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摘要
人免疫缺陷病毒1型（HIV-1）特异性广谱中和单克隆抗体（bNAbs）迄今为止在单独使用或作为两种抗体的联合疗法（即“鸡尾酒”疗法）时，已显示出短暂的病毒抑制效果1–4。三种bNAbs的组合可提高对全球范围内病毒的中和覆盖率，从而可能更有效地抑制病毒逃逸和反弹5–7。本研究开展了一项开放性、两部分的研究：第一部分在6名未感染HIV的成人中评估单次静脉注射HIV-1 bNAbs（PGT121、PGDM1400和VRC07-523LS）的效果；第二部分在一项多中心试验中，对12名接受抗逆转录病毒治疗（ART）中断的HIV感染者每月最多输注六次这三种bNAbs。主要终点指标为安全性、耐受性和药代动力学，而第二部分的次要终点指标为ART停药后的抗病毒活性、CD4+ T细胞计数的变化以及与bNAb耐药性相关的HIV-1序列突变的发展。该试验达到了其预先规定的终点指标。bNAb治疗总体上是安全且耐受性良好的。在第二部分中，83%的受试者（12人中的10人）在抗体治疗期间至少28周内维持了病毒学抑制，42%的受试者（12人中的5人）尽管血清bNAb浓度降低至低水平或无法检出水平，但仍显示出至少38~44周的病毒学抑制。在探索性分析中，两名受试者早期的病毒反弹与基线时对PGT121和PGDM1400的耐药性相关，而五名受试者长期的病毒学控制则与bNAb治疗后免疫激活、T细胞耗竭和促炎信号传导的减少相关。我们的数据表明，在无ART的情况下，三种bNAbs的联合疗法具有抑制HIV-1的潜力。ClinicalTrials.gov注册号：NCT03721510。
引言
针对人免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的广谱中和单克隆抗体（bNAbs）已显示在未接受抗逆转录病毒治疗（ART）的HIV感染者（PLWH）中能短暂降低血浆病毒载量1,2,5,8–11。CD4结合位点（CD4bs）抗体3BNC117与V3聚糖抗体10-1074的组合也在ART停药后为PLWH提供了部分病毒学控制3,4,12,13。然而，bNAb治疗期间耐药病毒的选择对基于bNAb的治疗策略构成了挑战，并表明两种bNAb的联合可能不足以实现持续的病毒学控制14–16。在本研究中，我们评估了包含V3聚糖抗体PGT121、V2顶端抗体PGDM1400和CD4bs抗体VRC07-523LS的三种bNAb组合。该联合疗法在体外中和了全球99%的病毒，其中82%的病毒被至少2种活性抗体以80%抑制浓度（IC80）<10 µg ml−1中和，65%的病毒被至少2种活性抗体以IC80<1 µg ml−1中和（参考文献7）。我们开展了一项1/2a期临床试验，以评估在PLWH中每月最多六次输注PGT121、PGDM1400和VRC07-523LS的安全性、药代动力学和抗病毒活性。
图1 | CONSORT流程图。展示了受试者的招募、随机分组和随访情况。受试者入组于贝斯以色列女执事医疗中心（BIDMC）、奥兰多免疫学中心（OIC）和德克萨斯大学健康科学中心麦戈文医学院的休斯顿艾滋病研究团队（HART）。a
注：第2组中有一名志愿者在第0天接受了部分输注（未给予计划中的三次输注[IP]组合中的一次），且之后未再进行任何输注，因此在本研究中的安全性随访有限。该志愿者的数据将不纳入安全性数据展示。
结果
研究设计与安全性
