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胖大海是一种中国传统中药，在《中国药典》中被特指为胖大海（Sterculia lychnophora Hance）的种子。本研究中，我们将胖大海的外壳和内核分离，分析了其营养成分，并探讨了胖大海乙醇提取物对变形链球菌致龋特性的抑制作用，变形链球菌是导致龋齿和牙菌斑形成的重要细菌。胖大海乙醇提取物对变形链球菌表现出剂量依赖性的抗菌活性，在浓度高于0.01 mg/mL时，与对照组相比具有显著抑制作用（𝑝< 0.05）。此外，胖大海在浓度>0.03 mg/mL时减少了生物膜的形成，而在高浓度（0.04、0.08、0.16和0.32 mg/mL）下，细菌存活率呈剂量依赖性降低。乙醇提取物的初步植物化学成分分析显示，其中含有大量的生物碱、酚类、苷类和肽类，而类固醇、萜类、黄酮类和有机酸的含量较低。胖大海外壳的水分和灰分含量高于内核，而外壳的蛋白质和脂肪含量则低于（𝑝 < 0.05）内核。这些结果表明，胖大海可能对变形链球菌具有抗菌作用，这种作用可能与胖大海中的主要成分——生物碱、酚类、苷类和肽类有关。
1 引言
中国传统中药胖大海由胖大海（Sterculia lychnophora Hance）的干燥成熟种子组成，胖大海是一种属于梧桐科的落叶乔木。该树种主要生长在热带地区，包括越南、印度、马来西亚、泰国、印度尼西亚以及中国的广东和海南岛[1]。未成熟的种子呈椭圆形，外观类似橄榄，而成熟种子的长度和宽度分别约为2–2.5厘米和1.2–1.7厘米，重量约2克（图1）。种子的外层非常薄且易碎，当浸泡在水中时，其暴露的内部呈黄褐色，具有海绵状且富含黏液的质地[2]。
在中药词典中，胖大海无味，长时间咀嚼后具有黏性，性凉或寒，味道略甜或苦甜。它常用于治疗咽炎、便秘和咳嗽[3, 4]。在中国，胖大海通常被煮沸或浸泡在热水中，作为饮品来治疗喉咙痛或腹胀。近期报告显示其具有神经保护作用[4]。然而，胖大海的防龋齿作用或抗菌活性尚不为人所知。其主要成分包括种子外层的巴索林，以及果皮中的半乳糖（15.06%）和五碳糖（主要是阿拉伯糖，24.7%）[5]。
龋齿是牙科中最常见的慢性生态疾病，也被称为蛀牙或龋洞。它是一种感染性疾病，牙齿的硬组织（如牙釉质、牙本质和牙骨质）会逐渐且不可逆地被破坏[6, 7]。龋齿由某些类型的口腔链球菌引起，包括革兰氏阳性菌变形链球菌，这是最重要的致龋菌，也是此疾病的主要致病因子[8, 9]。变形链球菌代谢食物中的碳水化合物并产生有机酸，从而引发牙釉质腐蚀。尽管氟化物化合物已被用于抑制龋齿的形成，但高浓度具有细胞毒性[10]。因此，开发新型且安全的防止龋齿形成的药物至关重要。天然产物是药物发现（包括防龋齿药物）的良好候选者。
在本研究中，我们展示了胖大海抑制变形链球菌的生长、产酸以及生物膜形成的能力。这是关于胖大海防龋齿作用的首次报道。此外，我们还分析了胖大海的植物化学成分和营养成分。
2 材料与方法
2.1 材料
脑心浸出液（BHI）肉汤购自美国Difco Laboratories（底特律，密歇根州）。葡萄糖和二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma-Aldrich Co.（圣路易斯，密苏里州）。变形链球菌ATCC 25175购自美国典型培养物保藏中心（ATCC，罗克维尔，马里兰州）。
2.2 植物材料与提取
胖大海购自韩国大韩药局（益山），并由韩国全北国立大学环境与生物资源科学学院的Young-Hoi Kim进行鉴定。标本（编号18-03-12）已存放于圆光大学口腔生物化学系的标本室。在使用前，将胖大海的植物材料的外壳和内核分离。使用300克植物材料制备乙醇提取物，将其置于3000毫升烧瓶中，并用3000毫升70%乙醇在室温下浸渍72小时。然后将乙醇提取物样品干燥、称重，并在-20°C下储存，得率为10.68克（3.56%）。将乙醇提取物溶解在DMSO中，以获得实验所需的储备溶液。在培养系统中，DMSO的最终浓度调整为0.1%（v/v），这不会干扰测试，而对照组则使用含有0.1% DMSO的培养基处理。
