我们将每天分享国际上生物、医学等方向的最新科研成果，把世界上最新的科技发展带给读者，如果喜欢我们，请点一个关注吧
摘要
病毒病原体引起的异常免疫反应会促进疾病发生，但我们对人类病毒组中病毒（尤其是在人群规模上）引起的病理性免疫反应的理解仍然有限。我们分析了6321名日本个体的全基因组测序数据集，其中包括自身免疫性疾病（寻常型银屑病、类风湿性关节炎（RA）、系统性红斑狼疮（SLE）、肺泡蛋白沉积症（PAP）或多发性硬化症）患者、2019冠状病毒病（COVID-19）患者以及健康对照组。我们系统地量化了血液DNA病毒组的两种成分：内源性人疱疹病毒6型（eHHV-6）和指环病毒。携带eHHV-6B的参与者患SLE和PAP的风险更高；前者在“All of Us”研究中得到了验证。eHHV-6B阳性与SLE疾病活动指数高评分之间存在强相关性。全基因组关联研究和长读长测序将HHV-6B基因组的整合位点定位到22号染色体上的一个位点。表位绘图和单细胞RNA测序揭示了eHHV-6B在SLE患者中引起的独特免疫诱导。此外，高指环病毒载量与SLE、RA和COVID-19状态之间存在强相关性。我们的分析揭示了人类病毒组与自身免疫性疾病和传染性疾病之间的关系。
引言
针对非自身病毒表位的免疫反应若调控得当，则有助于病毒清除。然而，另一方面，对病毒感染的过度或异常反应可能类似于自身免疫性疾病的反应，并偶尔如吉兰-巴雷综合征一样，引发自身免疫反应的风险1。同样，由爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）编码的EBNA1与宿主GlialCAM之间的表位不可区分性，可能是多发性硬化症（MS）中观察到的自身反应性淋巴细胞扩增的原因之一2,3。在小鼠模型中，Theiler病毒感染持续存在会通过表位扩展引发针对髓鞘的自身免疫反应，在此过程中，自身蛋白会异常地呈现给免疫系统4。在系统性红斑狼疮（SLE）患者的血浆中，针对内源性逆转录病毒编码的包膜蛋白的抗体滴度与干扰素（IFN）刺激基因（ISGs）的表达相关5。此外，被认为是“细胞因子风暴”的免疫病理反应既可归因于病毒感染（如严重2019冠状病毒病（COVID-19）所见），也可归因于自身免疫性疾病6。我们对病毒感染与自身免疫性疾病之间关系的理解尚不完整。例如，目前尚不清楚哪些自身免疫性疾病与病毒感染相关，以及哪些因素会使病毒感染引发并加重自身免疫性疾病。
DNA病毒常在健康个体中建立无症状的潜伏感染。例如，EBV感染非常普遍，成年人群中的感染率超过90%7。在超过8%的健康人群的血液中可检测到指环病毒8。除了外源性病毒，约1%的人类携带内源性人疱疹病毒6型（eHHV-6），这是一种整合在亚端粒区域的、可遗传的HHV-6基因组，据推测其可以重新激活成为一种可传播的病毒9,10。由于eHHV-6未包含在参考人类基因组中，因此它是一个可能被忽视的、能触发抗病毒反应的遗传因素。高通量测序提供了识别和研究这类病毒的新方法，这些病毒可定义为人类的“病毒组”8。例如，已利用人类样本和细胞系的全基因组测序（WGS）来研究eHHV-6的流行率和潜在重新激活情况9,11,12。大规模人群测序可以揭示特定人类病毒的存在与疾病或免疫反应之间的关系。例如，脾脏和血液中存在EBV核酸与血浆细胞数量增加相关13。通过病毒组分析发现的一种单链DNA病毒家族，称为Redondoviridae，与牙周炎相关14。指环病毒载量与免疫抑制和急性呼吸道疾病相关15,16。eHHV-6的存在与先兆子痫、心绞痛以及HHV-6特异性抗体滴度水平升高相关17-19。这些发现强调了进行系统性病毒组分析以识别病毒与人类疾病之间新关联的必要性。例如，病毒与自身免疫性疾病之间已部分揭示的关联（如EBV与MS之间的关联）表明，通过进一步研究可能会发现类似的关联。
