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摘要：在健康个体中，于富含碳水化合物的膳食中添加桑葚果提取物（MFE）可降低餐后血糖（PPG）和胰岛素（PPI）反应。本试点研究评估了低剂量MFE对2型糖尿病患者餐后急性效应的影响。本研究采用随机交叉（受试者内）设计，纳入了24名未用药的2型糖尿病成年男性和女性患者（平均年龄[标准差]为51.0[9.3]岁，体质指数[BMI]为27.5[3.9] kg/m²），受试者食用了添加有0（对照）、0.37和0.75克MFE的膳食，其中约含50克来自米饭的可利用碳水化合物。主要和次要结局指标分别为餐后2小时的血糖正增量曲线下面积（AUC）和相应的胰岛素正增量曲线下面积。结果以与对照膳食的均值差异及95%置信区间（CI）表示。与对照相比，添加0.37和0.75克MFE分别使平均餐后2小时血糖降低了8.2%（−20.8%至6.6%）和22.4%（−38.6%至−1.9%），并使胰岛素降低了9.6%（−20.7%至3.0%）和17.5%（−27.9%至−5.7%）。未出现不良事件或胃肠道不适的迹象。添加MFE还导致了血糖峰值和血糖波动的剂量相关性降低。在这些剂量水平下，MFE似乎可剂量依赖性地降低2型糖尿病患者的急性餐后血糖和胰岛素反应，并且可能是一种可行的饮食方法，有助于减轻血糖暴露。
引言
糖尿病管理的关键治疗目标是改善血糖控制，这不仅包括空腹血糖水平，还包括餐后血糖（PPG）反应[1,2]。通过减缓碳水化合物消化来针对PPG的药物已被证明对血糖控制有益，并且还能降低糖尿病前期个体发生糖尿病的风险[3–5]。糖尿病饮食指南建议通过控制含碳水化合物食物的量和质来帮助减少和管理PPG。另一种可能的饮食方法是使用能特异性减缓食物中血糖生成碳水化合物的消化速度，从而减缓血液中葡萄糖出现速率的食品成分[6]。桑葚产品含有糖苷酶抑制剂1-脱氧野尻霉素（DNJ）[7]。抑制α-葡萄糖苷酶可减缓膳食碳水化合物消化的最后一步，从而降低葡萄糖的吸收速度和在血液中的出现速度。一系列天然和合成的基于糖苷酶的分子显示出α-葡萄糖苷酶抑制作用，这是现有药物（如阿卡波糖和米格列醇）以及潜在的新型糖尿病管理药物的基础[8,9]。我们在一系列对照试验中证明，含有0.5% DNJ的特性明确的桑葚果提取物（MFE）可降低无糖尿病健康受试者试验餐后的PPG和餐后胰岛素（PPI）反应[10–13]。在这些试验中，添加至含有约50克来自米饭或小麦的可利用碳水化合物的膳食中，MFE在0.37至1.5克（~1.85至7.5毫克DNJ）的测试剂量范围内有效且耐受性良好。重要的是，我们还证实，在此剂量范围内，MFE可降低葡萄糖吸收的速度，但不减少吸收量，且没有碳水化合物吸收不良或不良胃肠道症状的迹象[10,11]。
相比之下，大多数研究测试桑葚产品对血糖控制的作用时，使用的是DNJ含量和提取物剂量高出2至10倍的桑葚叶提取物（MLE）[14,15]。这包括少数几项研究，这些研究提示桑葚产品（主要是MLE）在糖尿病前期或空腹血糖受损或葡萄糖耐量受损的个体中可能具有益处[16]。一些关于这些人群急性PPG反应的研究报告称，使用0.4至超过3克（其中报道的含有6至25毫克DNJ）的MLE剂量在降低PPG方面有一定疗效[17–21]，尽管有一项研究未发现这些剂量水平下有显著效果[22]。这些试验中大多数未发现不良反应，但Mudra等人（1克MLE，DNJ含量未说明）和Nakamura等人（3.3克MLE，25毫克DNJ）报告了呼吸氢显著增加[19,20]。