2.3 生长和产酸抑制
细菌生长抑制的测定采用先前描述的方法的修改版[11]。细胞生长评估在37°C下进行，使用含有不同浓度胖大海提取物的0.95毫升BHI肉汤管。向管中接种0.05毫升在BHI肉汤中过夜培养的变形链球菌，最终密度为5 × 10^5菌落形成单位（CFU）/毫升，并在37°C下孵育。孵育24小时后，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）板读数器（美国Molecular Devices Co.，桑尼维尔）在550纳米处测量生长培养基的光密度（OD），确定最小抑制浓度（MIC），即过夜孵育后抑制变形链球菌可见生长的最低浓度。此外，使用pH计（菲律宾HANNA Instrument）测定培养基的pH值。对于每种测试提取物浓度，测量均进行三次重复，并使用1%氟化钠（NaF）作为阳性对照。
2.4 生物膜测定
本研究使用的生物膜测定方法基于先前描述的方法[12]。将胖大海提取物添加到含有1%葡萄糖的BHI肉汤中，置于35毫米聚苯乙烯培养皿或24孔板（丹麦Nunc，哥本哈根）中。然后，用密度为5 × 10^5 CFU/毫升的耐甲氧西林变形链球菌接种培养基。在37°C下培养48小时后，完全去除上清液，并用蒸馏水冲洗培养皿、孔或含有复合树脂牙齿的孔。通过用0.1%番红染色，然后用30%醋酸处理以释放染色细胞中的结合番红，并在530纳米处测量溶液的吸光度，来测定孔中形成的生物膜量。树脂牙齿表面形成的生物膜也用0.1%番红染色并拍照。
2.5 扫描电子显微镜（SEM）
还使用扫描电子显微镜（SEM）检查35毫米聚苯乙烯培养皿上形成的生物膜，方法基于先前描述的修改版[13]。用蒸馏水冲洗培养皿上形成的生物膜，并在4°C下用0.1 M的二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.2）中的2.5%戊二醛固定24小时。用梯度浓度的乙醇（60%、70%、80%、90%、95%和100%）顺序脱水后，样品经冷冻干燥，用金（108A溅射镀膜仪，英国Cressington Scientific Instruments Inc.，沃特福德）溅射镀膜，并使用扫描电子显微镜（日本JEOL，JSM-6360 SEM）观察。
2.6 激光共聚焦显微镜
使用激光共聚焦显微镜测定胖大海提取物的杀菌效果。将变形链球菌培养物（在BHI中）用额外的BHI培养基稀释至约1 × 10^7 CFU/毫升的密度，然后在37°C有氧条件下，用高浓度（8–64毫克/毫升）的胖大海提取物处理。孵育30分钟后，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细菌，并使用LIVE/DEAD BacLight细菌活力试剂盒（美国Molecular Probes，尤金）根据制造商的说明染色15分钟。使用激光共聚焦显微镜（德国Zeiss，LSM 510）观察染色细菌。该方法基于两种核酸染料：绿色荧光SYTO 9和红色荧光碘化丙啶染料，它们在穿透健康细菌细胞和标记活细菌以及膜受损细菌的能力上存在差异。
2.7 植物化学成分筛选
使用植物化学成分试验[14]分析胖大海的乙醇提取物。分别使用Mayer试剂、氯化铁试剂、Molisch试验、Biuret试剂、Mg-HCl试剂、Liebermann-Burchard试剂和硝酸银试剂测定生物碱、酚类、苷类、肽类、黄酮类、类固醇和有机酸。
2.8 分析测定
