点击上方蓝字关注我们
摘要：
目的：本研究旨在探讨肠道菌群和嗜酸乳杆菌对黄芪（Radix Astragali，RA）及茯苓固体发酵黄芪（Fermented Radix Astragali，FRA）代谢的影响，并进一步探索RA、茯苓和FRA对高尿酸血症（Hyperuricemia，HUA）小鼠模型的药理作用及其治疗HUA的机制。
方法：利用肠道菌群和嗜酸乳杆菌在体外对FRA和RA进行发酵，以探究菌群对活性化合物代谢的影响。采用HUA小鼠模型进行抗高尿酸血症的药效学实验。运用网络药理学和分子对接技术，阐明RA和茯苓在治疗HUA中的潜在机制。
结果：结果显示，在48小时的肠道菌群结肠发酵过程中，FRA和RA中的黄芪甲苷IV（Astragaloside IV，AG IV）、总皂苷和总黄酮含量持续下降。在嗜酸乳杆菌发酵过程中，FRA中的AG IV含量在12小时达到峰值，为1.14 ± 0.20 mg/g；总皂苷和总黄酮分别在12小时和6小时达到最高值，分别为136.34 ± 6.15 mg/g和6.35 ± 0.06 mg/g。在RA中，AG IV和总皂苷分别在12小时和24小时达到最高值，分别为0.63 ± 0.05 mg/g和115.12 ± 4.12 mg/g；而总黄酮含量持续下降。与RA相比，FRA中嗜酸乳杆菌的数量显著增加。药效学结果表明，FRA能有效降低HUA小鼠的血尿酸（Uric Acid，UA）、甘油三酯（Triglycerides，TG）、黄嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase，XOD）、丙氨酸氨基转移酶（Alanine Aminotransferase，ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate Transaminase，AST）水平，对肝脏和肾脏具有保护作用。网络药理学分析显示，RA、茯苓和HUA之间有93个共同靶点，其中前五个核心靶点为肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）、信号转导子和转录激活子3（Signal Transducer and Activator of Transcription 3，STAT3）、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3（Cysteinyl Aspartate Specific Proteinase 3，CASP3）、jun原癌基因（JUN）和雌激素受体1（Estrogen Receptor 1，ESR1）。分子对接分析显示，AG IV、芒柄花黄素和毛蕊异黄酮与核心靶点结合良好。
结论：本研究揭示了RA和FRA与肠道菌群及嗜酸乳杆菌的相互作用，以及RA和茯苓在治疗HUA中具有多成分、多靶点、多信号通路的特点，为HUA的进一步治疗提供了新见解。
1 引言
高尿酸血症（Hyperuricemia，HUA）是一种由尿酸（Uric Acid，UA）排泄减少、生成增加或两者兼有引起的慢性代谢性疾病。近期证据表明，HUA、慢性肾脏病和心血管疾病之间存在病理关系(1)。在中国，HUA构成了潜在的公共卫生风险，成人患病率为15.1%(2)，3~19岁青少年患病率为23.3%(3)。中医理论证实了HUA的发展与“湿邪”概念之间的联系(4)。治疗HUA的主流药物主要分为三类：黄嘌呤氧化酶抑制剂、促尿酸排泄药和选择性尿酸重吸收抑制剂(5)，目前临床选择包括别嘌醇、丙磺舒、苯溴马隆和雷西纳德。然而，这些药物常常伴有不可避免的副作用。苯溴马隆因其潜在的肝毒性而使用受限(6)。丙磺舒在肾功能受损的患者中疗效和安全性有限(7)。为避免这些挑战，一些研究转向中医，以寻求HUA的新型治疗方法。
黄芪（Radix Astragali，RA）是黄芪[Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge]的干燥根，是一种世界闻名的草药，也是豆科中最大的开花植物属之一。黄芪中含有超过200种已鉴定的化合物，其主要活性成分包括皂苷、黄酮和黄芪多糖，这使得黄芪以滋补、保肝、抗菌和抗氧化特性而闻名(8)。黄芪最早记载于《汉书·艺文志·方技略》中的《五十二病方》，已有2000多年的药用历史(9)。根据《中华人民共和国药典》(10)，黄芪还具有补气、升阳、利尿以消肿的功能。黄芪已被证实具有改善肾功能的作用(11)，并在HUA治疗中得到了应用(12)。茯苓[Poria cocos (Schw.) Wolf]是茯苓的干燥菌核，在亚洲国家有着悠久的药用历史(13)。它最早记载于《神农本草经》。茯苓用于利尿、健脾，并具有抗肿瘤、抗氧化和抗炎作用(10, 14-16)。含有茯苓的方剂，如茯苓泽泻汤和葛根菊芋茯苓方，已被证实能够降低UA水平并改善HUA，且无明显肝肾损伤(17, 18)。由黄芪、茯苓、当归等中药组成的黄芪四物汤，长期以来一直用于治疗痛风(19)。尽管黄芪和茯苓在治疗HUA方面取得了一些进展，但其潜在机制仍阐述不足。先前研究表明，双向固体发酵可以增强中药的疗效、降低毒性并产生新的功效(20)。本研究团队发现，发酵黄芪（Fermented Radix Astragali，FRA）中活性化合物的含量显著高于黄芪(21)。