本1/2a期研究的第一部分是在美国马萨诸塞州波士顿进行的一项单中心、开放性研究，旨在评估单次静脉注射（IV）PGT121和VRC07-523LS（第1A组：每种抗体30 mg/kg；n=3，2名女性（f）和1名男性（m））或PGT121、PGDM1400和VRC07-523LS的组合（第1B组：每种抗体20 mg/kg；n=3，2名女性和1名男性）在无HIV-1感染的成人中的安全性和药代动力学（图1和2a，以及补充表1）。本1/2a期研究的第二部分是一项多中心、开放性试验，对HIV-1感染者（PLWH）每月进行三次IV输注，每次输注PGT121、PGDM1400和VRC07-523LS各20 mg/kg（第2组；n=13，3名女性和10名男性），并可选择在病毒学抑制持续的情况下，额外接受三次每月IV输注该三抗体联合疗法，总共接受六次输注（图1和2a，以及补充表1）。第2组入组的13名志愿者中，有1名志愿者因制备问题在第0天仅接受了3种bNAbs中的2种，因此被排除在后续bNAbs给药和所有分析之外。第2组所有其余参与者在首次抗体输注后2天停用抗逆转录病毒治疗（ART）。所有参与者均为美国HIV-1 B亚型的HIV-1感染者。共筛查了34名参与者，其中15名因不符合条件或其他原因被排除（图1）。第一名参与者于2019年1月15日入组，最后一名参与者于2022年5月2日入组。
三种抗体总体上安全且耐受性良好（补充表2-5）。四名志愿者报告了严重不良事件（SAE）和/或3级或更高级别的不良事件（AE）或反应原性，经研究者判定与bNAbs无关。在PLWH中，bNAb输注后CD4+ T细胞计数未发生实质性变化（扩展数据图1a，b）。
药代动力学
评估了PGT121、PGDM1400和VRC07-523LS的血清水平（图2b和扩展数据图1c，d）。在无HIV-1感染的参与者（第1A组）中，以双bNAb组合给药时，PGT121和VRC07-523LS的中位消除半衰期分别为20.4天和37.7天；而在无HIV-1感染的参与者（第1B组）中，以三bNAb组合给药时，PGT121、PGDM1400和VRC07-523LS的半衰期分别为21.1天、23.2天和38.7天（扩展数据图1c，d）。在接受每月一次、共六次三bNAb联合疗法的PLWH（第2组）中，这些抗体的中位消除半衰期分别为19.9天、23.9天和44.9天。这些半衰期长于先前在病毒血症PLWH中报告的半衰期5。在20周的时间内多次给药并未改变PGT121、PGDM1400和VRC07-523LS的药代动力学特征。在这些个体中未检测到抗药物抗体（数据未显示）。
病毒学控制
第2组的12名参与者中，有10名（83%）在ART停药后至少28周的bNAb给药期间维持了病毒学抑制（<200拷贝/毫升）（图2c）。值得注意的是，参与者在基线时未进行bNAb敏感性筛查。血浆ART药物水平（选择替诺福韦和恩曲他滨进行检测，因为当时几乎所有可用的联合ART方案中均包含这两种药物之一）低于定量下限，证实了参与者在ART停药后未偷偷使用ART（数据未显示）。
两名参与者在第6周（65021）和第10周（98059）出现早期病毒反弹。在bNAb治疗期间维持病毒学抑制的10名参与者中，50%（5/10）在bNAb水平于第28周后下降时出现反弹（65010、65015、98050、98058和98060），而50%（5/10）在随访期间（38-44周）即使bNAb水平降低至低水平或无法检测的水平（98055、98056、09057、98063和98064）也显示出病毒学控制，其中4名参与者的随访在研究结束时（第44周）进行，1名随后失访的参与者（98063）的随访在第38周进行。因此，第2组的12名参与者中有5名（42%）在随访期间（即最后一次bNAb输注后24周以上）显示出长期病毒学控制。由于这是一项探索性概念验证试验，因此分析为描述性，未对正式的无效假设进行检验。