在本研究中，我们分析了来自6000多名日本个体的WGS数据，这些个体包括五种自身免疫性疾病患者、COVID-19患者或健康对照者。我们在这些数据集中系统地检测了eHHV-6和指环病毒核酸，并进行了病例-对照关联研究，比较了患有或未患有这些疾病的无关个体中eHHV-6的流行率或指环病毒的丰度（图1）。为了确认检测到的eHHV-6基因组的遗传性质，我们对eHHV-6B阳性进行了全基因组关联研究（GWAS），并对SLE中eHHV-6B阳性的患者进行了PacBio HiFi长读长测序。此外，还比较了来自4名eHHV-6B阳性和12名eHHV-6B阴性SLE患者的噬菌体免疫沉淀测序（PhIP-seq）的表位绘图，以及来自4名eHHV-6B阳性和11名eHHV-6B阴性SLE患者的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据。
图1 | 研究设计概述。我们收集了6,321份来自患有五种自身免疫性疾病（天疱疮（PV）、类风湿性关节炎（RA）、系统性红斑狼疮（SLE）、肺泡蛋白沉积症（PAP）和多发性硬化症（MS））以及COVID-19的患者和健康对照者的全基因组测序（WGS）数据集。对这些数据集进行分析，以检测人疱疹病毒6型（eHHV-6）和无环病毒（anellovirus）感染。此外，我们利用“All of Us”全基因组测序数据，对系统性红斑狼疮与eHHV-6之间的关联性进行了一项大规模验证研究。我们进行了HHV-6B阳性的全基因组关联研究（GWAS）。我们对eHHV-6B阳性的系统性红斑狼疮患者进行了长读长测序、PhIP-seq和单细胞RNA测序（scRNA-seq）（方法见正文）。
结果
概述
我们分析了6,321份日本样本。样本特征、样本收集和全基因组测序（WGS）平台的详细信息见方法部分。WGS数据集包括1,357名寻常型银屑病（PV）患者、378名类风湿性关节炎（RA）患者、251名系统性红斑狼疮（SLE）患者、216名肺泡蛋白沉积症（PAP）患者、36名多发性硬化症（MS）患者、1,164名COVID-19患者和2,919名健康对照者。大多数COVID-19患者（n=1,068；91.8%）患有重症（需要氧气支持、人工呼吸和/或重症监护；补充表1）。我们使用两条生物信息学流程来检测人疱疹病毒6型（eHHV-6）和无环病毒感染（图1）。简而言之，我们将那些未映射到人类参考基因组的WGS读段重新映射到它们各自的病毒参考基因组。为了检测无环病毒，我们使用了3,333条人类无环病毒序列，以准确检测差异显著的无环病毒基因组。我们使用逻辑回归和Fisher精确检验来计算每种疾病与eHHV-6或根据标准化无环病毒载量（每细胞病毒拷贝数）定义的三种无环病毒感染状态相关的调整后的优势比（OR）。对于每种高OR疾病，我们使用线性回归或逻辑回归和Fisher检验来估计疾病临床指标与eHHV-6或三种无环病毒感染状态之间的关系。
eHHV-6B与自身免疫性疾病和SLE活动性相关
我们在16名参与者中检测到了eHHV-6A，在22名参与者中检测到了eHHV-6B（患病率分别为0.25%和0.35%；表1，补充表2和图2a）。在这些参与者中，一名健康对照者携带eHHV-6A，四名参与者携带eHHV-6B（一名PV患者，两名PAP患者和一名健康对照者）有eHHV-6“solo-DR”形式的证据（参考文献9）。
