化合物。表1列出了从AOM中鉴定出的10种化合物。我们用这些化合物以1、10和100 µM的浓度处理细胞。BrdU和Ki67是常用于分析神经干细胞（NSCs）增殖活性的生物标志物（Tanaka等，2011）。利用高内涵筛选（HCS）技术，我们检测了细胞中BrdU/Ki67双重阳性染色的比例，以鉴定其促进增殖的作用。结果发现，化合物6（对香豆酸，P-CA）是增加BrdU/Ki67双重阳性细胞最有效的成分（图6A）。同时，P-CA处理显著上调了细胞中BDNF、TrkB和p-AKT的表达（图6B）。ANA12（20 µM，一种BDNF/TrkB特异性抑制剂）与P-CA（100 µM）共处理消除了P-CA对BDNF和TrKB表达诱导的作用（图6C），并降低了C17.2细胞中BrdU/Ki67双重阳性染色的比例（图6D）。此外，我们还进行了BrdU/SOX2共染的免疫荧光研究，其中SOX2是胚胎干细胞的关键标志物。P-CA处理显著增加了BrdU/SOX2阳性细胞的比例，而ANA12的共处理则消除了这一作用（图6E、F）。这些结果表明，P-CA可通过诱导BDNF/TrkB/AKT信号通路增加NSCs的存活并刺激其增殖。
对香豆酸治疗增加体重、改善神经功能缺损评分、促进空间学习和记忆并减轻MCAO后缺血大鼠的焦虑
接下来，我们研究了P-CA对MCAO后缺血大鼠体重、改良神经功能缺损评分（mNSS）、空间学习和记忆的影响。在P-CA治疗组中，以50、100和200 mg/kg的剂量在MCAO缺血再灌注开始时给大鼠灌胃，并连续使用13天。假手术组和MCAO溶剂组使用溶剂溶液。P-CA治疗增加了体重，但对神经功能缺损评分无统计学上的显著影响（图7A、B）。我们还进行了Morris水迷宫实验以评估空间学习和长期记忆功能（图8A-E），开放场实验以测量焦虑（图8F-I），以及新物体识别实验以检测短期记忆（图8J）。在Morris水迷宫实验中，P-CA治疗显著增加了探针试验中目标象限的距离和时间，并缩短了到达平台的潜伏期，表明空间学习和长期记忆功能得到改善。在开放场实验中，P-CA治疗增加了中心区域的距离和时间以及进入中心区域的次数，表明具有减轻焦虑的作用。在新物体识别实验中，P-CA治疗增加了测试阶段对新物体的探索时间，表明短期记忆得到改善。这些结果表明，P-CA可促进缺血性脑卒中后大鼠的空间学习，提高短期和长期记忆能力，并减轻焦虑。
对香豆酸治疗通过诱导BDNF信号通路促进MCAO后缺血大鼠脑中的成年海马神经发生
随后，我们研究了P-CA对MCAO后缺血大鼠海马神经发生的促进作用。我们检测了海马齿状回（DG）、室管膜下区（SVZ）和纹状体区域中用于细胞增殖的BrdU/Ki67双重阳性染色，其中使用DAPI进行细胞核鉴定（图9A-D）。P-CA治疗显著增加了缺血后脑区海马DG、SVZ和纹状体区域中BrdU/Ki67阳性细胞的比例。此外，我们还分别用BrdU/DCX（图10A-D）和BrdU/NeuN（图11A-D）检测了新生未成熟神经元和新生成熟神经元。不出所料，P-CA治疗促进了缺血后海马和纹状体中新生未成熟和成熟神经元的产生。我们还对DG和SVZ中BrdU/Ki67、BrdU/DCX和BrdU/NeuN的双重染色进行了XYZ平面的成像分析。P-CA治疗增加了DG和SVZ中BrdU/Ki67、BrdU/DCX和BrdU/NeuN双重阳性染色的比例（补充图6）。这些结果表明，P-CA可促进脑卒中后治疗中的NSC分化以进行神经发生。