使用官方分析化学家协会（AOAC）的方法[15]分析胖大海提取物的近似成分（水分、蛋白质、脂肪、碳水化合物和灰分）和矿物质含量。进行以下分析以确定近似营养成分：将提取物样品在110°C的强制通风烘箱中暴露5小时，确定水分损失。使用半自动氮分析仪通过凯氏定氮法测定总氮。通过用石油醚在索氏提取器中提取8小时，从提取物样品中提取醚溶性物质，然后取2克样品炭化并在550°C的马弗炉中灰化至恒重5小时，确定灰分含量。根据以下方程使用新鲜重量衍生数据计算碳水化合物含量：
2.9 矿物质含量分析
使用原子吸收分光光度计分析胖大海提取物中的钙、铁、钠、钾、镁和锌含量，而磷含量则使用分光光度计测定。
2.10 膳食纤维分析
分别分析胖大海外壳和内核提取物中的不溶性膳食纤维（IDF）、可溶性膳食纤维（SDF）和总膳食纤维（TDF），使用相关的AOAC方法[15]。
2.11 统计分析
所有实验均进行三次重复，并使用统计软件包（SPSS）18.0版程序分析数据。数据以均值 ± 标准误（SE）表示。使用Student's t检验评估实验组和对照组均值之间的差异，𝑝值 < 0.05被认为具有统计学意义。
图1：胖大海（Sterculia lychnophora Hance）植株各部位的照片。
3. 结果
3.1. 对细菌生长和产酸的抑制作用
胖大海（Sterculia lychnophora）乙醇提取物在0.01、0.02、0.03和0.04 mg/mL浓度下对变形链球菌（S. mutans）表现出显著的剂量依赖性抗菌活性（图2）。此外，与对照组相比，在浓度高于0.01 mg/mL时，提取物处理组的抑制作用显著（𝑝 < 0.05），而0.1%氟化钠（NaF）阳性对照也表现出抗菌活性。在测试浓度（0.01、0.02、0.03和0.04 mg/mL）下，提取物处理组与对照组的比较显示，抗菌效果分别为11.02%、31.78%、77.54%和95.76%。
胖大海乙醇提取物对变形链球菌产酸的抑制作用，通过其对pH值的影响来评估，结果见表1。未处理对照组的pH值显著降低（pH 5.37 ± 0.01），但这种效应在阳性对照组（0.1% NaF，pH 7.29 ± 0.00）中被显著抑制。胖大海提取物（0.01–0.04 mg/mL）表现出显著的抑制作用。这些结果表明，胖大海乙醇提取物可能抑制变形链球菌的有机酸产生。
3.2. 胖大海对生物膜形成的抑制作用
使用番红染色评估胖大海提取物对变形链球菌生物膜形成的抑制作用，结果见图3。胖大海提取物（0.01–0.04 mg/mL）抑制了变形链球菌生物膜的形成，这种抑制作用在阳性对照（0.1% NaF）中也观察到。此外，胖大海提取物引起了染色生物膜颜色强度（OD）的显著剂量依赖性变化。
扫描电子显微镜（SEM）照片（图4）展示了使用番红染色获得的结果。在对照组中，变形链球菌附着并聚集在聚苯乙烯35 mm培养皿表面，形成了可见的生物膜。然而，在胖大海浓度高于0.03 mg/mL和阳性对照（0.1% NaF）存在时，生物膜形成减少。
此外，我们还观察了番红染色后树脂牙齿表面的生物膜形成（图5）。胖大海提取物（0.01–0.04 mg/mL）抑制了树脂牙齿表面生物膜的形成，且在浓度高于0.03 mg/mL时抑制作用尤为明显。
3.3. 胖大海对变形链球菌的杀菌作用
胖大海的杀菌作用见图6。通过使用LIVE/DEAD BacLight细菌活性试剂盒对培养细菌进行染色，随后进行共聚焦激光扫描显微镜观察，来确定胖大海的杀菌作用。在高浓度（0.04、0.08、0.16和0.32 mg/mL）胖大海提取物下，细菌活性呈剂量依赖性降低。这一结果表明，高浓度胖大海提取物可能对变形链球菌具有杀菌作用。
3.4. 植物化学成分筛选
乙醇提取物的植物化学成分测试结果见表2。对乙醇提取物进行了初步植物化学成分分析。乙醇提取物中碱类、酚类、苷类和肽类含量丰富，而类固醇、萜类、黄酮类和有机酸含量较低。