接下来，我们使用逻辑回归模型和Fisher检验测试了eHHV-6与每种疾病之间的病例对照关联。与健康对照者相比，任何疾病患者的eHHV-6A患病率均无显著差异。相比之下，SLE和PAP患者的eHHV-6B患病率高于健康对照者（患病率分别为1.6%和1.4%对比0.21%；Fisher检验mid-P值分别为0.0060和0.022）。在调整年龄和性别后，我们确认了eHHV-6B与SLE和PAP的关联，SLE的调整后OR为6.9（95%置信区间（CI）=1.61-27.2；Wald检验P=0.0061），PAP的调整后OR为7.0（95% CI=1.43-27.7；P=0.0075）。这些观察结果表明，携带eHHV-6B会增加患这些疾病的风险，与以往已知的疾病遗传和环境因素相比，其效应大小较大20–22。
为了探讨eHHV-6B与SLE或PAP临床指标之间可能存在的关联，我们使用了线性或逻辑回归模型和Fisher检验（补充表1和3）。在SLE中，eHHV-6B与低血清补体水平、免疫抑制剂使用和泼尼松使用无关联（P值分别为0.46、0.79和0.76）。然而，eHHV-6B与SLE疾病活动性指数（SLEDAI）评分呈显著正相关23（eHHV-6B阳性SLE患者的平均SLEDAI=30.5，eHHV-6B阴性SLE患者的平均SLEDAI=6.0；P=1.3×10−8）。四名携带eHHV-6B的SLE患者中，有三名患者的SLEDAI评分非常高（≥18），这表明eHHV-6B可能对疾病活动性产生相当大的临床影响（图2b）。值得注意的是，四名eHHV-6B阳性的SLE患者中，有三名患者抗RNP抗体阳性，这通常在约33%的SLE患者中可见24，而第四名患者抗Scl-70抗体阳性，这在SLE中相当罕见。两名eHHV-6B阳性的SLE患者并发了其他自身免疫性疾病。一名抗RNP抗体阳性的患者患有硬皮病和干燥综合征，另一名抗Scl-70抗体阳性的患者患有硬皮病和抗磷脂综合征。鉴于这些不寻常的临床表现，先天性eHHV-6B阳性可能易导致非典型SLE发病。eHHV-6B与PAP中抗粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子自身抗体的滴度无关联（P=0.90），该抗体被认为是成人散发型PAP发病机制的核心25。
eHHV-6B在All of Us研究中也与SLE高风险相关
我们使用来自美国国家卫生研究院（NIH）All of Us计划的WGS数据，对SLE与eHHV-6之间的关联进行了一项独立的大规模验证研究26。All of Us队列中的参与者具有遗传多样性，且SLE的风险因祖先差异而异，因此我们使用逻辑回归模型在121,494名欧洲血统个体和整个243,247人的多祖先数据集中进行了关联测试（表2）。与日本发现队列一致，在两个群体中均未观察到eHHV-6A患病率的显著关联（P>0.15）。相比之下，eHHV-6B与SLE高风险相关，欧洲血统的调整后OR为2.7（95% CI=1.54-4.76；P=0.0020），多祖先群体的调整后OR为2.4（95% CI=1.47-3.82；P=0.0012）。这些结果表明，eHHV-6B与不同祖先的个体中的SLE相关。
SLE风险相关的eHHV-6B位于22号染色体（chr）q端