皂苷和黄酮的主要代谢发生在肠道内。人体结肠菌群由多种细菌组成，对结肠内容物代谢产生重要影响。一些研究表明，结肠菌群在将黄酮类和皂苷分别转化为苷元的过程中发挥着关键作用。结肠菌群对于黄酮类化合物有益功能的充分发挥至关重要(22-24)。特别是，有益菌在这一过程中发挥着关键作用，而乳杆菌属是结肠中重要且活跃的益生菌，可以为宿主提供有益代谢产物，从而促进结肠环境的稳定(25)。这些细菌积极参与多种生物过程，包括蛋白质生物合成、免疫调节、炎症介导、胃黏膜保护和抗氧化(26, 27)。此外，药物中的活性化合物对肠道菌群有积极影响。研究表明，补充黄酮类化合物后，结肠中的双歧杆菌、乳杆菌和阿克曼菌数量增加(28)。用黄芪皂苷纠正小鼠肠道菌群失衡后，双歧杆菌和乳杆菌的丰度增加(29)。HUA可能导致肠道屏障功能障碍和肠道通透性增强(30)。一些研究表明，肠道菌群在HUA的治疗中发挥着重要作用。三分之一的尿酸通过肠道排泄，并由肠道细菌进一步代谢(31-33)。乳杆菌可以表达尿酸酶、尿囊素酶和尿囊酸酶来分解UA(34)。在高蛋白饮食的鹅中，拟杆菌具有强大的抗高尿酸血症作用(35)。此外，采用16S rRNA测序的分析证实，在给予黄芪后，HUA组小鼠的乳杆菌属丰度增加(36)。虽然现有研究已证实给予黄芪后有益菌丰度的增加，但关于黄芪、发酵黄芪与结肠菌群之间的相互作用及其代谢变化的知识仍然不足。
因此，在本研究中，用茯苓发酵黄芪，并构建体外肠道菌群结肠发酵模型，以探究菌群对黄芪和发酵黄芪代谢的影响。此外，还在体外用嗜酸乳杆菌发酵黄芪和发酵黄芪，以进一步深入探究化合物与有益菌之间的相互作用。在此基础上，构建氧嗪酸钾（Potassium Oxonate，PO）诱导的HUA小鼠模型，以探究发酵黄芪和黄芪在治疗HUA中的疗效。此外，还应用网络药理学和分子对接技术，探讨黄芪和茯苓在治疗HUA中的潜在机制。本研究可为将发酵黄芪作为治疗HUA的方法提供科学依据。
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 材料与试剂
黄芪（RA）购自山西浑源万生黄芪开发有限公司（中国山西），并由滨州医学院（山东烟台）戴龙教授验证，相应的凭证标本（凭证号：20211001）保存于滨州医学院中药实验中心标本馆。使用800A粉碎机（中国永康五金医疗器械厂）对黄芪进行处理。高效液相色谱（HPLC）级溶剂购自天津科密欧化学试剂有限公司（中国天津）。马铃薯液体培养基和MRS培养基购自青岛海博生物技术有限公司（中国青岛）。各种化学品，如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、碳酸钠、过硫酸钾和氢氧化钠，购自国药集团化学试剂有限公司（中国上海）。唾液淀粉酶、胃蛋白酶、胃脂肪酶、胰酶和猪胆粉购自上海源叶生物科技有限公司（中国上海）。此外，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二铵盐（ABTS）、氧酸钾和D-果糖购自上海麦克林生化科技有限公司（中国上海）。无水乙醇购自天津永大化学试剂有限公司（中国天津）。香草醛购自天津广福精细化学研究所。苯溴马隆片（BT）购自常州康普药业有限公司（中国常州）。尿酸（UA）、甘油三酯（TG）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）的生化试剂盒购自南京建成生物工程研究所，而黄嘌呤氧化酶（XOD）试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司（中国北京）。
2.1.2 微生物菌株
嗜酸乳杆菌CGMCC1.1878购自中国科学院微生物研究所。茯苓（bio-08656）购自北京百欧博伟生物技术有限公司（中国北京）。
2.1.3 茯苓固态发酵黄芪
茯苓发酵黄芪（FRA）的制备按照我们之前的研究方法进行（21）。将黄芪粉与超纯水混合，并在YXQ-Sll高压灭菌器（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司，中国上海）中灭菌。然后，将茯苓种子发酵液接种到上述混合物中，并在GSP-9160MBE培养箱（上海博迅医疗生物仪器）中于27°C孵育10天。
2.2 体外模拟消化
体外模拟消化程序根据我们之前研究（21）中发表的方法进行了轻微修改后确定。在口腔阶段（OP），将15g FRA与15mL磷酸盐缓冲液（PBS）混合，并用0.9%生理盐水将溶液补充至180mL。通过添加16mol/L NaOH溶液将混合物的pH调节至7.0，然后在SHZ-A恒温水平摇床（常州诺基仪器有限公司，江苏常州）中于37°C孵育10分钟。随后，加入2.588g唾液淀粉酶，并在暗处消化2分钟。
在胃阶段（GP），用生理盐水将OP样品补充至180mL。用1mol/L HCl溶液将pH降低至2.0，并在37°C下孵育10分钟。随后，加入1.491g胃蛋白酶和0.671g脂肪酶，并在暗处消化2小时。
在肠阶段I（EP I），将GP样品与生理盐水混合至180mL。将pH提高至4.7，并在37°C下孵育10分钟。然后，加入0.727g胰酶和0.416g胆汁。在暗处消化2小时。在肠阶段II，将EP I样品与生理盐水混合。将混合物的pH提高至6.5。将样品与0.727g胰酶和0.416g胆汁混合，并在暗处消化2小时。
2.3 粪便微生物体外结肠发酵