我们进一步研究了P-CA对海马区域中BDNF/TrkB/AKT信号表达的影响，以改善神经发生（图12）。假手术对照组和MCAO溶剂组之间海马区域中BDNF、TrkB和p-AKT的表达无显著差异。然而，P-CA治疗显著上调了海马区域中BDNF、TrkB和p-AKT的表达。这些结果表明，P-CA可激活BDNF/TrkB/AKT信号通路，并促进MCAO后缺血大鼠的成年海马神经发生。
图3 | AOM提取物的ESI-MS色谱图。液相色谱-质谱（LC-MS）实验在配备CORTECS C18色谱柱（2.7 µm，4.6 × 50 mm）的Waters LC/MS ACQUITY QDA仪器上进行，电离方式采用ESI（+/−），扫描范围设定为100至1,000。图中展示了5-羟甲基糠醛（A）、原儿茶酸（B）、儿茶素（C）、(−)-表儿茶素（D）、原儿茶醛（E）、对香豆酸（F）、山奈酚（G）、白杨素（H）、诺卡酮（I）、柚皮素（J）及其标准品的ESI-MS色谱图。
图4 | AOM增加瞬时大脑中动脉闭塞（MCAO）大鼠的体重并改善其空间学习和记忆能力。Sprague-Dawley（S.D.）大鼠被分为假手术对照组（Sham）、MCAO脑缺血-再灌注载体组（MCAO/R）和MCAO/R加AOM治疗组（AOM）。大鼠经受2小时的MCAO脑缺血和14天的再灌注。在2小时的MCAO脑缺血后，于再灌注开始时给予大鼠AOM提取物（6.3 g/kg，溶于5%乙醇和5%PEG400）或载体溶液，并每日给药，持续13天的再灌注期。（A）假手术对照组、MCAO/R组和AOM组的体重变化；（B）假手术对照组、MCAO/R组和AOM组的改良神经功能缺损评分（mNSS）。每2天评估一次mNSS。（C-E）Morris水迷宫测试用于评估瞬时MCAO大鼠的空间学习和长期记忆能力：（C）隐藏平台测试中4天的逃避潜伏期。（D）探测试验中的游泳路线。（E）探测试验中目标象限的距离和时间以及到达平台区域前的潜伏期。（F，G）旷场试验用于测量瞬时MCAO大鼠的焦虑情况。记录了假手术对照组、MCAO/R组和AOM治疗组在中心区域的距离、时间和进入次数。AOM治疗减轻了焦虑（F），但对适应期内的总移动距离无影响（G）。（H）新物体识别测试用于评估短期记忆：AOM增加了MCAO大鼠在测试阶段对新物体的探索时间。数据以均值±标准误（SEM）表示（n = 12-14）；与假手术组比较，@p < 0.05，@@p < 0.01，@@@p < 0.001，@@@@p < 0.0001；与MCAO/R组比较，p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001。
图5 | 益智仁（Alpinia oxyphylla Miq.）上调瞬时大脑中动脉闭塞（MCAO）脑缺血大鼠海马中脑源性神经营养因子（BDNF）、酪氨酸激酶受体B（TrkB）和磷酸化AKT的表达。Sprague-Dawley（S.D.）大鼠被分为假手术组、MCAO/R组和AOM组。大鼠经受2小时的MCAO脑缺血和14天的再灌注。在2小时的MCAO脑缺血后，于再灌注开始时给予大鼠AOM提取物（6.3 g/kg，溶于5%乙醇和5%PEG400）或载体溶液，并每日给药，持续13天的再灌注期。（A）BDNF、TrkB和磷酸化AKT表达的代表性免疫印迹结果。（B）假手术组、MCAO/R组和AOM组中BDNF相对表达水平的统计分析。（C）假手术组、MCAO/R组和AOM组中TrkB相对表达水平的统计分析。（D）假手术组、MCAO/R组和AOM组中磷酸化AKT相对表达水平的统计分析。数据以均值±标准误（SEM）表示（n = 6-8）；与MCAO/R组比较，p < 0.05，**p < 0.001。