在两名出现早期病毒反弹的参与者中，病毒学失败发生在所有三种抗体水平均较高的情况下，PGT121、PGDM1400和VRC07-523LS的水平分别为208.8、178.3和422.1 µg/ml（图3）。相比之下，在5名于第28周至第44周之间出现反弹的参与者中，反弹时PGT121、PGDM1400和VRC07-523LS的平均血清浓度分别为3.1、8.9和93.4 µg/ml。在未于第44周出现反弹的参与者中，平均血清浓度分别为3.4、1.5和24.7 µg/ml。这些数据表明，在本试验中，三bNAb联合疗法在大多数PLWH中维持了超过28周的病毒学抑制，病毒反弹通常表现为PGT121和PGDM1400的浓度低于10 µg/ml，VRC07-523LS的浓度低于100 µg/ml。尽管有两名参与者早期出现反弹，但在其他参与者中，直到bNAb水平降低至这些低阈值水平时，才出现反弹。
值得注意的是，5名参与者在随访期间（超过38-44周）维持了病毒学抑制，尽管bNAb水平降低至低水平或无法检测的水平。一种可能性是，在某些情况下，非常低水平的bNAbs可能足以实现病毒学抑制，且组织中的bNAb水平尚待确定。如通过完整前病毒检测试验（IPDAs）所测量，bNAb输注并未明显减少外周HIV-1储存库的大小（图4a，b），尽管我们不能排除这些试验对病毒储存库的微小变化，且本研究中未收集组织用于储存库测量。此外，bNAb输注并未导致第24周时自体抗原特异性T细胞反应的可检测增加，如通过IFNγ酶联免疫斑点试验（ELISpot）和细胞内细胞因子染色试验所测量（图4c-g），尽管我们不能排除对其他T细胞亚群或功能的潜在调节。高分辨率人类白细胞抗原（HLA）分型未显示本研究中任何参与者具有保护性HLA等位基因（补充表6）。根据方案，建议所有未出现可检测血浆病毒载量的参与者在试验结束时重新开始ART。
图2 | PGT121、PGDM1400和VRC07-523LS的研究设计、药代动力学及治疗效果。a，研究设计。1A组和1B组纳入了未感染HIV-1的受试者，他们分别单次静脉注射PGT121和VRC07-523LS（绿色三角形）或PGT121、PGDM1400和VRC07-523LS（蓝色三角形）。第2组为接受抗逆转录病毒疗法（ART）后病毒学抑制的HIV感染者（PLWH），他们每月接受一次PGT121、PGDM1400和VRC07-523LS的静脉注射，持续3个月（蓝色三角形），若病毒学抑制持续存在，可选择继续每月注射3个月（浅蓝色三角形）。在第0天首次输注广谱中和抗体（bNAb）后，第2天停止ART，若受试者达到预设的重启标准或在研究第308天结束时，则重新启动ART。D，天。b，第2组中接受所有六次三种bNAb输注的受试者（n=8）血清中VRC07-523LS、PGDM1400和PGT121的水平，通过抗独特型特异性定量酶联免疫吸附试验（PGT121、PGDM1400）和电化学发光免疫测定法（VRC07-523LS）测定。数据为均值±标准差。每种bNAb的平均半衰期（t1/2）以天表示。c，HIV-1 RNA水平。显示了第2组12名受试者（颜色编码）在研究过程中血浆HIV-1 RNA水平（log10(RNA拷贝数/毫升)）。垂直虚线表示给予三种bNAb（PGDM1400、PGT121和VRC07-523LS）的时间点。首次三重bNAb输注后2天停止ART（如灰色框所示）。一名受试者（98063）失访。水平虚线表示HIV-1 RNA水平的定量下限。除65021接受两次输注和65015、98056及98059接受三次输注外，其余受试者均接受六次输注。
图3 | 单个参与者的病毒学和药代动力学随访。