从滨州医学院招募了四名健康捐赠者（两名男性和两名女性），他们无肠道疾病、未服用抗生素，并在捐赠前3个月以上保持规律饮食习惯。所有捐赠者均签署了知情同意书。本研究已根据世界医学协会《赫尔辛基宣言》制定的伦理学准则进行，并得到了中国山东滨州医学院医学伦理委员会的批准（伦理批准号：2024-L029）。收集粪便的过程对捐赠者无害，且未涉及人体实验。将粪便样本混合均匀，取55g混合粪便加入550mL无菌PBS中，通过无菌纱布过滤得到10% w/v的粪便浆液。在实验组中，分别将10mL经体外模拟消化处理的FRA和RA样本与15mL粪便浆液和15mL GAM混合于带塞试管中，均匀混合并用氮气去除氧气。然后，在LAI-3DT厌氧培养箱（上海龙跃仪器设备有限公司，中国上海）中于37°C厌氧条件下孵育一段时间。对于对照组，将15mL粪便浆液与15mL GAM和10mL无菌PBS混合于带塞试管中，并按实验组相同方式处理。在发酵0小时、6小时、12小时、24小时和48小时时，从厌氧培养箱中取出样本，与0.1mL甲醇混合，并通过3H16RI智能高速冷藏离心机（湖南赫西仪器装备有限公司，中国湖南）以10,000rpm离心10分钟。将不同时间的发酵上清液冷藏保存。每组实验重复三次。
2.4 嗜酸乳杆菌体外结肠发酵
发酵实验分为三组：FRA组、RA组和对照组；将4.5mL经体外模拟消化处理的FRA和RA样本分别与4.5mL MRS培养基和3mL嗜酸乳杆菌悬液混合于带塞试管中。之后，均匀混合各混合物。然后，将所有组别在37°C厌氧培养箱中孵育。在发酵0小时、6小时、12小时、24小时和48小时时，将样本与0.1mL甲醇混合，并以10,000rpm离心10分钟。将不同时间的发酵上清液冷藏保存。每组实验重复三次。
2.5 细菌计数
通过平板计数法量化活菌数。分别取体外嗜酸乳杆菌结肠发酵0小时、12小时、24小时、36小时和48小时的1毫升样本，用PBS稀释至10^6倍。将50微升稀释液均匀涂布于MRS琼脂上。所有平板在37°C厌氧环境下孵育48小时。
2.6 抗氧化能力测定
根据我们之前研究（21）的方法测定样本的体外抗氧化能力。在本实验中，我们通过DPPH和ABTS自由基清除试验评估了维生素C（Vc）和体外粪便微生物结肠发酵产物在0小时和48小时的抗氧化能力。
2.6.1 样本制备
将从体外粪便微生物结肠发酵0小时和48小时获得的上清液在RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂，中国上海）中真空蒸馏至恒重。然后称重固体。
2.6.2 DPPH自由基清除试验
通过DPPH自由基清除试验测定样本的抗氧化活性。分别将1毫克/毫升的样本溶液1600微升、800微升、400微升、200微升、100微升和100微升稀释液与1毫升DPPH混合，然后用无水乙醇稀释至4毫升。在暗处孵育30分钟后，利用北京普析通用仪器有限责任公司的TU-1810 APC紫外-可见分光光度计在517纳米处测量混合溶液的吸光度。根据以下公式评估自由基清除活性：
其中A1代表反应混合物的吸光度，A2代表空白（无DPPH）的吸光度，A3代表对照（无样本）的吸光度。
2.6.3 ABTS自由基清除试验
通过ABTS自由基阳离子（ABTS+）清除活性测定样本的抗氧化活性。将0.1毫升不同浓度的样本溶液与4毫升ABTS+工作溶液混合，并在暗处孵育6分钟。利用TU-1810 APC紫外-可见分光光度计在734纳米处测量混合物的吸光度。根据以下公式评估自由基清除活性：
其中A0代表对照（无样本）的吸光度，A代表反应混合物的吸光度，B代表不同浓度样本溶液的吸光度。
2.7 抗高尿酸血症药效实验
在本研究中，通过联合使用氧酸钾和果糖饮水构建高尿酸血症（HUA）小鼠模型。经过连续24天的实验后，进行生化检测并分析结果。
2.7.1 动物模型
所有动物实验均按照ARRIVE指南和实验室动物护理与使用指南的批准进行，且动物实验得到了中国山东滨州医学院动物伦理委员会的批准（伦理批准号：2024-L030），并遵循了3R原则。雄性昆明小鼠（体重范围：25–30 g）购自济南彭跃实验动物繁殖有限公司（实验动物许可证号：SCXK (鲁) 20190003）。小鼠饲养在无特定病原体（SPF）实验室中，室温为24 ± 2°C，湿度为60 ± 5%，光照周期为12小时明暗交替。所有小鼠在实验前均适应此环境3天。小鼠被随机分为六组（n = 8），即正常对照组（NC）、高尿酸血症组（PO）、阳性对照组（PO + BT）、RA组（PO + RA）、FRA组（PO + FRA）和茯苓组（PO + Pc）。
除对照组外，其余各组每天通过灌胃给予500 mg/kg的氧嗪酸钾一次，以构建高尿酸血症（HUA）模型，此操作依据先前的研究进行（37）。阳性对照组、RA组、FRA组和茯苓组的小鼠在建模后1小时分别给予苯溴马隆（10 mg/kg）、RA（2.5 g/kg）、FRA（2.5 g/kg）、茯苓（2.5 g/kg），连续给药24天。苯溴马隆的剂量参考先前的研究（38）。RA、FRA和茯苓的剂量根据药理学实验方法学（39）计算得出。NC组给予蒸馏水，其余组给予10%果糖饮用水。所有小鼠均按照中国动物保护协会制定的指南自由饮水和进食。
观察并记录六组小鼠的指标，包括饮食、饮水、精神状态和体重变化。在给药后12天和24天，分别采集小鼠的眶周血样，以3,500 rpm离心10分钟，然后储存在-20°C冰箱中。第24天给药后，小鼠禁食3小时，最后一次给药后麻醉，随后通过颈椎脱臼法处死。取出小鼠的肾脏和肝脏，浸入4%多聚甲醛中备用。
2.7.2 生化检测