图6 | 鉴定对羟基肉桂酸（P-CA）为益智仁（AOM）中的一种活性化合物，其具有诱导脑源性神经营养因子（BDNF）/酪氨酸激酶受体B（TrkB）/AKT信号传导并促进体外培养的小鼠小脑干细胞样C17.2细胞神经干细胞（NSC）增殖的特性。为了模拟体外的脑缺血-再灌注损伤，C17.2细胞经受4小时的氧葡萄糖剥夺加20小时的再氧化（OGD/R）。通过使用高内涵筛选（HCS）技术，我们检查了AOM中的10种活性化合物（1、10和100 µM）在OGD/R暴露下对C17.2细胞中BrdU/Ki67双阳性染色细胞比率和BDNF/TrkB/AKT信号传导的影响。（A）10种化合物（1、10和100 µM）对HCS技术检测的BrdU和Ki67双阳性染色细胞比率（%）的影响。10种化合物分别为：1. 5-羟甲基糠醛；2. 原儿茶酸；3. 儿茶素；4. (-)-表儿茶素；5. 原儿茶醛；6. 对香豆酸；7. 山奈酚；8. 白杨素；9. 诺卡酮；10. 苔色菌素。这些化合物（1、10和100 µM）对HCS技术计数的BrdU/Ki67双阳性染色细胞比率的影响（右侧）。BrdU和Ki67的双阳性染色表明具有促进NSC增殖的活性。P-CA被发现是诱导NSC增殖最有效的化合物。（B）Western blot分析显示P-CA（1、10和100 µM）对BDNF、TrkB和p-Akt表达的影响。P-CA以剂量依赖性方式上调BDNF、TrkB和p-Akt的表达。（C）TrkB抑制剂ANA12（20 µM）消除了P-CA（100 µM）对BDNF和TrkB表达的影响。（D）HCS技术检测的P-CA（100 µM）对BrdU和Ki67双阳性染色细胞比率（%）的影响。ANA12（20 µM）消除了P-CA（100 µM）对BrdU/Ki67双阳性染色细胞的影响。（E）BrdU（绿色）和SOX2（红色）与细胞核（蓝色）的代表性免疫荧光染色。（F）C17.2中BrdU（绿色）和SOX2（红色）阳性染色细胞与细胞核（蓝色）共定位的代表性免疫荧光成像。ANA12（20 µM）消除了P-CA（100 µM）对BrdU/SOX2双阳性染色细胞的影响。数据以均值±标准差（SD）表示（n = 3）；与对照组比较，@p < 0.05，@@@p < 0.001，@@@@p < 0.0001；与OGD/R组比较，p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001；与P-CA组比较，#p < 0.05。
图7 | 对羟基肉桂酸（P-CA）治疗增加了大脑中动脉闭塞（MCAO）大鼠的体重，改善了其空间学习和记忆能力，并减轻了焦虑。Sprague-Dawley（S.D.）大鼠被分为假手术对照组（Sham）、MCAO脑缺血-再灌注载体组（MCAO/R）以及MCAO/R加P-CA治疗组（P-CA低剂量50 mg/kg、P-CA中剂量100 mg/kg、P-CA高剂量200 mg/kg）。大鼠经受2小时的MCAO脑缺血加14天的再灌注。在随后的13天里，对大鼠灌胃给予P-CA 50、100和200 mg/kg，而假手术组和MCAO载体组则使用载体溶液。（A）体重变化：P-CA增加了MCAO后缺血大鼠的体重。（B）在MCAO手术后的第2天、第7天和第14天评估神经功能缺损评分（mNSS）。与MCAO/R组相比，P-CA组在统计学上对mNSS无显著影响。数据以均值±标准误（SEM）表示（n = 10）；与假手术对照组比较，@@p < 0.001，@@@@p < 0.0001；与MCAO/R组比较，p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.0001。