本研究中检测到的HHV-6基因组的测序深度约为每个参与者人类基因组测序深度的一半，这表明HHV-6序列与人类单倍型一起遗传（扩展数据图1a，b）。为了了解eHHV-6B在人类基因组中的位置，我们使用称为T2T-CHM13参考的常见变异体进行了全基因组关联研究（GWAS）。比较22名eHHV-6B阳性参与者和216名eHHV-6B阴性参与者后，我们发现chr22q远端变异体与eHHV-6B存在高度显著关联（图3a）。这一结果与之前使用Fisher检验的GWAS一致9，但使用T2T-CHM13作为参考提供了更密集的关联变异体集。我们聚焦于chr22q远端，进行了包括罕见变异体的逻辑回归分析（图3b，c和补充表4）。16个P<1×10−4的变异体跨越了一个500 kb的区域，包括不同的基因区域和不同的连锁不平衡（LD）块结构，但所有这些变异体与eHHV-6B均处于高度LD。通过使用30× PacBio HiFi长读长测序，我们证实这些标记变异体在四名eHHV-6B阳性的SLE患者中均位于同一单倍型上（图3d和扩展数据图1c）。这些GWAS结果反映了与HHV-6B基因组的LD关系，表明日本人群中的eHHV-6B整合在chr22q远端，并作为一个连锁单位一起遗传。所有标记变异体均为基因间或内含子变异体，因此不支持其致病性，而四名eHHV-6B阳性的SLE患者均携带与病毒再激活相关的全长HHV-6B基因组27（扩展数据图1b）。因此，可能是eHHV-6B本身，而不是标记变异体，参与了SLE的发病。
eHHV-6B在系统性红斑狼疮（SLE）单核细胞中诱导抗病毒反应
同时患有eHHV-6（人疱疹病毒6型）和SLE的参与者显示出对HHV-6肽具有特异性体液免疫的证据。由于SLE的特征是免疫细胞功能障碍，我们试图进一步研究eHHV-6B阳性SLE参与者的免疫发病机制。我们从同一组个体中收集了外周血单个核细胞（PBMCs），这些个体之前已接受PhIP-seq（相位相互作用测序）检测（4例eHHV-6B阳性SLE患者作为病例组，11例eHHV-6B阴性SLE患者作为对照组；补充表5）。
使用统一的单细胞分析流程（方法部分）处理后，我们从4例病例和11例对照组的PBMCs中获得了66,915个高质量细胞。在所有细胞中均未检测到HHV-6B基因的表达。使用Azimuth32对细胞进行注释（图5a）。为了识别比伪批量方法或混合模型更多的差异表达（DE）模式，我们应用了Milo33方法，并识别了2,818个邻域，其中没有一个显示出差异丰度（DA；空间假发现率（FDR）< 0.05）的证据，以及由至少共享五个细胞的邻域组成的20个邻域组（图5b和扩展数据图2a）。在排除几个细胞组以避免采样偏差后，进行了差异表达和基因本体论（GO）富集分析（图5c和扩展数据图2b-e）。GO分析显示，在注释为单核细胞和树突状细胞（DCs）的第6、7和18组细胞中，抗病毒反应被富集。为了评估病毒干扰素（IFN）反应，我们计算了每个邻域中细胞的抗病毒干扰素刺激基因（ISG）评分，并在病例组和对照组之间进行了比较。在第6、7和18组中，病例组的抗病毒ISG评分显著高于对照组（FDR < 0.05；图5d）。组内比较显示，病例组的平均评分在第6、7和18组中显著高于对照组，且差异大于其他组（图5e）。即使在使用免疫抑制剂的eHHV-6B阳性和eHHV-6B阴性患者之间，也观察到了上述抗病毒ISG评分的差异，这表明单核细胞和DCs中增强的抗病毒反应并非由免疫抑制剂引起（扩展数据图3a，b）。这些结果与表位映射揭示的eHHV-6B携带者和非携带者之间对HHV-6B的特异性免疫一致。
表1 | 日本人群中eHHV-6A/eHHV-6B与自身免疫性疾病及COVID-19的关联性