第2组参与者的血浆HIV-1 RNA水平（红线；右侧y轴）和广谱中和抗体（bNAb）血清浓度（VRC07-523LS（绿色）、PGDM1400（蓝色）和PGT121（红色）；左侧y轴）。灰色阴影区域表示抗逆转录病毒治疗（ART）期间。参与者65021恢复了ART但失访（LTFU），参与者98063搬离该州并不得不提前退出研究。红色虚线表示检测下限。
图4 | 病毒库和T细胞免疫。a，研究参与者在基线时（首次广谱中和抗体（bNAb）输注前）通过完整前病毒DNA扩增（IPDA）检测法测得的携带完整前病毒HIV DNA的CD4+ T细胞频率，这些参与者在研究随访期间出现了早期、晚期或无病毒血症反弹。未观察到统计学上的显著差异。b，晚期病毒血症反弹参与者（左图）在基线时和第6个月（病毒血症出现前）以及无病毒反弹参与者（右图）在基线时和研究随访结束时，其CD4+ T细胞中的IPDA病毒库动态变化。c，通过干扰素-γ（IFNγ）酶联免疫斑点（ELISpot）检测法测得的基线时HIV蛋白表位（PTE）肽池（Gag1、Gag2、Env1、Env2和Env3）诱导的T细胞反应频率。所示为每组参与者对每个肽池反应的平均值。d，通过流式细胞术测定的基线时早期、晚期和无反弹者中HIV特异性IFNγ+ CD8+ T细胞亚群的频率。e，通过IFNγ ELISpot检测法量化的晚期病毒反弹和无病毒反弹参与者在基线时和第6个月的HIV特异性T细胞反应动态变化。f，g，通过细胞内细胞因子染色测定的晚期病毒反弹参与者（f）和无病毒反弹参与者（g）中HIV特异性IFNγ+ CD8+ T细胞（上图）和CD4+ T细胞（下图）的动态变化。SFC，斑点形成细胞；f/u，随访。
蛋白质组学
接下来，我们进行了一项血浆蛋白质组学初步分析，以深入了解三联广谱中和抗体（bNAb）治疗后长期病毒学控制的潜在机制。我们重点关注了10名参与者，他们在bNAb治疗期间实现了病毒学控制，并且在bNAb水平下降时要么出现病毒反弹（反弹者；n=5），要么在38~44周的随访期间持续保持病毒学控制（控制者；n=5）。我们评估了bNAb输注开始前（基线时）和bNAb输注完成后第24周（但病毒反弹前）的血浆蛋白质组特征。与基线相比，反弹者在涉及免疫细胞特征、促炎症反应、干扰素反应、凋亡以及组蛋白和染色质表观遗传修饰的途径中表现出激活，提示即使在血浆病毒载量可检测之前，就已经存在免疫激活和可能的低水平病毒激活（图5a）。相比之下，控制者表现出代谢途径的增加和某些促炎症途径的减少（图5a）。在比较控制者与反弹者时，我们发现，在bNAb输注开始前，这两组之间在途径和关键基因上的差异很小（图5b）。bNAb输注完成后，与反弹者相比，控制者表现出可诱导T细胞共刺激分子（ICOS）信号传导、巨噬细胞激活、T细胞激活和耗竭、凋亡以及促炎症信号传导的减少（图5b）。这些数据提示了一种潜在机制，即bNAb输注与随后表现出长期病毒学控制的参与者中的免疫激活、T细胞耗竭和促炎症信号传导相关。
病毒库和反弹病毒的中和敏感性
我们在第2组的10名参与者中，通过外周血单核细胞（PBMC）中前病毒DNA的单基因组扩增，在基线时和病毒反弹时（如发生）对血浆病毒RNA进行了HIV-1序列生成（图6）。我们构建了HIV-1假病毒，使用TZM-bl中和试验评估bNAb敏感性，并分析匹配的env序列，以识别可能导致潜在耐药模式的突变。总共从基线时PBMC前病毒DNA中生成了83条序列，从反弹病毒的血浆病毒RNA中生成了227条序列（平均每位参与者有10条基线序列和32条反弹序列）。由于可用的PBMC有限，我们无法从12名未反弹的参与者中的2名（98057、98064）中获得病毒序列。