使用试剂盒和酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清中的尿酸（UA）、甘油三酯（TG）、黄嘌呤氧化酶（XOD）、丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平。
2.7.3 组织学分析
将肾脏和肝脏组织固定在4%多聚甲醛中，然后切成组织病理学切片，用苏木精和伊红（H&E）染色，并在200倍放大下用光学显微镜观察切片。
2.8 含量测定
样品的含量测定按照我们之前研究的方法（21）进行。
2.8.1 总皂苷含量的测定
向带有塞子的试管中加入不同体积的AG IV标准溶液（0.5 mg/mL），并用甲醇补足至0.5 mL，与0.5 mL的8%香草醛乙醇溶液和5 mL的72%硫酸混合。在62°C下孵育20分钟后冷却至室温，使用TU-1810 APC紫外-可见分光光度计在540 nm处测定溶液的吸光度，建立标准曲线。按照上述方法测定2.3和2.4部分制备的样品溶液（0.1 mL）。
2.8.2 总黄酮含量的测定
向10 mL容量瓶中加入不同体积的芦丁标准溶液（0.2 mg/mL）。此外，将芦丁溶液与70%乙醇、5% NaNO₂溶液、10% Al(NO₃)₃溶液和4% NaOH溶液混合，然后用70%乙醇稀释至刻度。使用TU-1810 APC紫外-可见分光光度计在510 nm处测定混合物的吸光度，然后绘制标准曲线。将2.3和2.4部分制备的样品溶液（1.5 mL）加入10 mL容量瓶中，并重复上述方法。
2.8.3 高效液相色谱法
使用ELSD-16（岛津，日本）和DGU-20A3R高效液相色谱系统（岛津，日本）以及Phenomenex C18色谱柱（4.60 × 250 mm，5 μm）测定AG IV的含量。流动相由乙腈（A）和水（B）组成，梯度洗脱条件如下：0-20分钟，96-80% B；20-40分钟，80-70% B；40-65分钟，70-40% B；65-70分钟，40-96% B；70-80分钟，96% B。流速为1.0 mL/min，进样量为20 μL，温度为25°C。使用Thermo Scientific Dionex Ultimate 3000系列高效液相色谱系统（Dionex，美国）、二极管阵列检测器（Dionex，美国）和Kromasil 100-5-C18色谱柱（4.6 × 250 mm）测定刺芒柄花素的含量。流动相由0.05%甲酸（A）和乙腈（B）组成，梯度洗脱条件如下：0-5分钟，0-5% B；5-10分钟，5-20% B；10-25分钟，20-25% B；25-35分钟，25-30% B；35-40分钟，30-35% B；40-54分钟，35-40% B；54-55分钟，40-0% B。流速为1.0 mL/min，进样量为10 μL，温度为30°C。
2.9 网络药理学分析
2.9.1 RA和茯苓活性化合物及作用靶点的筛选
从TCMSP数据库1中检索RA和茯苓的化合物信息，特别关注口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18的化合物（40）。随后，通过SwissADME网站排除低肠道活性的化合物。将活性化合物的英文名称导入PubChem数据库。之后，检索SMILES，并使用Swiss Target Prediction平台2预测可能性≥0的靶点，然后进行筛选并收集靶向化合物的靶点。
2.9.2 HUA疾病靶点的筛选
以“高尿酸血症”为关键词，从GeneCards3、DisGeNET4和MOIM5等数据库中收集HUA疾病靶点。将这些数据库中获得的靶点合并，并去除重复项。
2.9.3 药物-疾病共同靶点的筛选
将RA、茯苓和HUA的靶点分别导入Draw Venn Diagram工具，提取它们之间的共同靶点，并绘制维恩图。
2.9.4 药物成分-靶点相互作用网络的构建
将成分信息和靶点数据导入Cytoscape 3.9.1，构建“药物成分-靶点”相互作用网络图。
2.9.5 蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建
利用STRING6在线平台数据库设计蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。在Cytoscape 3.9.1中使用Centiscape 2.2功能，通过计算度值、中间中心性和接近中心性来提取核心靶点。
2.9.6 GO和KEGG富集途径分析
通过DAVID数据库执行基因本体（GO）富集途径分析，以探索分子功能（MF）、生物过程（BP）、细胞成分（CC）和其他基因靶点功能。进行京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集途径分析，以讨论药物功能的生物途径，并分析潜在靶点的途径富集。使用生物信息学平台进行可视化分析。
2.9.7 分子对接
核心靶蛋白的三维结构来源于蛋白质数据库（Protein Database）7，作为蛋白受体。使用PyMOL从靶蛋白中去除配体和非蛋白质部分，并将结果保存为pdb格式文件。利用AutoDock Tools 1.5.7为蛋白受体添加氢原子，然后将结构保存为pdbqt格式文件。从PubChem数据库8中检索黄芪甲苷IV（AG IV）、芒柄花黄素和毛蕊异黄酮的二维结构，并保存为mol2格式文件。我们应用AutoDockTools1.5.7为这些分子添加氢原子，并检查分子的中心节点和可旋转键，将其保存为pdbqt格式文件，作为配体。使用AutoDock Vina 1.1.2进行分子对接，并评估配体与蛋白受体之间的结合能，以确定结合活性。利用PyMOL软件进行可视化展示。