图2 | eHHV-6的流行率及eHHV-6B阳性SLE患者的SLEDAI（系统性红斑狼疮疾病活动指数）评分。a，五种自身免疫性疾病、COVID-19患者及健康对照者中eHHV-6A与eHHV-6B流行率的散点图。标记的大小表示每种疾病的样本量。红线表示eHHV-6的流行率=1%。b，无eHHV-6B与有eHHV-6B的SLE患者的SLEDAI评分箱线图。有eHHV-6B的SLE患者的SLEDAI评分显著高于无eHHV-6B的患者（eHHV-6B阳性与eHHV-6B阴性SLE患者的平均SLEDAI评分分别为30.5和6.0；双侧Wald检验P=1.3×10−8）。直方图显示了无eHHV-6B与有eHHV-6B的SLE患者数量分布（上方）。水平直方图显示了无eHHV-6B与有eHHV-6B的SLE患者的SLEDAI评分分布，以不同颜色表示（右侧）。箱线图中的箱子表示四分位数间距（IQR）；水平线表示中位数；须线延伸至1.5×IQR；异常值以单个点表示。
表2 | 在“All of Us”研究中关于eHHV-6A/eHHV-6B与系统性红斑狼疮（SLE）关联性的复制研究
图3 | 日本人群中整合至22号染色体长臂（chr22q）的eHHV-6B。a，曼哈顿图显示了当前全基因组测序（WGS）数据中与HHV-6B基因组的连锁不平衡（LD，r²）情况。c，基于常见变异的eHHV-6B全基因组关联研究（GWAS）（22例病例 vs 216例对照）的LD图。图中标注了千人基因组计划（1KG）中东亚人群的主要变异。d，热图表示的关联图针对chr22q的远端区域。虚线表示全基因组显著性水平（5×10⁻⁸）。b，22名eHHV-6B阳性参与者中16个变异的主要基因型区域图。我们通过30× HiFi长读长测序（扩展数据图1c）确认了这些变异在4名eHHV-6B阳性系统性红斑狼疮（SLE）患者中位于同一单倍型上。以参考单核苷酸多态性（SNP）ID（rs ID）标记P<1×10⁻⁴的16个变异。颜色阴影表示与千人基因组计划中东亚人群的主要变异之间的最大LD值（r²）。GWAS分析（双侧Wald检验）的未校正P值如图a和b所示。LRS，长读长测序；EAS，东亚人群。
图4 | 系统性红斑狼疮（SLE）患者体内人疱疹病毒6型（HHV-6）抗体表位映射。a，HHV-6蛋白上表位的检测。显示了指定参与者组的PhIP-seq（噬菌体免疫沉淀测序）评分均值。每个点表示通过应用于HHV-6A和HHV-6B蛋白的14个氨基酸滑动窗口分割的肽段的评分。标出了感兴趣的特定蛋白。b，三种HHV-6B蛋白上表位的检测。以热图形式显示了编码HHV-6B肽段的免疫沉淀噬菌体基因组的拷贝数。显示了含有丰富表位的三种HHV-6B蛋白。与eHHV-6B阳性相关的即刻早期A型反式激活子（IE-A）区域用橙色箭头标记（氨基酸476-490）。c，eHHV-6存在与编码HHV-6肽段的免疫沉淀噬菌体基因组拷贝数之间的统计关联。IE-A反式激活子的氨基酸476-490用橙色标记。显示了双侧Wald检验的未校正P值。红色水平线表示Bonferroni校正后的P值阈值（<0.05）。IS，使用免疫抑制剂；NC，无抗体对照；M，男性；F，女性。
环状病毒与自身免疫性疾病及COVID-19的关联性分析
在日本5,597份全基因组测序（WGS）样本中分析了环状病毒，排除了使用从细胞系提取的DNA进行WGS的参与者。我们估算了环状病毒的载量并进行了分层（方法见后）。在5,597名参与者中，689名环状病毒阳性参与者（12.3%，即环状病毒载量超过检测限的个体），57名参与者（1.0%）环状病毒载量>1.0被视为环状病毒感染，16名参与者（0.29%）环状病毒载量>8.0被视为环状病毒血症（表3，补充表6和扩展数据图4）。