本研究旨在作为一项试点试验，评估特性明确的MFE低剂量对确诊为2型糖尿病且未服用降糖药物的个体急性PPG和PPI反应的影响。在我们之前的研究[10]中，将MFE的两个最低有效剂量水平（0.37和0.75克MFE，含~2–4毫克DNJ）添加至约50克来自白米饭的可利用碳水化合物中，并与仅含米饭（对照）进行比较。
2 材料和方法
2.1. 概述
这是一项随机、双盲、多中心、3期平衡顺序交叉（受试者内）试验，测试在2型糖尿病患者中，向煮熟的米饭中添加两种剂量的MFE与仅含米饭（对照）相比的效果。选择米饭作为测试食物，因为它是该人群中的主要碳水化合物主食，并且允许将结果与我们先前在无糖尿病受试者中使用添加MFE的米饭的研究结果直接进行比较[10]。预先注册的主要结局是MFE添加对静脉PPG的影响，以相对于对照的2小时正增量曲线下面积（+iAUC2hr）的百分比差异表示。次要结局是对PPI总曲线下面积（tAUC2hr）以及安全性和耐受性指标的相应影响。探索性结局包括3和4小时的PPG（+iAUC3hr和+iAUC4hr）和PPI（tAUC3hr，tAUC4hr）反应、峰值血糖水平（Cmax）、血糖波动（反应幅度，定义为餐后最大-最小浓度[Cmax–Cmin]）以及食用米饭餐食后4小时内平均尿糖水平的变化。
本研究未计划进行正式的统计假设检验（检验统计显著性），但可以根据报告的平均值和校正多重比较后的95%置信区间（CI）进行推断。由于无法获得必要信息（如目标研究人群中葡萄糖AUC的变异性），因此无法进行正式的功效（样本量）计算。对于典型的试点/探索性研究，基于可行性和更大样本量时精确度增益的递减，建议至少纳入12名受试者作为“经验法则”[23]。事先认为，相对于对照减少15%是期望的且具有生理学意义的目标效应量。这一基准大致对应于“低”（55）和“高”（70）血糖指数值之间15个单位的差异，这与健康人群以及糖尿病患者中的健康益处相关[24,25]。本研究计划纳入24名受试者，因为我们预计，与我们先前在无糖尿病个体中的研究相比，糖尿病患者中葡萄糖和胰岛素曲线的变异性更大。
本试验已在clinicaltrials.gov预先注册，注册号为NCT02256332。临床试验阶段于2015年2月16日至7月16日在印度的三个研究地点进行：位于塔恩乌尔哈斯纳加尔的阿西尔瓦德医院和研究中心（地点1）；班加罗尔的临床研究搜索中心（地点2）；以及孟买的治疗药物监测实验室（地点3）。印度艾哈迈达巴德的Lambda Therapeutics研究有限公司（LTRL）担任中心实验室和数据管理中心。赞助公司提供了研究材料，但在受试者接触、研究执行或结果测量和记录方面没有参与。
2.2. 伦理批准
本试验遵循《赫尔辛基宣言》进行，试验方案和知情同意书经阿西尔瓦德伦理委员会（地点1）于2014年11月6日、Medisys临床研究伦理审查委员会（地点2）于2015年1月17日、以及治疗药物监测实验室机构伦理委员会（地点3）于2015年3月23日批准，批准号为FDS-NAA-1633。
2.3. 受试者和治疗分配
受试者为未接受药物治疗的2型糖尿病成人，其他方面健康。完整的纳入和排除标准见补充材料，表S1。简而言之，符合条件的个体为年龄20–65岁的男性和女性，体质指数（BMI）18–35，患有2型糖尿病（糖化血红蛋白[HbA1c] ≥ 6.5%），仅通过饮食和运动控制，且在前三个月内未接受降糖药物治疗。