表1 粪便微生物体外结肠发酵后黄芪多糖（FRA）和黄芪甲苷（RA）的成分含量。
2.10 统计分析
实验数据的收集使用Excel 2019软件，统计分析则使用SPSS软件26.0版本。定量数据以三次独立实验的平均值±标准差（SD）表示。数据间的显著差异通过方差分析（ANOVA）进行分析。当p值小于0.05时，认为具有统计学意义。
3 结果与讨论
3.1 粪便微生物体外结肠发酵结果
经过体外消化的黄芪甲苷（RA）和黄芪多糖（FRA）在37°C厌氧环境下，通过粪便微生物体外结肠发酵，于0小时、6小时、12小时、24小时和48小时进行采样。表1展示了体外结肠发酵过程中化合物含量的变化。两组中主要化合物的含量在整个发酵过程中均有所下降。在初始阶段，FRA中的黄芪甲苷IV（AG IV）含量是RA中的1.46倍，且在整个发酵过程中，FRA中的AG IV含量均高于RA。在48小时时，FRA和RA中的AG IV含量分别降低至0.60 ± 0.10 mg/g和0.47 ± 0.04 mg/g，与初始值相比分别减少了52.76%和45.98%（p < 0.05）。芒柄花黄素的含量在发酵过程中保持相对稳定。与初始阶段相比，在48小时时，FRA和RA中的总皂苷含量分别降低至54.00 ± 2.11 mg/g和43.31 ± 3.55 mg/g，分别减少了45.60%和58.26%（p < 0.05）。在48小时发酵后，FRA中的总黄酮含量从13.63 ± 0.41 mg/g降低至11.54 ± 1.33 mg/g，RA中的总黄酮含量从10.13 ± 0.50 mg/g降低至7.04 ± 0.05 mg/g。微生物的主要代谢途径包括水解、开环和二羟基化（41）。AG IV的减少可能归因于去糖基化，或其转化为环黄芪醇-6-β-D-吡喃葡萄糖苷、环黄芪醇皂苷或其他较小分子形式（42）。总皂苷的减少可能是由于去糖基化，化合物转化为次级代谢产物，并最终转化为苷元（43）。
图1A展示了体外结肠发酵过程中pH值的变化。在0小时时，FRA和RA组的pH值分别为6.61 ± 0.03和6.61 ± 0.01。在6小时内，FRA和RA的pH值分别降低至5.06 ± 0.00和4.66 ± 0.02，与初始阶段相比分别减少了23.45%和29.50%（p < 0.05）。pH值的降低可能归因于多糖和寡糖的产生，或粪便微生物产生的短链脂肪酸（SCFAs）（44）。一项研究表明，SCFA产量的增加可以降低发酵过程中的pH值（45）。6小时后，FRA组的pH值经历了轻微且连续的上升，这可能是由于FRA对粪便中有益微生物的选择性作用，使其能够促进结肠环境内pH值的调整（46）。然而，RA组的pH值在6小时发酵后保持稳定。
3.2 嗜酸乳杆菌体外结肠发酵结果
先前的研究表明，在给高尿酸（HUA）小鼠给予RA后，嗜酸乳杆菌的丰度增加（36）。在本研究中，选择嗜酸乳杆菌对FRA和RA进行发酵，以探索化合物与益生菌之间的相互作用。经过体外消化的RA和FRA在0小时、6小时、12小时、24小时和48小时进行采样，并在37°C厌氧条件下通过嗜酸乳杆菌体外结肠发酵。
表2展示了发酵过程中观察到的变化。初始观察发现，FRA中的AG IV含量高于RA，这可能是由于茯苓和体外消化过程中其他作为前体的黄芪皂苷的代谢或生物转化所致。在最初12小时内，FRA和RA中的AG IV含量增加，随后在接下来的时间内减少，在12小时时达到峰值，分别为1.14 ± 0.20 mg/g和0.63 ± 0.05 mg/g（p < 0.05），这可能是由于嗜酸乳杆菌作用下其他黄芪皂苷作为前体的生物转化（47）。随后的减少可能是由于嗜酸乳杆菌的酶活性，导致AG IV转化为次级代谢产物或其他小分子。芒柄花黄素的含量在发酵过程中保持相对稳定，而两组中的总皂苷含量均表现出先升后降的趋势。FRA中的总皂苷含量在12小时时达到峰值136.34 ± 6.15 mg/g，与初始值相比增加了282.01%（p < 0.05）；RA中的总皂苷含量在24小时时达到峰值115.12 ± 4.12 mg/g，与初始值相比增加了221.74%（p < 0.05）。在FRA中，总黄酮含量在6小时达到峰值6.35 ± 0.06 mg/g后下降。在RA中，总黄酮含量从4.28 ± 0.03 mg/g降低至48小时时的1.91 ± 0.18 mg/g。总黄酮的减少可能是由于嗜酸乳杆菌产生的水解酶的脱糖基化作用（48）。在嗜酸乳杆菌的影响下，FRA组中的AG IV、总皂苷和总黄酮含量均先升后降；而在RA组中，总皂苷和AG IV的含量在初期增加，随后下降。
图1B展示了嗜酸乳杆菌体外结肠发酵过程中pH值的变化。两组的pH值在最初6小时内升高，然后下降。在发酵0小时时，FRA和RA组的pH值分别为6.21 ± 0.02和6.27 ± 0.01。随后，在发酵6小时时，FRA和RA的pH值分别达到峰值6.86 ± 0.10和6.82 ± 0.42，与初始值相比分别增加了10.47%和8.77%（p < 0.05）。两组在发酵6小时后pH值的降低表明，这可能与嗜酸乳杆菌发酵过程中产生的SCFAs有关（49）。