使用逻辑回归模型和Fisher检验评估了三种环状病毒检测状态与每种疾病之间的相关性。系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿关节炎（RA）和COVID-19患者的环状病毒感染比例高于健康对照组（分别为4.8%、3.7%和1.7% vs 0.16%；mid-P值分别为3.6×10⁻¹⁰、7.4×10⁻¹⁰和2.9×10⁻⁷），且SLE、RA和COVID-19患者的环状病毒血症比例也高于健康对照组（分别为2.4%、0.79%和0.61% vs 0%；mid-P值分别为5.6×10⁻⁷、0.0023和3.3×10⁻⁴）。环状病毒感染与SLE、RA和COVID-19呈正相关，SLE的调整后比值比（OR）为58.5（95%置信区间[CI] = 15.6–293；P = 2.6×10⁻⁸），RA为15.4（95% CI = 4.89–68.2；P = 2.5×10⁻⁵），COVID-19为6.2（95% CI = 2.04–26.7；P = 0.0042）。同样，观察到的OR值量级大于之前报道的这些疾病的遗传和环境因素。
接下来，使用线性或逻辑回归模型和Fisher检验来识别环状病毒检测状态与SLE、RA和COVID-19的临床指标之间可能存在的关联（补充表1和3）。在SLE中，环状病毒与低血清补体水平、使用免疫抑制剂和使用泼尼松呈正相关，低血清补体水平参与者的调整后OR为4.4（95% CI = 1.46–19.5，P = 0.020），使用免疫抑制剂的参与者为3.0（95% CI = 1.51–6.03，P = 0.0020），使用泼尼松的参与者为2.2（95% CI = 1.05–5.21，P = 0.047；扩展数据图5a-d）。环状病毒检测状态与SLE疾病活动指数（SLEDAI）评分无关联。尽管环状病毒检测状态与类风湿因子（RF）或抗环瓜氨酸肽抗体（ACPA）的关联不显著，但所有RA患者中环状病毒血症者（n = 3）均为RF和ACPA阳性。重症COVID-19患者（n = 1,068）的环状病毒感染风险在统计学上并未显著增高，但所有COVID-19环状病毒感染者（n = 20）均患有重症。死于COVID-19的参与者中环状病毒感染者的比例在统计学上高于存活者（mid-P = 0.033）。
讨论
本研究使用了6,321份日本WGS数据集，以检验六种免疫介导性疾病与人类血液病毒组中的两种成分——内源性人疱疹病毒6型（eHHV-6）和环状病毒之间的关联。我们提供了这些病毒与多种自身免疫性疾病及COVID-19之间存在正相关的稳健证据。尽管这些病毒的患病率仍然较低，但观察到的疾病风险相对大于之前已知的遗传和环境因素，表明这些病毒对疾病生物学有实质性影响，并与临床医学相关。
我们使用WGS数据（一种检测eHHV-6的稳健方法[参考文献11]）来估算SLE和原发性抗磷脂抗体综合征（PAP）患者中eHHV-6B的较高患病率。健康对照组中eHHV-6的患病率为0.59%，与之前日本健康参与者的研究结果相似[34,35]。我们之前在以疾病为导向的日本生物样本库中对eHHV-6的调查发现，HHV-6B的患病率高于HHV-6A，这与我们使用健康对照组在此观察到的结果相反[9]。这与本研究的结果一致，即eHHV-6B（而非eHHV-6A）与多种疾病风险增加相关，并应激励开展更多的生物样本库规模研究。这也与“All of Us”队列的独立复制数据一致。