各研究地点的医师研究者根据医疗记录和研究的纳入/排除标准，初步邀请个体参与。在初次筛查访视时，向潜在受试者提供口头和书面解释，并给予其询问研究细节的机会。告知其有权随时退出研究，并在开始任何特定于试验的程序前签署书面知情同意书。所有解释和程序均以受试者的母语进行。同意参与研究的个体在研究地点接受进一步的筛查程序。这包括验证基本的个人和病史信息，并进行体格检查，包括人体测量、尿液药物筛查以及采集血样以分析HbA1c、血红蛋白、血脂和常规血液化学。然后根据筛查结果确定受试者是否符合进入研究的资格。
受试者在3周内的测试会话中均接受每种测试产品一次：对照（仅含米饭，无MFE）；米饭+0.37克MFE；以及米饭+0.75克MFE，采用平衡顺序设计。剂量水平的选择基于先前使用相同特定提取物的剂量-反应试验中的疗效。由于有3个治疗组（测试产品），因此有6种可能的治疗顺序。为了实现平衡顺序设计，使用计算机生成的随机分配（补充材料，图S1），将24名符合条件的个体中的相等数量分配到这六种可能的治疗顺序之一。任何在首次研究产品给药前退出的个体将被替换。任何在参与任何研究产品给药期后退出的个体将不被替换。随机化时间表由未参与研究的人员控制访问，并且对于可能对研究结果产生影响的任何人员（如临床实验室或其他受试者数据的记录，或不良事件的收集或评估）均不可用。治疗代码仅在完成盲态审查和数据库硬锁定后才被破解。
2.4. MFE的来源和特性
MFE（批号：MF-DC-KQ-111207，Draco Natural Products Inc.，美国加利福尼亚州圣何塞）按重量计含有0.5% DNJ（在0.37和0.75克MFE剂量水平中分别含~1.85和3.75毫克DNJ）。这是一种使用专有工艺生产的商用水性提取物，并按DNJ含量进行了标准化。这一特定批次的MFE的DNJ含量、体外生物活性（α-葡萄糖苷酶抑制）以及体内疗效均已得到确认和报道[10,13]。MFE被包装在预称重、单独编码的铝制小袋（Pharamivize，比利时Mariakerke）中，每个小袋含有0（对照）、0.37或0.75克MFE加甘露醇，使小袋内容物的总重量达到1克。
2.5. 测试餐
每份测试餐由一份煮熟的米饭组成，其中分别添加0克、0.37克或0.75克的多酚提取物（MFE）。一份米饭使用64克原生索纳·马鲁里（Sona Masuri）米制备，约含50克可利用碳水化合物，米的来源和制备方法如前文所述[12]。每份米饭均在电饭煲中用140毫升水煮熟。随后，将含有对照品或MFE的小包搅拌入每份准备好的米饭中。参与者和分发米饭的工作人员对MFE的存在或剂量均不知情，在此剂量下，MFE对感官属性的影响可忽略不计。
2.6. 测试日程序及数据收集
受试者参与三个测试日，每个测试日间隔5-7天。他们在测试日前一天晚上约18:00到达测试设施，并在食用测试餐后至少留在设施内4小时。要求受试者在测试餐开始前至少24小时内避免剧烈运动和饮酒，并至少禁食10小时。他们被提供相同、标准化的晚餐，且数量固定，除水外不允许食用任何其他食物或饮料，水可在测试餐前1小时内饮用。
在测试日，受试者于早晨立即食用准备好的测试餐，同时饮用350毫升水。第一口米饭咽下的时刻记为t=0（0小时，0分钟）。指示受试者在15分钟内食用完研究产品。若受试者未能在此时间内食用完毕，则在15分钟时采集血样，随后继续食用研究产品。受试者在采集最后一份血样并完成胃肠道不适问卷（t=4小时）前，不得食用任何其他食物，最多可额外饮用500毫升水。记录每位受试者首个测试日的实际饮水量，并在后续测试日允许相同饮水量。