为了进一步探究RA和FRA对嗜酸乳杆菌的影响，在整个发酵过程中监测了活菌数，结果如图1C所示。在发酵过程中，FRA的活菌数持续高于RA。随着结肠发酵时间的推移，FRA中的活菌数在24小时前保持急剧增加的趋势，24小时后增加缓慢。在FRA中，初始活菌数为2.83 ± 0.11 Log（CFU/mL），通过48小时的发酵过程增加至4.37 ± 0.09 Log（CFU/mL），与初始值相比增加了54.42%（p < 0.05）。RA在0小时时的初始活菌数为2.77 ± 0.12 Log（CFU/mL），在发酵24小时时增加至3.81 ± 0.08 Log（CFU/mL）（p < 0.05），并在24小时后保持稳定趋势。一项研究表明，枯草芽孢杆菌发酵的黄芪可以增加产丁酸菌和益生菌的丰度（50），这与本研究的结果一致。另一项研究显示，植物乳杆菌发酵的黄芪可以重塑肠道微生物群的丰富度和多样性，并增加肠道中乳杆菌的丰度（51）。本研究结果表明，FRA和RA均可增加嗜酸乳杆菌的活菌数，且与RA相比，FRA更有利于益生菌的生长。
3.3 粪便微生物发酵产物的DPPH和ABTS抗氧化活性
通过DPPH和ABTS自由基清除率评估体外粪便微生物结肠发酵产物的抗氧化活性，以维生素C（Vc）作为对照参考。FRA和RA的抗氧化活性与样品浓度相关，且Vc的抗氧化活性随着样品浓度的增加而急剧上升。
DPPH抗氧化结果如图2A所示。0小时FRA的DPPH清除活性高于0小时RA、48小时FRA和48小时RA。特别是在0.4 mg/mL浓度下，DPPH自由基清除率的降序为：Vc 97.33%，0小时FRA 84.68%，48小时FRA 84.25%，0小时RA 72.82%，48小时RA 66.75%。
ABTS抗氧化结果如图2B所示。0小时FRA的ABTS清除活性显著高于48小时FRA、0小时RA和48小时RA。在0.2 mg/mL浓度下，ABTS自由基清除率的降序为：Vc 98.60%，0小时FRA 93.12%，0小时RA 90.29%，48小时FRA 81.52%，48小时RA 56.14%。
DPPH和ABTS结果均表明，FRA的抗氧化能力优于RA。此外，图表还显示，样品的抗氧化能力随着浓度的增加而提高。
图1 (A) 粪便微生物群体外结肠发酵过程中pH值的变化。(B) 嗜酸乳杆菌体外结肠发酵过程中pH值的变化。(C) 发酵前后嗜酸乳杆菌的活菌数。
表2 嗜酸乳杆菌体外结肠发酵后FRA和RA中化合物含量
图2 (A) DPPH自由基清除率。(B) ABTS自由基清除率。
图3 清生化成分水平：(A) 尿酸(UA)，(B) 甘油三酯(TG)，(C) 黄嘌呤氧化酶(XOD)，(D) 丙氨酸氨基转移酶(ALT)，(E) 天门冬氨酸氨基转移酶(AST)。
3.4 RA、FRA和茯苓对小鼠高尿酸血症的影响
在本实验中，使用了六组昆明小鼠成功构建了高尿酸血症（HUA）模型。此外，最终结果显示，RA、FRA和茯苓对HUA的治疗具有不同的药效作用。
3.4.1 不同治疗对HUA小鼠尿酸（UA）、甘油三酯（TG）、黄嘌呤氧化酶（XOD）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）水平的影响
尿酸水平是高尿酸血症的关键指标，也是模型成功与否的重要判断标准。如图3A所示，在第24天，HUA组的尿酸水平为267.61 ± 67.72 μmol/L，是正常对照组（NC组）191.55 ± 0.00 μmol/L的1.40倍（p < 0.05），表明HUA模型构建成功。经过24天的治疗后，阳性对照组、RA组、FRA组和茯苓组的尿酸水平分别显著降低至174.45 ± 7.69 μmol/L、183.95 ± 26.68 μmol/L、143.08 ± 4.81 μmol/L和183.09 ± 67.72 μmol/L，与HUA组相比，分别降低了34.81%、31.26%、46.53%和31.58%（p < 0.05）。结果表明，FRA在促进尿酸排泄方面表现出最显著的效果。
如图3B所示，第24天时，HUA组的甘油三酯水平为0.99 ± 0.32 mmol/L，是正常对照组0.59 ± 0.05 mmol/L的1.68倍（p < 0.05）。经过24天的治疗后，阳性对照组、RA组、FRA组和茯苓组的甘油三酯水平分别显著降低至0.41 ± 0.23 mmol/L、0.49 ± 0.02 mmol/L、0.23 ± 0.04 mmol/L和0.74 ± 0.05 mmol/L，与HUA组相比，分别降低了58.59%、50.51%、76.77%和25.25%（p < 0.05）。其中，FRA组的甘油三酯水平降低最为显著。
如图3C所示，经过24天的连续治疗后，HUA组的黄嘌呤氧化酶水平为0.96 ± 0.02 U/mL，是正常对照组0.69 ± 0.03 U/mL的1.39倍（p < 0.05）。经过24天的治疗后，阳性对照组、RA组、FRA组和茯苓组的黄嘌呤氧化酶水平分别为0.43 ± 0.07 U/mL、0.60 ± 0.03 U/mL、0.46 ± 0.03 U/mL和0.67 ± 0.07 U/mL，与HUA组相比，分别降低了55.21%、37.50%、52.08%和30.21%（p < 0.05）。结果表明，FRA降低尿酸的功效与其限制黄嘌呤氧化酶水平、抑制尿酸生成有关。苯溴马隆主要通过抑制肾小管中的URAT1来减少尿酸的重吸收（52），而我们的结果表明，苯溴马隆还可以影响黄嘌呤氧化酶的活性，这与之前的研究一致（53）。