讨论
益智仁（Alpinia oxyphylla Miq.）在中医临床实践中被用作改善认知功能的药用植物，但其使用的科学证据尚不足。在本研究中，我们证明益智仁提取物（AOM）可通过诱导脑源性神经营养因子（BDNF）/酪氨酸激酶受体B（TrkB）/蛋白激酶B（AKT）信号通路，增强成年大鼠海马神经发生，并改善缺血性脑卒中后的认知障碍。此外，我们确定对羟基肉桂酸（P-CA）是AOM中一种代表性的活性化合物，可激活BDNF/TrkB/AKT信号通路，并诱导成年海马神经发生，从而增强认知功能。据我们所知，这是首次报道AOM及其活性化合物P-CA可通过诱导缺血后大脑中的BDNF/TrkB/AKT信号通路，促进成年海马神经发生并改善认知障碍。
先前的研究已报道AOM在改善认知功能和抗抑郁方面的生物活性（Koo等，2004；Shi等，2014；Yan等，2016）。AOM在淀粉样β诱导的阿尔茨海默病（AD）小鼠模型中改善了小鼠皮层和海马的认知功能（Shi等，2014）。AOM通过激活TrkB介导的BDNF信号通路发挥抗抑郁样作用（Yan等，2016）。AOM还能改善学习障碍，并在小鼠颈总动脉（CCA）闭塞模型中保护CA1区海马神经元（Koo等，2004；Wang等，2018）。在此，我们验证了以下假设：AOM可通过诱导BDNF/TrkB/AKT信号通路，诱导成年海马神经发生，并改善脑卒中后的认知障碍。AOM治疗显著增加了体重，表明大鼠从手术损伤中恢复，且脑卒中后护理质量良好。然而，MCAO载体组与AOM治疗组之间的神经功能缺损评分（mNSS）无统计学差异。重要的是，Morris水迷宫和新物体识别测试显示，AOM治疗显著改善了学习和记忆功能受损的MCAO后缺血大鼠的空间学习/记忆能力，并增强了其认知功能。同时，AOM治疗增强了细胞增殖和神经元分化，这通过海马齿状回（DG）、脑室下区（SVZ）和纹状体中BrdU/Ki67、BrdU/DCX和BrdU/NeuN的双免疫荧光染色得到证实。这些结果表明，AOM可促进成年海马神经发生，改善空间学习/记忆障碍，并增强MCAO后缺血大鼠的认知功能。
BDNF是一种关键的神经营养因子，可介导海马神经发生，从而改善学习和记忆功能（Egan等，2003）。BDNF不仅促进神经发生，还在神经元的存活和维护中发挥关键作用（Wei等，2015）。在痴呆转基因模型中，BDNF在促进海马神经发生和挽救认知及运动功能障碍方面发挥着重要作用（Goldberg等，2015）。TrkB信号在神经干细胞（NSCs）的增殖以及新生神经元在成年海马中的存活和功能整合中起着关键作用（Bergami等，2008；Li等，2008）。在本研究中，我们发现AOM治疗显著上调了海马中BDNF、TrkB和p-AKT的表达，表明在MCAO后缺血大鼠中诱导了BDNF信号通路以促进神经发生。
高内涵筛选（HCS）技术是一种先进且高效的药物发现分析方法，在干细胞生物学和基因组学研究中具有应用潜力（Fraietta和Gasparri，2016）。高效液相色谱（HPLC）与HCS技术相结合，为从药用植物产品中鉴定活性成分提供了有效平台。利用HCS技术，我们检测了从AOM提取物中鉴定的化合物对增殖的促进作用。我们统计了C17.2细胞中BrdU/Ki67双阳性细胞群的数量，发现P-CA是在细胞经4小时氧糖剥夺（OGD）加20小时复氧处理后，促进NSCs增殖效果最佳的化合物。