3.5. 近似组成分析
胖大海提取物近似组成分析的结果见表3。壳的水分（11.97% ± 0.19）和灰分（5.38% ± 0.10）含量高于仁的水分（7.83% ± 0.05）和灰分（2.65% ± 0.03）含量。壳的蛋白质（3.12% ± 0.07）和脂肪（0.02% ± 0.01）含量低于仁的蛋白质（17.24% ± 0.23）和脂肪（6.47% ± 0.25）含量。壳和仁的碳水化合物含量无显著差异，分别为79.54% ± 0.21和65.79% ± 0.17。
3.6. 矿物质分析
胖大海提取物矿物质含量分析的结果见表4。壳的钙、铁、镁和钾含量显著高于仁（𝑝 < 0.05）。壳的铜含量为0.89 ± 0.01 mg/100 g，磷含量为11.50 ± 0.01 mg/100 g，均显著低于仁（𝑝 < 0.05）。壳和仁的钠含量无显著差异。
3.7. 膳食纤维分析
表5显示了胖大海壳和仁的不溶性膳食纤维（IDF）、可溶性膳食纤维（SDF）和总膳食纤维（TDF）。壳的IDF、SDF和TDF含量均显著高于仁。
图2：经不同浓度S. lychnophora乙醇提取物处理后，变形链球菌（S. mutans）培养上清液的光密度。
孵育后与对照组相比，*𝑝 < 0.05。
表1：变形链球菌（S. mutans）与S. lychnophora乙醇提取物共孵育后的pH值。
表2：S. lychnophora乙醇提取物的植物化学成分筛选结果。
图3：变形链球菌（S. mutans）生物膜形成的番红染色。对照组、0.01、0.02、0.03和0.04 mg/mL S. lychnophora乙醇提取物组以及阳性对照组0.1%氟化钠（NaF）。孵育后与对照组相比，*𝑝 < 0.05。
表3：S. lychnophora的近似化学成分。
表4：S. lychnophora的矿物质含量。
表5：S. lychnophora的壳和仁中的膳食纤维含量。
图4：在S. lychnophora乙醇提取物存在下培养的变形链球菌生物膜的扫描电子显微镜图像：（a）对照组，（b）0.01，（c）0.02，（d）0.03，以及（e）0.04 mg/mL提取物组，和（f）阳性对照组（0.1% NaF），比例尺=10 μm。
图5：经S. lychnophora乙醇提取物处理后的树脂牙表面变形链球菌生物膜：（a）对照组，（b）0.01，（c）0.02，（d）0.03，以及（e）0.04 mg/mL提取物组，和（f）阳性对照组，0.1%氟化钠（NaF）。
图6：经S. lychnophora处理的变形链球菌的杀菌效果，使用LIVE/DEAD BacLight细菌活性试剂盒染色。通过共聚焦激光扫描显微镜观察染色后的细菌。S. lychnophora处理可剂量依赖性地减少绿色标记的活细菌（SYTO 9染色）并增加红色标记的死细菌（PI染色）。（a）对照组，（b）0.04，（c）0.08，（d）0.16，以及（e）0.32 mg/mL提取物组，和（f）阳性对照组0.1%氟化钠（NaF），比例尺=50 μm，物镜（×100）。
4 讨论
关于龋齿的预防和治疗已有多项研究，龋齿是人类最常见且慢性的牙齿疾病之一。据知，该疾病平均影响85.7%的人群。一旦患上龋齿，该疾病不会自我限制，因此不经治疗无法治愈[16]。此外，若不加治疗，龋齿可能发展为牙髓炎，引起剧烈疼痛，最终导致必须拔牙[16]。
变形链球菌（S. mutans）常存在于人类牙菌斑中，是对牙釉质最具致龋性的细菌。它代谢膳食中的糖分，产生丙酸、丁酸、乳酸和甲酸等有机酸作为代谢产物，这些酸可降低牙菌斑的pH值，使牙釉质脱矿，从而引发龋齿[17, 18]。