在两名出现早期病毒反弹的参与者（65010、98059）中，在基线时的CD4+ T细胞前病毒克隆中检测到对PGDM1400和PGT121的部分或完全中和耐药，而反弹病毒克隆对PGT121和PGDM1400完全耐药，但对VRC07-523LS的敏感性可变（扩展数据图2和3）。在65021中，基线时和反弹时的病毒克隆在VRC07-523LS接触位点几乎相同，表明尽管该个体血清中VRC07-523LS浓度高达300~1,000 µg ml−1，但VRC07-523LS对其没有选择压力。相比之下，来自98059的反弹病毒克隆表现出对VRC07-523LS的耐药，这可归因于G459D突变，这是一个已知的耐药特征[17]。
在五名出现晚期病毒反弹的参与者中，观察到反弹病毒存在两种不同的敏感性模式。在三名参与者（98050、98058、98060）中，大多数反弹病毒对PGT121和PGDM1400耐药，但对VRC07-523LS仍然敏感（扩展数据图4和5）。这些参与者在病毒反弹时表现出PGT121和PGDM1400的血清浓度较低，但VRC07-523LS的水平可检测。在剩余的两名晚期反弹参与者（65010、65015）中，反弹病毒对所有三种bNAb均保持完全敏感（扩展数据图6和7）。我们还从五名未反弹参与者中的三名获得了外周CD4+ T细胞中的前病毒序列（扩展数据图8和9）。基于bNAb特征分析，这三名参与者的所有序列在核心PGT121和VRC07-523LS接触位点均表现出敏感性特征的富集，而在PGDM1400的核心C链接触区域（161、165和169）观察到耐药特征（扩展数据图8和9）。由于这些序列的假病毒生成失败，因此无法确定其对PGDM1400中和敏感性的影响。对于剩余的两名未出现病毒反弹的参与者，我们无法生成基线时的前病毒序列。
对PGT121的耐药与关键324GDIR327基序接触位点[18]中332聚糖的丢失或缺失（参与者65010、98050、98058和98060）、H330Y（参与者65021）或G324R（参与者98059）相关，这些都是先前描述的耐药特征[17]（扩展数据图3~7）。对PGDM1400的耐药与先前报告的耐药突变N130（参与者65021、98050和98058）和V169[17]（参与者98050）相关，或由于突变K168E或R190S（参与者65015）降低了PGDM1400偏好的V2顶点表位的净正电荷，或丢失了高变V1环中的配对半胱氨酸，这可能通过破坏表位近端环的稳定性而增强耐药性[19]。
图5 | 蛋白质组学特征。a，在10名参与者中，第24周与基线相比的蛋白质组学通路。这些参与者在广谱中和抗体（bNAb）治疗期间表现出病毒学控制，并且在随访期间持续表现出长期病毒学控制（控制者；n=5）或病毒反弹（反弹者；n=5）。圆圈的大小表示通路富集的水平；红色表示各通路水平增加，蓝色表示各通路水平减少。b，在控制者与反弹者中，于bNAb输注开始前（基线）和bNAb输注完成后第24周（但病毒反弹前）被调节的蛋白质组学通路。每组内个体的蛋白质水平取平均值。颜色渐变表示倍数变化的log2转换值，范围从蓝色（降低）到红色（升高）的蛋白质水平。
图6 | 反弹病毒序列。参与者基线病毒和反弹病毒Env蛋白的系统发育树。基线Env蛋白以蓝色表示，反弹Env蛋白以红色表示。橙色表示在血浆病毒未反弹期间从外周血单核细胞（PBMCs）中衍生的Env序列。每位参与者的Env簇根部显示其识别编号。已测试中和活性的Env以实心圆或三角形表示，其针对三种广谱中和抗体（bNAbs）的中和IC80滴度在右侧以彩色方框显示，颜色编码见下方图例。
讨论