为分析血浆葡萄糖和血清胰岛素，在测试餐开始前15分钟内，采集两份连续的基线血样，两份血样采集时间间隔最多5分钟。测试餐于t=0分钟开始时，随后在t=15、30、45、60、90、120、150、180、210和240分钟采集血样进行分析。通过置于前臂（肘前静脉）的留置套管上的阀门采集静脉血样（6毫升），通过注射0.5毫升生理盐水保持套管通畅。在每个时间点，首先将0.5毫升血液收集到2毫升注射器中并丢弃，以避免生理盐水污染。随后将血液收集到连接有鲁尔接头的真空采样管中，该接头与套管相连。若套管堵塞或难以通过套管抽血，则可直接通过套管将血液抽入10毫升注射器，或使用22号针头进行新的静脉穿刺采血。
受试者在食用测试餐前30分钟和食用后240分钟完成一份胃肠道不适问卷。问卷询问受试者是否出现胀气、恶心、腹胀或肠痛等症状，每种症状分别评为无、轻度、中度或重度。
为分析尿糖，在每次测试餐前约30-45分钟采集一份基线尿样。随后4小时内，受试者产生的尿液收集于容器中，并立即冷藏。最后一次尿样在测试餐开始后约4小时采集，此时其他程序已完成。
2.7. 血液和尿液样本处理及分析
分别从2毫升和4毫升血液中获取血浆（用于葡萄糖分析）和血清（用于胰岛素分析）的重复样本。血清样本在采集后60分钟内，血浆样本在采集后45分钟内，于18-25°C下以2500-3000转/分钟离心10分钟。在离心分离血清前，确保血凝块形成。样本在离心后15分钟内冷冻并存储于-22±5°C。测量每份基线尿样和食用测试产品后收集的合并尿样体积，并将每份样本的两份6毫升样本冷冻保存以供后续分析。所有样本的一套被冷冻运送至LTRL进行分析，另一套保留在每个研究现场，以防丢失或需要重新分析。
使用Vitros 5,1 FS化学系统分析仪（Ortho Clinical Diagnostics, Inc.；美国新泽西州Raritan）分析血浆和尿液中的葡萄糖。使用COBAS e411免疫分析分析仪（Roche；瑞士巴塞尔）通过电化学发光法测量胰岛素。
2.8. 不良事件记录
根据治疗需求和对日常活动干扰的程度，将不良事件定义为轻度、中度或重度。任何不良事件与研究餐食或程序的可能相关性被定义为无关、不太可能相关、可能相关、很可能相关或确定相关，判断依据包括时间关联性和其他解释的可能性。
2.9. 统计分析
统计分析按照预先规定的计划进行，未计划或执行任何中期分析。主要终点通过线性混合模型计算，使用Log(+iAUC0–120min)作为响应变量。模型始终包括基线、受试者基线、治疗和治疗顺序作为预测变量。基线指该次访问时该受试者的平均基线值；受试者基线指所有访问中的平均基线评分，纳入该变量以避免因使用混合模型和在每次访问时为受试者纳入不同基线值而导致的治疗效果估计偏差。假设模型的误差项呈正态分布。根据统计相关性，模型中还可纳入其他预测变量，如体重、性别和访问次数（识别测试日访问次数的分类变量）。将模型得出的治疗效果差异估计值（在对数尺度上获得）转换回百分比变化及其相关置信区间。
对于次要终点PPI tAUC2h以及餐后血糖（PPG）和餐后胰岛素（PPI）在3小时和4小时内的相应探索性结果，使用了类似的统计模型。对于这些PPG和PPI结果以及探索性终点Cmax，计算了每个MFE剂量相对于无MFE对照米饭的百分比变化。其他探索性终点，包括血糖波动（Cmax–Cmin）和餐前与餐后尿液中的葡萄糖浓度，针对每种治疗确定，并报告为每种MFE治疗相对于对照的绝对差异。
这是一项试点研究，未计划或未具备进行正式统计假设检验（确定p值）的效力。因此，相关结果以估计治疗效果的大小呈现：使用均值和95%置信区间（CI）作为其可靠性的衡量指标，并使用Dunnett校正进行与对照组的多重比较。若MFE治疗与对照组之间的差异95%CI不包括无效效应（零），则相当于p<0.05。