变形链球菌在获得性釉质膜覆盖的牙齿表面粘附和定植，是牙菌斑（一种生物膜）形成的初始步骤。生物膜的形成增强了细菌对宿主防御系统和抗菌药物的抵抗力。已开发出多种天然物质用于治疗和预防牙齿疾病。据报道，绿紫苏和艾草的叶子甲醇提取物[19]以及白人参[20]对变形链球菌具有优异的抗菌效果。然而，有报道指出，S. lychnophora的乙醇提取物比这些物质的抗菌效果更为显著。据报道，Aralia continentalis的甲醇提取物[21]和Dianthus superbus的甲醇提取物[22]分别在2 mg/mL和4 mg/mL的浓度下对变形链球菌有效。此外，S. lychnophora的乙醇提取物对这些物质的抗菌效果也更优。
我们的目标是提供科学证据，证明S. lychnophora提取物如何减少引起龋齿的细菌生长。
在本研究中，我们制备了S. lychnophora的乙醇提取物，并研究了其对变形链球菌致龋特性的潜在影响。S. lychnophora提取物抑制了变形链球菌的生长，后者通常被认为是形成牙菌斑和龋齿的主要细菌[7]。S. lychnophora的乙醇提取物抑制了变形链球菌引起的pH值下降。这些结果表明，S. lychnophora的乙醇提取物可能抑制变形链球菌的有机酸产生。此外，S. lychnophora的乙醇提取物在0.01至0.04 mg/mL的浓度范围内抑制了变形链球菌的生物膜形成，扫描电镜（SEM）关于生物膜形成的数据与番红染色数据相一致。S. lychnophora提取物（0.01–0.04 mg/mL）也抑制了树脂牙齿表面上的生物膜形成。
在本研究中，我们使用0.1%氟化钠（NaF）作为阳性对照。它表现出抗菌活性，并抑制了变形链球菌的pH值下降和生物膜形成，与S. lychnophora的作用相似。然而，之前的报告显示，当氟化物浓度高于80 ppm时，氟化物化合物具有细胞毒性[23]。氟化物化合物已被研究用于抑制龋齿，但龋齿仍然是牙齿缺失的主要原因。因此，有必要开发对龋齿具有更好效果的新药物。在本实验中，我们发现存在大量生物碱、酚类、苷类和肽类，以及少量类固醇、黄酮类和有机酸。这些化合物可能是本研究中观察到的抗龋活性的原因[24, 25]。
S. lychnophora乙醇提取物中的生物碱、酚类、苷类和肽类含量高于Aralia continentalis乙醇提取物中的报道含量[21]。在Aralia continentalis乙醇提取物的结果中，黄酮类和有机酸含量丰富，酚类和类固醇含量中等，生物碱含量较少。
随后，我们研究了S. lychnophora壳和仁的近似成分。壳的水分和灰分含量显著高于（𝑝 < 0.05）仁，而蛋白质和脂肪含量显著低于（𝑝 < 0.05）仁。根据Li和Chen[26]的研究，中国产S. lychnophora中的Fe和P含量分别为183.0和2786.0 mg/kg，而柬埔寨样品中的P含量为2017.0 mg/kg，高于本研究中的观察结果。本研究中Ca、Mg和Na的含量分别为1210.0、3323.0和8.1 mg/kg，均高于上述研究。壳中的不溶性膳食纤维（IDF）含量高于柿子皮（15.71%）、枣（16.88%）、香橼（7.32%）、谷物和土豆样品（7.36%）[27, 28]。干豆浆渣中含有约16%的可溶性膳食纤维（SDF），高于S. lychnophora壳中的含量[29]。仁中的可溶性膳食纤维（ISF）含量低于柿子浆（1.95%）、枣（1.95%）和香橼（2.61%）[27]。
总之，我们证明了S. lychnophora的乙醇提取物可能抑制酸产生和生物膜形成，这可能是由于提取物中的主要成分有机酸和苷类的作用。因此，我们提供了科学证据，证明S. lychnophora乙醇提取物在治疗龋齿方面的潜在疗效，并为其在民族医学中的持续应用和未来发展为标准治疗提供了基础。
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