如图3D所示，第24天时，HUA组的丙氨酸氨基转移酶水平为32.68 ± 1.89 U/L，是正常对照组27.14 ± 0.54 U/L的1.20倍（p < 0.05）。经过24天的治疗后，阳性对照组、RA组、FRA组和茯苓组的丙氨酸氨基转移酶水平分别降低至14.68 ± 0.27 U/L、23.29 ± 1.09 U/L、16.78 ± 1.62 U/L和25.79 ± 3.53 U/L，与HUA组相比，分别降低了55.08%、28.73%、48.65%和21.08%（p < 0.05）。
如图3E所示，第24天时，HUA组的天门冬氨酸氨基转移酶水平为38.21 ± 5.17 U/L，是正常对照组23.62 ± 0.29 U/L的1.62倍（p < 0.05）。经过24天的连续治疗后，阳性对照组、RA组、FRA组和茯苓组的天门冬氨酸氨基转移酶水平分别为20.02 ± 5.37 U/L、27.27 ± 0.63 U/L、16.61 ± 2.49 U/L和30.78 ± 1.71 U/L，与HUA组相比，分别降低了47.61%、28.63%、56.53%和19.45%（p < 0.05）。这些结果表明，FRA有可能逆转由高尿酸血症引起的肝脏损伤。
3.4.2 RA、FRA和茯苓对肾脏和肝脏病理变化的影响
如图4A所示，对照组的肾脏组织显示出健康的结构，肾小球排列规则，肾小管上皮细胞正常，肾髓质完整。而HUA组和茯苓组则表现出一些异常变化，包括明显的肾小管扩张、肾小管上皮细胞的水肿变性和局部血管周围的炎性细胞浸润。阳性对照组、RA组和FRA组减轻了肾脏损伤，并改善了肾小管上皮细胞的水肿变性。这些发现表明，RA和FRA可以改善小鼠的肾脏组织病理学改变，从而减轻高尿酸血症的不良影响。
如图4B所示，对照组的肝脏组织肝细胞显示正常状态。而HUA组和茯苓组则表现出肝细胞内严重的水肿和空泡变性。苯溴马隆、RA和FRA治疗后，肝细胞仅表现出轻微的水肿变性，无炎性浸润。这些结果表明，RA和FRA能够改善由高尿酸血症引起的肝细胞组织学变化，对肝脏组织产生有益影响。
综上所述，FRA在降低尿酸、甘油三酯和天门冬氨酸氨基转移酶水平方面显示出最显著的药效作用。与RA和茯苓相比，FRA能够显著降低血清中的黄嘌呤氧化酶和丙氨酸氨基转移酶水平。同时，RA和FRA能够改善由高尿酸血症引起的肾脏和肝脏病理变化。这些结果与其他关于黄芪在肾脏保护方面的研究一致（50, 53, 54）。
3.5 网络药理学分析
3.5.1 RA-茯苓的主要活性化合物和作用靶点
表3展示了基于DL和OB在RA中选择的18种活性化合物和在茯苓中选择的8种活性化合物。通过Swiss Target Prediction网站共获得544种活性化合物和作用靶点。
3.5.2 疾病靶点的检索和活性成分-疾病共同靶点的筛选
从GeneCards、DisGeNET和MOIM数据库中检索到975个高尿酸血症靶点。在高尿酸血症与RA和茯苓的活性化合物之间发现了93个共同靶点，如图5A的维恩图所示。
3.5.3 药物成分靶点相互作用网络的构建
将成分和靶点数据导入Cytoscape3.9.1，获得表示“药物成分靶点”的相互作用效应网络图。在图5B中，橙色矩形代表药物，深绿色菱形代表靶点，水蓝色椭圆形代表成分。
3.5.4 PPI网络的构建
为了构建PPI网络，从STRING数据库中获取了875条边，结果如图5C所示。基于度值、中间中心性和接近中心性选择的核心靶点如图5D所示。核心靶点中度值排名前五的分别是TNF、STAT3、CASP3、JUN和ESR1，它们在高尿酸血症治疗中显示出显著的调控潜力。TNF，尤其是促炎细胞因子TNF-α，在高尿酸血症的病理进展中发挥着重要作用。先前的研究揭示，尿酸可以增加TNF-α的水平并刺激IL-1β的释放（55）。STAT3在许多细胞过程（如细胞生长和细胞凋亡）中发挥着重要作用（56），并对肾纤维化的过程产生重要影响。抑制STAT3的表达可以减轻由高尿酸血症引起的肾脏疾病（57）。CASP3在细胞凋亡过程中起着关键作用（58），CASP3表达的减少可以改善肾小管扩张和上皮细胞的变性（59）。JUN参与肿瘤细胞的生长调节（60），一些研究表明，高尿酸水平与癌症的高发病率相关（61, 62），JUN的异常表达可能导致尿酸水平升高。ESR1可以介导体内的雌激素信号，并可能对PI3K/AKT信号通路产生影响。因此，结果表明，RA和茯苓通过多个靶点在高尿酸血症中发挥治疗作用，其具体作用机制需要进一步研究。
3.5.5 GO功能分析的结果
通过GO富集通路分析，共获得了596个GO条目，其中包括457个生物过程（BP）、50个细胞组分（CC）和98个分子功能（MF）。在生物过程方面，这些条目涉及RNA聚合酶II启动子调控的转录、对外源刺激的反应、基因表达的正向调控等。在细胞组分方面，这些条目主要涉及细胞膜、细胞质和细胞核等。在分子功能方面，这些条目主要与蛋白质结合、蛋白质结合速率和ATP结合相关。图5E分别展示了生物过程、细胞组分和分子功能中最显著的10个条目。槐角和茯苓通过调节多种生物过程在高尿酸血症（HUA）治疗中发挥作用。
3.5.6 KEGG通路分析的结果