SOX2是在发育中神经系统NSCs中表达的转录因子。SOX2是神经系统早期发育阶段包括干细胞在内的未分化前体细胞的特征和标志（Pevny和Nicolis，2010）。荧光成像研究显示，P-CA处理增加了OGD后C17.2细胞中BrdU/Ki67和BrdU/SOX2的双阳性染色。因此，P-CA可能是AOM中促进NSC增殖的代表性化合物。此外，P-CA治疗以剂量依赖性的方式上调了OGD处理的C17.2细胞中BDNF、TrkB和p-AKT的表达，其效应被BDNF/TrkB特异性抑制剂ANA12阻断。P-CA还提高了C17.2细胞的存活率。随后，我们进行了行为学研究，以评估P-CA对MCAO缺血大鼠神经功能缺损评分以及空间学习和记忆功能的影响。P-CA治疗改善了Morris水迷宫测试中的空间学习和长期记忆功能，减少了旷场测试中的焦虑行为，并提高了新物体识别测试中的短期记忆。接下来，我们试图确定P-CA诱导海马神经发生以改善认知功能的潜在机制。P-CA治疗显著增加了缺血后大脑中BrdU/DCX和BrdU/NeuN双阳性染色细胞群的数量，表明存在自发性的神经元分化。P-CA治疗还显著提高了海马DG、SVZ和纹状体区域中BrdU/Ki67、BrdU/DCX和BrdU/NeuN双阳性染色细胞的比例。这些数据表明，P-CA对细胞增殖和神经元分化具有促进作用。神经发生的促进有助于增强空间学习、提高短期和长期记忆，并减少缺血性脑卒中大鼠的焦虑行为。
对羟基肉桂酸，又称4-羟基肉桂酸，是一种酚酸。P-CA及其缀合物具有多种生物活性，包括抗氧化（Nasr等，2015）、抗炎（Pragasam等，2013）和抗癌（Shailasree等，2015）。先前的研究报道，P-CA可减轻氧化应激，减小梗死面积，并降低脑缺血-再灌注损伤中神经元的易损性（Guven等，2015；Sakamula和Thong-Asa，2018）。在本研究中，P-CA治疗上调了BDNF、TrkB受体和p-AKT的表达；促进了海马神经发生；增强了空间学习；提高了短期和长期记忆；并减轻了缺血性脑卒中大鼠的焦虑行为。此外，TrkB受体抑制剂ANA12的联合处理阻断了P-CA对NSCs增殖和BDNF/TrkB/AKT信号通路的作用。因此，我们得出结论，P-CA可能是AOM中发挥神经发生促进作用的代表性活性化合物，其机制是通过激活BDNF/TrkB/AKT信号通路。增强的海马神经发生随后改善了短暂性MCAO缺血大鼠的认知功能，并减轻了其焦虑行为。
然而，由于AOM中含有多种成分，我们在解释实验结果时应持谨慎态度。除P-CA外，不同成分的协同作用也可能对AOM的神经发生效应有所贡献，这有待进一步探索。此外，我们还进行了分子对接研究，以评估P-CA与BDNF的结合能力。结果显示，P-CA可直接与BDNF结合（补充图7），提示P-CA与BDNF之间可能存在直接的相互作用以激活BDNF。然而，P-CA的结合调控如何上调BDNF的表达并影响BDNF的功能，仍有待进一步阐明。值得注意的是，TrkB拮抗剂ANA12取消了P-CA对NSC增殖的作用，表明P-CA的神经发生效应应依赖于BDNF-TrkB。鉴于分子动力学和分子间结合亲和力的复杂生化和生物物理过程，进一步探索P-CA影响缺血后大脑中BDNF蛋白和神经发生的潜在机制具有重要价值。