我们分析的多个方面支持SLE与eHHV-6B之间存在有意义的关联。患有eHHV-6B的SLE患者SLEDAI评分较高，提示HHV-6B在SLE发病机制和临床活动中发挥作用，且其中一半患者伴有其他自身免疫并发症。我们在患有SLE的eHHV-6B携带者中发现了针对HHV-6B的特异性免疫反应。这些发现与之前的研究一致，即报道了eHHV-6感染者对HHV-6编码蛋白IE1的抗体水平较高[19]，并对其他疱疹病毒表现出不同的适应性免疫反应和免疫基因表达模式[36]。抗IE-A反式激活子的抗体可能作为自身抗体发挥作用；然而，我们不能排除这些抗体是eHHV-6B辅助或触发的外源性HHV-6更广泛免疫激活的结果。疱疹病毒常编码免疫调节性病毒趋化因子受体[37]，而HHV-6编码趋化因子受体U12和U51[38]。这些病毒蛋白的表达也可能通过eHHV-6B导致病理性免疫激活。之前的一项研究发现SLE与循环HHV-6感染相关[39]。外周血单个核细胞（PBMC）的单细胞分析显示，单核细胞和树突状细胞（DC）的抗病毒反应增强。单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据显示，PBMC中无eHHV-6表达；然而，这并不排除我们观察到的针对eHHV-6B的体液免疫激活的可能性。在基因型-组织表达中，eHHV-6基因在除血细胞外的多种人体组织（如大脑和食管）中弱表达，且纳入个体时未考虑特定疾病[19]。患有SLE的eHHV-6B携带者可能是在SLE发病后获得了针对HHV-6B蛋白的抗体。尽管我们从当前数据集中无法确定针对IE-A反式激活子的B细胞激活时间，但eHHV-6B可能是导致SLE严重程度的一个因素，而非SLE的起始步骤。对“内免疫”假说以及eHHV-6B携带者T细胞激活特性的进一步研究，将为我们进一步揭示eHHV-6B在SLE中的免疫致病性。
使用T2T-CHM13进行的综合分析发现的与eHHV-6B高度连锁不平衡（LD）的变异不太可能是SLE的致病性变异。仅根据目前的关联结果，特别是在单一人群中，我们无法排除与eHHV-6B高度LD的变异是导致SLE风险增加的突变的可能性。然而，日本和欧洲人群中发现的eHHV-6B插入在不同的染色体上[9]。这意味着日本人群中与eHHV-6B高度LD的变异不同于欧洲人群中的变异。考虑到eHHV-6B在这两个人群中均与SLE相关，因此与eHHV-6B高度LD的变异在SLE中具有因果作用的可能性较小。此外，eHHV-6B是一种多态性，由于它不在参考基因组中，因此在之前的全基因组关联研究（GWAS）中被忽视，这补充增强了我们对人类疾病风险变异的了解。
图5 | 来自eHHV-6B阳性和eHHV-6B阴性系统性红斑狼疮（SLE）患者的外周血单个核细胞（PBMC）的单细胞RNA测序（scRNA-seq）。a，来自SLE患者参与者（eHHV-6B阳性4例，eHHV-6B阴性11例）的所有66,915个PBMC的scRNA-seq数据的UMAP嵌入。使用Azimuth通过标志基因的RNA表达定义了30种细胞类型。b，Milo识别的邻域的图形表示。节点表示邻域，按邻域组着色，其大小对应于每个邻域中的细胞数量。图的边表示相邻邻域之间共享的细胞数量。c，通过每个邻域组差异表达（DE）基因的GO分析富集的生物学过程。括号内指示每组中DE基因的总数。点颜色表示富集的统计学显著性（通过Benjamini-Hochberg方法调整的P值），点大小表示注释到每个术语的基因比率。d，如b所示，Milo识别的邻域的图形表示。节点颜色表示病例组（eHHV-6B阳性SLE患者，n=4）与对照组（eHHV-6B阴性SLE患者，n=11）在邻域内抗病毒干扰素刺激基因（ISG）评分均值的差异（空间假发现率（FDR）<0.05）。差异不显著的邻域（空间FDR≥0.05）着白色。仅包含病例组或对照组细胞的邻域着黑色。e，使用双侧配对t检验比较d中所示每个邻域组内的差异。Diff表示病例组和对照组均值之间的平均差异。箱线图表示四分位距（IQR）；中位数以水平条表示；须线延伸至IQR的1.5倍。*FDR<1.0×10−10，**FDR<1.0×10−50。ASDC，Axl+ Siglec-6+树突状细胞；pDC，浆细胞样树突状细胞；HPSC，造血干细胞和祖细胞；Treg，调节性T细胞；NK，自然杀伤细胞；TEM，效应记忆T细胞；ILC，固有淋巴样细胞；MAIT，黏膜相关不变T细胞；GDT，γδ T细胞；CTL，细胞毒性T细胞；Padj，调整的P值；Nhood，邻域。