通过KEGG富集通路分析，共获得了681条信号通路，包括癌症相关通路、PI3K-Akt信号通路、脂质与动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGEs-RAGE信号通路、癌症中的蛋白聚糖等。图5F展示了最重要的10个条目。研究表明，AGEs（晚期糖基化终末产物）可以通过与AGEs受体（RAGE）结合，在各种细胞和器官中诱导氧化应激和炎症（63）。HMGB1（高迁移率族蛋白B1）是炎症的重要介导子，也是RAGE的高亲和力配体（64）。高浓度的尿酸（UA）显著增加了HMGB1的细胞外释放（65），促进了IL-6、TNF-α和其他炎症因子的释放，从而导致肾小管间质纤维化和肾小球损伤。UA可以通过PI3K-Akt信号通路刺激IL-1β、TNF-α和PTGS2的表达，诱导肾小管上皮细胞的炎症反应。抑制PI3K-Akt信号通路不仅可以降低URAT1和GLUT9的表达，还可以减轻肾脏炎症损伤（66, 67）。因此，可以推测槐角通过调节多个信号通路来治疗高尿酸血症。
3.5.7 分子对接的结果
分子对接的结果基于亲和力进行评估，当亲和力小于-5.0 kcal/mol时，认为存在强相互作用（68-71）。核心靶标的前五个度值与AG IV（槐角苷IV）、芒柄花黄素和毛蕊异黄酮进行了分子对接。图6显示，芒柄花黄素和毛蕊异黄酮与TNF（肿瘤坏死因子）、STAT3（信号转导子和转录激活子3）、CASP3（半胱天冬氨酸蛋白酶3）、JUN（Jun原癌基因）和ESR1（雌激素受体1）结合良好，结合能低于-5.0 kcal/mol。AG IV与CASP3和ESR1结合良好，结合能低于-3.0 kcal/mol。
图4 氧嗪酸钾（PO）诱导的高尿酸血症（HUA）小鼠的病理变化。（A）肾脏组织病理学（放大倍数：×200，比例尺：100 μm）。（B）肝脏组织病理学（放大倍数：×200，比例尺：100 μm）。NC，正常对照组；PO，氧嗪酸钾；BT，苯溴马隆片；RA，黄芪；FRA，茯苓固体发酵黄芪；Pc，茯苓（每组n=8只小鼠）。
表3 从TCMSP数据库获得的黄芪和茯苓的主要活性成分。
图5 (A) 黄芪（RA）、茯苓（Poria cocos）和高尿酸血症（HUA）的维恩交集靶点图。(B) 黄芪和茯苓治疗高尿酸血症的“药物成分-靶点”相互作用网络图。(C) 黄芪和茯苓治疗高尿酸血症的蛋白质-蛋白质相互作用网络图。(D) 核心靶点。(E) GO功能富集气泡图。(F) KEGG通路富集气泡图。
图5 (A) 黄芪（RA）、茯苓（Poria cocos）与高尿酸血症（HUA）的维恩图交集靶点示意图。(B) 黄芪和茯苓治疗高尿酸血症的“药物成分-靶点”相互作用网络示意图。(C) 黄芪和茯苓治疗高尿酸血症的蛋白质-蛋白质相互作用网络图。(D) 核心靶点图。(E) GO功能富集气泡图。(F) KEGG通路富集气泡图。
4 结论
在本研究中，结果表明肠道菌群对黄芪（RA）和茯苓固体发酵黄芪（FRA）中有效成分的代谢具有作用。经过体外肠道菌群结肠发酵后，FRA和RA中的黄芪苷IV（AG IV）、总皂苷和黄酮类化合物含量均呈下降趋势。在FRA组，48小时时AG IV、总皂苷和黄酮类化合物的含量分别为0.60 ± 0.10 mg/g、54.00 ± 2.11 mg/g和11.54 ± 1.33 mg/g。而在RA组，48小时时这些成分的含量分别为0.47 ± 0.04 mg/g、43.31 ± 3.55 mg/g和7.04 ± 0.05 mg/g。在前6小时内，FRA和RA的pH值均有所下降，6小时后FRA的pH值略有上升，而RA的pH值在6小时后保持稳定。6小时时，FRA和RA的pH值分别降低至5.06 ± 0.00和4.66 ± 0.02。在抗氧化试验中，无论是在0小时还是48小时，FRA在DPPH和ABTS自由基清除能力方面均优于RA。此外，我们发现嗜酸乳杆菌对FRA中有效成分的代谢影响更为显著，在发酵过程中AG IV、总皂苷和黄酮类化合物的含量先上升后下降。12小时时，AG IV和总皂苷的含量分别为1.14 ± 0.20 mg/g和136.34 ± 6.15 mg/g。6小时时，总黄酮的含量为6.35 ± 0.06 mg/g。在RA中，AG IV和总皂苷的含量在发酵过程中先增加后减少，分别在12小时和24小时时达到峰值，分别为0.63 ± 0.05 mg/g和115.12 ± 4.12 mg/g。总黄酮的含量在发酵过程中持续下降，48小时时降低至1.91 ± 0.18 mg/g。两组的pH值均呈先上升后下降的趋势。初始阶段，FRA和RA组的pH值分别为6.21 ± 0.02和6.27 ± 0.01。发酵6小时时，FRA和RA组的pH值达到最高水平，分别为6.86 ± 0.10和6.82 ± 0.42。此外，FRA组表现出更高的活菌数和更好的嗜酸乳杆菌生长支持作用。进一步的药效学实验证实，与RA相比，FRA在降低高尿酸血症（HUA）模型中的尿酸（UA）水平、抑制黄嘌呤氧化酶（XOD）活性、降低甘油三酯（TG）、谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）水平方面具有更显著的作用，显示出更好的肝脏和肾脏保护作用。网络药理学分析表明，RA在治疗HUA中具有多成分、多靶点、多信号通路的特点。RA中的主要活性化合物可能是AG IV、芒柄花黄素和毛蕊异黄酮，靶标TNF、STAT3、CASP3、JUN和ESR1可能是治疗HUA的核心靶标，主要信号通路可能是AGEs-RAGE通路和PI3K/Akt通路。与当前主流的高尿酸血症治疗药物相比，FRA在临床治疗中可能表现出更安全、更低毒的特点。本研究揭示了黄芪和茯苓在治疗高尿酸血症中的作用机制，并为FRA在高尿酸血症治疗中的临床应用提供了科学依据。在此基础上，未来的研究将有必要阐明FRA通过干扰肠道菌群及其代谢产物对XOD水平和尿酸降低的机制以及其药理学机制。
点个在看你最好看