图8 | P-CA治疗可增加大脑中动脉闭塞（MCAO）大鼠的体重，改善其空间学习和记忆能力，并减轻焦虑。Sprague-Dawley（S.D.）大鼠被分为假手术对照组（Sham）、MCAO脑缺血-再灌注载体组（MCAO/R）以及MCAO/R加P-CA治疗组（P-CA低剂量50 mg/kg、P-CA中剂量100 mg/kg、P-CA高剂量200 mg/kg）。大鼠经受2小时的MCAO脑缺血加上14天的再灌注。在随后的13天里，对大鼠进行P-CA 50、100和200 mg/kg的灌胃给药，而假手术组和MCAO载体组则使用载体溶液。（A-E）Morris水迷宫测试用于评估假手术对照组、MCAO/R组和P-CA治疗组的空间学习和长期记忆能力：结果显示，P-CA治疗能改善空间学习和长期记忆。（B）隐藏平台测试中4天的逃避潜伏期。（A）探测试验中的游泳路线。（C）探测尾测试中目标象限的距离和（D）时间，以及（E）到达平台区域前的潜伏期时间。（F-H）开放场测试用于评估假手术对照组、MCAO/R组和P-CA治疗组的焦虑情况：记录了中心区域的距离、时间和进入次数。P-CA治疗减轻了焦虑，但对适应期内的总移动距离无影响（I）。（J）新奇物体识别测试用于评估短期记忆：在MCAO大鼠的测试阶段，P-CA增加了对新奇物体的探索时间。数据以均值±标准误（n=10）表示；与假手术对照组比较，@p<0.01，@@p<0.001，@@@p<0.001，@@@@p<0.0001；与MCAO/R组比较，p<0.05，p<0.01，p<0.001。
图9 | P-CA促进瞬时大脑中动脉闭塞（MCAO）缺血大鼠海马、脑室下区（SVZ）和纹状体的增殖。Sprague-Dawley（S.D.）大鼠被分为假手术组、MCAO/R组和MCAO/R加P-CA治疗组（P-CA低剂量50 mg/kg、P-CA中剂量100 mg/kg、P-CA高剂量200 mg/kg）。大鼠经受2小时的MCAO脑缺血加上14天的再灌注。在随后的13天里，对大鼠进行P-CA 50、100和200 mg/kg的灌胃给药，而假手术组和MCAO载体组则使用载体溶液。（A）海马齿状回（DG）中BrdU（绿色）和Ki67（红色）阳性染色细胞与细胞核（蓝色）共定位的代表性免疫荧光图像。BrdU/Ki67双阳性染色表示新生成的且仍在增殖的细胞。（B）假手术组、MCAO/R组和P-CA组海马中BrdU+/Ki67+细胞数量的统计分析。（C）脑室下区和纹状体中BrdU（绿色）和Ki67（红色）阳性染色细胞与细胞核（蓝色）共定位的代表性免疫荧光图像。（D）假手术组、MCAO/R组和P-CA组纹状体和脑室下区中BrdU+/Ki67+细胞数量的统计分析。数据以均值±标准误表示（每组3-5只大鼠，每个脑区用于成像分析的组织切片3张）；与MCAO/R组比较，*p<0.001，**p<0.0001。
图10 | P-CA促进瞬时大脑中动脉闭塞（MCAO）缺血大鼠海马和纹状体中神经干细胞（NSC）向未成熟神经元的分化。Sprague-Dawley（S.D.）大鼠被分为假手术组、MCAO/R组和MCAO/R加P-CA治疗组（P-CA低剂量50 mg/kg、P-CA中剂量100 mg/kg、P-CA高剂量200 mg/kg）。大鼠经受2小时的MCAO脑缺血加上14天的再灌注。在随后的13天里，对大鼠进行P-CA 50、100和200 mg/kg的灌胃给药，而假手术组和MCAO载体组则使用载体溶液。（A）海马齿状回（DG）中BrdU（绿色）和DCX（红色）阳性染色细胞与细胞核（蓝色）共定位的代表性免疫荧光图像。DCX/BrdU双阳性染色表示新分化的未成熟神经元。（B）假手术组、MCAO/R组和P-CA组海马中BrdU+/DCX+细胞数量的统计分析。（C）脑室下区和纹状体中BrdU（绿色）和DCX（红色）阳性染色细胞与细胞核（蓝色）共定位的代表性免疫荧光图像。（D）假手术组、MCAO/R组和P-CA组纹状体中BrdU+/DCX+细胞数量的统计分析。数据以均值±标准误表示（每组3-5只大鼠，每个脑区用于成像分析的组织切片3-4张）；与假手术组比较，@p<0.05，@@@@p<0.0001；与MCAO/R组比较，p<0.05，**p<0.001，****p<0.0001。