表3 | 日本个体中，环状病毒感染和病毒血症与自身免疫性疾病和COVID-19的关联
环状病毒的特征在于其巨大的遗传多样性40–42，在利用全基因组测序（WGS）数据检测和评估其病毒载量时，必须考虑这一点。在此，我们通过综合使用超过3,000条环状病毒参考序列来实现这一目标。然而，与任何基于比对的方法一样，我们受限于这些参考基因组代表该群体中病毒多样性的程度。与人疱疹病毒6型（HHV-6）的种系整合不同，患者体内的环状病毒状态预计不会与患者衍生的细胞系相匹配。因此，我们分析了5,597份日本血液WGS样本，并评估了三种连续环状病毒检测状态的比例。在系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿关节炎（RA）和COVID-19患者的血液中，经常发现环状病毒载量升高。有趣的是，COVID-19患者的环状病毒阳性比例与健康对照组相似，但其中环状病毒感染和病毒血症的比例显著高于健康对照组。一种可能的情况是，这些疾病（或治疗）特有的非典型免疫状态允许环状病毒在血液中达到更高水平43,44。这也得到了SLE中环状病毒阳性与免疫抑制剂和/或泼尼松使用之间观察到的关联的支持。SLE中环状病毒阳性与低补体水平之间的关联表明，与其他病毒感染类似，补体缺陷使SLE患者易于感染环状病毒45,46。另一种可能性是，较高的环状病毒水平有助于导致这些诊断的免疫反应和炎症。先前的研究表明，环状病毒DNA可以诱导促炎细胞因子47,48，这表明较高的环状病毒载量是急性呼吸道病毒感染期间严重炎症的驱动因素，并可能诱发自身免疫反应。尽管关于环状病毒与人类疾病之间因果关系的高质量证据有限，但从一名多发性硬化症（MS）患者的脑脊液中分离出了能识别环状病毒（ torque teno 病毒）的克隆性扩增CD4+ T细胞49。值得注意的是，我们的结论与参考文献50的结论相似，即可检测到（任何水平）的 torque teno 病毒DNA在SLE或RA患者中的患病率并不高于健康对照组。然而，我们确实观察到，SLE和RA患者更有可能出现环状病毒DNA水平升高，这支持了环状病毒复制可能参与自身免疫性疾病的假设。要充分评估这一点，需要进行纵向研究，而不是横断面研究。值得注意的是，在我们的结果中，致命性COVID-19患者中环状病毒感染者的数量增加，这与环状病毒载量可能在病情更严重的COVID-19患者中更高的假设一致。
尽管只有少数个体携带内源性人疱疹病毒6型（eHHV-6）或高载量的环状病毒，但阳性结果似乎对疾病风险和临床表型有显著影响，特别是与这些疾病先前已确定的遗传和环境因素相比20–22。这表明，这些病毒在个体病毒组中的存在是这些疾病的潜在临床有用生物标志物，有助于采取个性化医疗方法预防疾病。除了疾病风险外，eHHV-6还可能是临床实践中的一个重要因素，例如细胞疗法51。随着临床WGS的普及，整合分析病毒组的生物信息学流程可能是一种成本效益高的筛查这些个体的方法。内源性病毒或病毒感染与免疫相关疾病之间的联系是基础科学和临床科学中长期存在的谜团。本研究提供了部分缺失的信息，并概述了一条路径，即通过该路径可以将人类病毒组的研究整合到人类WGS通常收集的基因型-表型关联分析中。需要更多的临床和转化研究来更好地评估eHHV-6和环状病毒调节免疫的病理相关机制。