3 结果
3.1. 分析人群
受试者的基线特征见表1。在24名进入试验的个体中，22名完成了所有治疗。其中一名受试者未提供任何可用的与治疗相关的数据，另一名受试者在首次测试会话后退出了试验（见《临床试验报告统一标准》（CONSORT）受试者流程图，补充材料图S1）。在盲审过程中，观察到一名受试者在所有访视时的血浆和尿糖基线值均较高（分别超过10 mmol/L和250 ug/mL），另有一名受试者在一次访视时出现这种情况。这些高值归因于受试者未处于空腹状态，因此判断应将这些受试者/访视的血糖和胰岛素数据从统计分析中排除。使用了所有其他参与者和访视的可用数据，且在意向治疗分析（intention-to-treat）和符合方案集分析（per-protocol）之间未做区分。
表1. 受试者基线特征（N=24；男性11名，女性13名）。
3.2. 主要和次要结局指标
主要结局指标餐后血糖（PPG）+2小时增量曲线下面积（iAUC2hr）显示，随着桑葚果提取物（MFE）的添加，呈现剂量相关的降低（见表2）。0.75克剂量MFE的平均相对降低率为22.4%，这一结果稳健且超过了预先设定的目标效应量15%。餐后血糖总曲线下面积（tAUC2hr）也因MFE的添加而呈剂量相关性降低（见表3），0.75克剂量MFE的平均降低率为17.5%。
表2. 添加至米饭中的桑葚果提取物（MFE）后2小时内的血浆葡萄糖反应。
表3. 添加至米饭中的桑葚果提取物（MFE）后2小时内的血清胰岛素反应。
3.3. 探索性结局指标
餐后血糖（PPG）和餐后胰岛素（PPI）反应在完整4小时餐后期间的曲线见图S2和S3（补充材料）。当对3小时和4小时的总和进行计算时（+iAUC3hr和+iAUC4hr），桑葚果提取物（MFE）对PPG反应的影响有限，尽管较高剂量的MFE使其略有降低（补充材料，表S2和S3）。然而，较高剂量的MFE明显降低了3小时和4小时的PPI反应（tAUC3hr和tAUC4hr）（补充材料，表S4和S5）。
添加MFE后，最大血糖浓度（Cmax）呈现适度且与剂量相关的降低（补充材料，表S6），而血糖波动则表现出更一致的降低（补充材料，表S7）。食用测试餐后，汇总的尿糖水平变化很大，但平均而言，所有组的尿糖水平均从基线水平相似地升高（补充材料，表S8）。
4 讨论
在2型糖尿病患者中，将相对较低剂量的MFE添加到米饭中，导致急性PPG和PPI反应呈剂量相关性降低。这种效应在餐后即刻（2小时）期间最为明显，并伴随着餐后峰值血糖水平和血糖波动的明显降低。与0.37克剂量相比，0.75克剂量的效应更为一致和稳健，且在较高剂量下，PPI在整个4小时测量时间框架内也有所降低。
此处观察到的效应与我们之前对无糖尿病患者的研究结果一致，同样未出现任何不耐受或MFE其他不良效应的迹象。较高剂量MFE后PPG的平均降低幅度也超过了我们预先定义的“期望”目标降低幅度（≥15%）。尽管我们之前曾报道过，含有约1.85毫克脱氧野尻霉素（DNJ）的0.37克MFE剂量可产生类似的PPG和PPI降低效应，但该水平似乎接近疗效的下限[10]。因此，建议采用0.75克MFE的剂量，以确保在不同碳水化合物来源和人群中产生更可靠的效应[12]。