图11 | P-CA促进瞬时大脑中动脉闭塞（MCAO）缺血大鼠海马和纹状体中细胞向成熟神经元的分化。Sprague-Dawley（S.D.）大鼠被分为假手术组、MCAO/R组和MCAO/R加P-CA治疗组（P-CA低剂量50 mg/kg、P-CA中剂量100 mg/kg、P-CA高剂量200 mg/kg）。大鼠经受2小时的MCAO脑缺血加上14天的再灌注。在随后的13天里，对大鼠进行P-CA 50、100和200 mg/kg的灌胃给药，而假手术组和MCAO载体组则使用载体溶液。（A）海马齿状回（DG）中BrdU（绿色）和NeuN（红色）阳性染色细胞与细胞核（蓝色）共定位的代表性免疫荧光图像。BrdU/NeuN双阳性染色表示新形成的成熟神经元（注：原文中的“DCX/BrdU”应为笔误，此处已更正为“BrdU/NeuN”）。（B）假手术组、MCAO/R组和P-CA组海马中BrdU+/NeuN+细胞数量的统计分析。（C）脑室下区和纹状体中BrdU（绿色）和NeuN（红色）阳性染色细胞与细胞核（蓝色）共定位的代表性免疫荧光图像。（D）假手术组、MCAO/R组和P-CA组纹状体中BrdU+/NeuN+细胞数量的统计分析。数据以均值±标准误表示（每组3-5只大鼠，每个脑区用于成像分析的组织切片3张）。与假手术对照组比较，@@p<0.01；与MCAO/R组比较，**p<0.01，****p<0.0001。
图12 | P-CA上调瞬时大脑中动脉闭塞（MCAO）脑缺血大鼠海马中TrkB和磷酸化AKT的表达。Sprague-Dawley（S.D.）大鼠被分为假手术对照组（Sham）、MCAO脑缺血-再灌注载体组（MCAO/R）以及MCAO/R加P-CA治疗组（P-CA低剂量50 mg/kg、P-CA中剂量100 mg/kg、P-CA高剂量200 mg/kg）。大鼠经受2小时的MCAO脑缺血加上14天的再灌注。在随后的13天里，对大鼠进行P-CA 50、100和200 mg/kg的灌胃给药，而假手术组和MCAO载体组则使用载体溶液。（A）脑源性神经营养因子（BDNF）、TrkB和磷酸化AKT表达的代表性免疫印迹结果。（B）假手术组、MCAO/R组和P-CA组（50、100、200 mg/kg）中BDNF相对表达水平的统计分析。（C）假手术组、MCAO/R组和P-CA组（50、100、200 mg/kg）中TrkB相对表达水平的统计分析。（D）假手术组、MCAO/R组和P-CA组（50、100、200 mg/kg）中磷酸化AKT相对表达水平的统计分析。数据以均值±标准误表示（n=6）；与MCAO/R组比较，*p<0.05。
结论
综上所述，益智仁（AOM）可能是一种有效的药用植物，能够促进成年海马神经发生并改善缺血性脑卒中后的认知障碍。其潜在机制可能与诱导脑源性神经营养因子（BDNF）/TrkB/AKT信号通路有关。p-香豆酸作为益智仁中的一种代表性活性成分，能够激活BDNF/TrkB/AKT信号通路，并介导成年海马神经发生，进而改善认知功能并减轻焦虑。
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