在本研究中，我们发现由PGT121、PGDM1400和VRC07-523LS组成的三重广谱中和抗体（bNAb）鸡尾酒疗法在停止抗逆转录病毒治疗（ART）后，在83%（12名中的10名）未进行基线bNAb敏感性筛查的参与者中实现了病毒学控制，且该控制状态持续至bNAb治疗期间。在这10名在bNAb治疗期间表现出病毒抑制的参与者中，50%（10名中的5名）在bNAb水平下降时出现了病毒反弹，而另50%（10名中的5名）即使在bNAb水平降低至低水平或无法检测水平后，仍在随访期（38~44周）内保持病毒学控制。因此，第2组总参与者中有42%（12名中的5名）在随访期间表现出长期病毒学控制。
既往研究表明，单独或联合使用bNAb在病毒血症的人类免疫缺陷病毒（HIV）感染者（PLWH）中具有抗病毒活性[1,2,5,8-10]。然而，宿主内HIV-1准种在基线时对中和作用的抗性导致病毒快速反弹，这对bNAb治疗构成了挑战[14]。因此，要在没有ART的情况下实现可靠的病毒学控制，需要具有互补表位特异性的bNAb组合[7]。我们的数据表明，除了对PGT121和PGDM1400均具有基线抗性的个体外，三重bNAb鸡尾酒疗法可以在ART停止后的一段时间内作为PLWH的有效ART替代方案。
既往研究显示，单一和双重bNAb组合对病毒的控制时间有限。一项在PLWH中进行的10-1074和3BNC117研究显示，ART停止后中位病毒学抑制时间为20周，其中17名参与者中有2名（12%）在研究结束时的第48周仍表现出长期病毒学控制[3]。另一项研究显示，在急性感染期间开始ART的7名PLWH中，有2名在使用这种双重bNAb鸡尾酒疗法后实现了长期病毒学控制（最长30周）[4]，尽管这些个体病毒库中的病毒多样性可能少于在慢性感染期间开始ART的典型PLWH。当前双重bNAb治疗方案的一个问题是，循环病毒中有很大一部分仅对鸡尾酒疗法中的一种抗体敏感（扩展数据图10）。相比之下，三重bNAb治疗可以通过鸡尾酒疗法中的两种或更多抗体实现对全球病毒更全面的覆盖[5,7]。
病毒反弹通常表现为对两种聚糖依赖性抗体PGT121和PGDM1400产生抗性，但对CD4结合位点（CD4bs）抗体VRC07-523LS的抗性有限，这表明聚糖抗体在体内施加了更大的选择压力或具有更低的抗性阈值。除两名早期反弹的个体外，参与者通常在PGT121和PGDM1400的bNAb水平降低至约10 µg/ml，以及VRC07-523LS的bNAb水平降低至100 µg/ml时出现反弹。病毒反弹时，所有参与者对VRC07-523LS的80%抑制剂量（ID80）滴度基本一致（约100 µg/ml），且高于PGT121和PGDM1400的滴度。一名参与者出现了对VRC07-523LS具有抗性的反弹病毒，这证实VRC07-523LS在某些情况下可以施加选择压力。要确定PLWH中bNAb的治疗有效性的确切水平，需要更大规模的研究。
我们未观察到bNAb治疗对病毒库或宿主T细胞反应产生直接影响，尽管蛋白质组学分析表明，bNAb给药可能降低了参与者的免疫激活、T细胞耗竭和促炎信号传导。我们推测，bNAb输注后宿主-病毒平衡的先天性和细胞免疫调节可能有助于观察到的bNAb水平降低至低水平或无法检测水平后的长期病毒学控制。
总之，我们的数据表明，三重bNAb鸡尾酒疗法在未使用ART的情况下，在PLWH中实现了病毒学控制，除非基线病毒库中的前病毒包含对两种聚糖依赖性抗体PGT121和PGDM1400具有抗性的病毒。此外，在一部分参与者中观察到了bNAb治疗后的长期病毒学控制。重要的是，从研究早期（第10周）开始，直至bNAb给药完成且bNAb水平降低至亚治疗水平（第28周）后，没有参与者出现病毒反弹。这些初步数据表明，可以进一步探索三重bNAb鸡尾酒疗法作为PLWH的ART替代策略。从理论上讲，三重bNAb鸡尾酒疗法也有可能在HIV-1预防方面表现出高度有效性。目前，这三种抗体的长效版本正在开发中，这可能会促进一种可以每6个月给药一次用于HIV-1治疗和预防的三重bNAb鸡尾酒疗法的开发。