桑葚提取物中的DNJ具有众所周知的与α-葡萄糖苷酶抑制剂药物相似的主要作用机制，这些药物在治疗糖尿病和降低共病风险方面有效。此处达到的PPG基准15%的变化对应于药物（米格列醇、阿卡波糖）对PPG观察效应的约三分之一[4]。考虑到这些药物仅可在医疗监督下的患者凭处方获得，且由于碳水化合物吸收不良引起的胃肠道不适是这些药物的常见副作用[26]，因此，对于饮食辅助品而言，这一效应大小似乎是合理的。一些使用高剂量桑葚叶提取物（MLE）的研究报告了呼气氢增加，表明存在碳水化合物吸收不良[19,27]。Thaipitakwong等人报告称，含有18毫克DNJ的MLE剂量导致了腹胀和胀气的高发生率，而在DNJ水平为6或12毫克时未观察到此现象[28]。然而，由于DNJ水平（通常未报告）和产品总体组成的差异，必须谨慎比较此处使用的MFE与使用其他桑葚提取物的研究。
我们在此处和使用高达本试验两倍水平的MFE的研究中均未发现吸收不良或不耐受的迹象[10,13]。这可能部分归因于DNJ的剂量相对较低，且其在近端肠道中被快速且大量吸收，从而限制了其在肠道腔中存在的时间，影响了碳水化合物的消化[29]。据估计，摄入的DNJ在约30分钟内达到最大血浆浓度，远快于常见的α-葡萄糖苷酶抑制剂药物（阿卡波糖、米格列醇），后者在肠道中的存在和作用时间更长[29,30]。DNJ的作用时间短对其效应大小和与食物一起使用的适用性有影响，相对于药物而言。这有利于减轻潜在的副作用，同时仍能调节餐后的初始血糖反应和峰值血糖，但限制了其在较长（3-4小时）餐后期间的作用，如本研究所观察。
我们和其他人主要将桑葚提取物对PPG的观察效应归因于DNJ的存在。尽管DNJ可在少数其他植物中发现，或可由某些细菌合成[29,31]，但据我们所知，除桑葚外，DNJ在任何其他饮食来源中均未以有意义的量存在。然而，也有可能MFE中的其他糖苷酶抑制剂或次要成分也对这些效应有所贡献。
虽然目前的结果大体上与我们之前关于MFE的研究以及关于其他桑葚提取物的更广泛文献一致，但本研究存在一些局限性。大多数用于食品或补充剂用途的桑葚提取物是通过用水和乙醇处理原材料而制得的[29]。尽管此处使用的MFE是市售的，且其DNJ含量是标准化的，但确切的生产工艺是专有的，因此，来源于其他途径的MFE可能在其他次要成分的含量上有所不同。桑葚提取物研究之间的差异可能部分归因于这些组成上的差异。
这是一项规模较小的试点试验，未正式进行推断性假设检验的功效计算。尽管这对于当前目的而言是足够的，但更大的试验人群将提供更可靠的效应大小估计。为减轻受试者的负担，采集了静脉血。这不太可能对MFE效应的结果产生偏倚，但可能产生比毛细血管血更低的、变异更大的血糖值[32]。因此，虽然这不应影响本试点试验的总体结论，但其他采血方法可能允许对效应大小进行更精确的估计。
MFE对PPI的效应是次要目标，主要是为了再次确认PPG效应并非由于不成比例的胰岛素反应所致。胰岛素反应的降低很可能是葡萄糖摄取速率降低的间接结果，从而也降低了对胰岛素分泌的刺激。然而，对胰岛素分泌的可能效应尚未进行直接测试。在未来的研究中，建议特别关注该人群胰岛素释放和作用的测量，并考虑更长时间和重复暴露以及持续血糖控制标志物。
5 结论
本试验为一系列关于桑葚提取物和特别是MFE的研究增添了新证据，支持了其对常见饮食碳水化合物来源和不同人群急性PPG和PPI反应的安全性和降低效应[10-12]。结合目前的结果，证据表明，与可消化的碳水化合物来源一起食用含有3.75毫克DNJ的0.75克MFE适度剂量，可能会在健康个体和糖尿病患者中使2小时PPG曲线下面积平均降低约10%-25%的范围，并降低PPI、峰值血糖和血糖波动。
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