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摘要：
香橼（Citrus medica L.）是一种富含生物活性化合物的传统柑橘类水果，具有作为天然食品添加剂来源的潜力。本研究旨在评估香橼果皮（包括外果皮和内果皮）、果肉和种子的抗氧化能力，并鉴定其酚类化合物成分。结果显示，与其他部分相比，果肉的抗氧化活性系数（AAC）显著较高，为168.2。内果皮和种子的AAC值显著较低，而绿色和黄色外果皮则表现出值得注意的结果。在所有香橼部分中，阿魏酸是主要的酚酸，在内果皮中的浓度最高，为37.54 µg/g鲜重（FW）。黄烷酮和黄烷醇是果肉、果皮和种子中的主要黄酮类化合物，总黄酮浓度从种子中的约9 µg/g FW到果肉中的508 µg/g FW不等。本研究为这种古老水果的抗氧化特性提供了重要见解，强调了其作为天然抗氧化剂来源在不同应用中的潜在价值。
1. 引言
香橼（Citrus medica L.）是一种大型芳香的黄色柑橘类水果，形似柠檬（图1a）。香橼被认为是柑橘属的一个古老物种，属于芸香科，是许多不同栽培品种的原始柠檬[1]。香橼也被称为“佛手柑”，文献中还报道了其他名称，如“指状香橼”[2]。
香橼的一个主要特征是果皮占果实总质量的70%以上，而果肉（或内果皮）和种子则占果实重量的较小部分（图1b）[2]。香橼果皮，或外果皮，与其他柑橘类水果一样，分为外果皮（flavedo）和内果皮（albedo）[3]。内果皮，或称中果皮，是香橼果皮中白色的海绵状纤维素组织，富含果胶，是香橼果皮的主要部分。外果皮，或称外果皮，是含有油腺的着色外周区域，富含精油。
香橼因其药用特性而广受欢迎。传统上，香橼被用作治疗感冒、咳嗽、胃肠道疾病和止痛的药物[2,4]。多项研究报道了其抗炎[5]、抗糖尿病[6,7]以及细胞毒性活性[8]。
尽管香橼具有诸多益处，但其在食品工业中的应用却非常有限。香橼果皮常被糖渍或用于制作一种名为“cedrata”的非酒精饮料，在意大利广受欢迎[9,10]。由于香橼具有柑橘香气和含有柠檬烯，大多数生产的香橼被制药和化妆品行业加工以提取精油[11]。
然而，香橼果皮富含生物活性化合物，在食品工业中可能有更多应用，以减少食物浪费。例如，香橼果皮提取物被用作抗氧化剂来稳定葵花籽油，有效防止了油在65°C储存5天过程中的氧化[12]。之前的研究中，香橼果皮精油被用作即食沙拉中的抗菌剂，有效抑制了腐败菌和致病菌如单核细胞增生李斯特菌和大肠杆菌的生长[13]，并且其抗菌活性已有报道[14–16]。由于果皮占比较高且富含酚类化合物，香橼果皮显示出作为天然食品添加剂来源的巨大潜力。
本文旨在对香橼（Citrus medica L.）进行全面研究，包括通过直接和间接方法评估其抗氧化能力，测定总酚和总黄酮含量，以及通过超高效液相色谱结合高分辨率质谱（UHPLC-ToF-MS）分析单个酚类化合物谱。鉴于香橼果实的全面利用，本文比较了果实的不同部分，包括果皮（包括外果皮和内果皮）、果肉和种子，旨在提升这种传统柑橘类果实的价值。
图1. 香橼（Citrus medica L.）：(a) 成熟果实的整体外观；(b) 香橼果实的垂直剖面图。
2. 结果与讨论
2.1 抗氧化能力测定
使用β-胡萝卜素漂白法和DPPH自由基清除法评估了香橼（Citrus medica L.）果实各部分的抗氧化潜力。各果实部分的抑制百分比（IP%）和抗氧化活性系数（AAC）如表1所示。
表1. 使用两种方法（DPPH自由基清除法和β-胡萝卜素漂白法）评估香橼（Citrus medica L.）不同部分（包括果肉、果皮和种子）的抗氧化能力
结果显示，在果实的不同部分中，果肉的抗氧化活性系数（AAC）显著高于其他部分（168.2）。虽然绿色和黄色外果皮显示出较高的AAC值（分别为117.9和111.3），但内果皮和种子的AAC值则低得多。这些结果与Menichini等人[17]发表的结果一致，作者指出中果皮（果肉）的AAC高于内果皮（种子）。然而，无论是未成熟还是成熟果实，我们的结果似乎都远高于他们的结果，因为他们的最高种子AAC为7.1，而我们的为19.87。同样的情况也适用于中果皮。
DPPH清除实验的结果模式与之前β-胡萝卜素漂白实验的结果模式相似，果肉是抑制百分比最高的部分（18.38%），其次是外果皮。然而，在这种情况下，黄色外果皮的抑制百分比显著高于绿色外果皮。此外，内果皮的抑制百分比（3.81%）略低于种子的抑制百分比（5.46%），这与β-胡萝卜素漂白实验的结果相反。
2.2 酚类特性测定
在其他两个实验——总酚含量（TPC）和总黄酮含量（TFC）实验中，评估了对抗氧化性能有贡献的化合物含量。这两种化合物的评估结果汇总在表2中。
表2. 香橼（Citrus medica L.）不同部分（包括果肉、果皮和种子）的总酚含量（TPC）和总黄酮含量（TFC）
关于总酚含量（TPC）：外果皮中酚类化合物的含量最高，但黄色和绿色部分之间存在显著差异（p < 0.05）。内果皮部分的酚类含量最低，为447.1 µg没食子酸当量（GAE）/g鲜果（FW）。结果表明，抗氧化能力最强的部分并不一定是酚类含量最高的部分，这可能是由于果实中存在其他提供抗氧化能力的化合物，如维生素（主要是维生素C，但也包括维生素A、B和E）、花青素，甚至类胡萝卜素[18]。在最近一篇研究不同柑橘品种TPC的论文中，Hasan等人[19]报告了香橼果汁的TPC值为6–7 mg GAE/100 g。如果我们将其转换为作者选择的浓度单位（即56.45 mg GAE/100 g），则这一浓度远低于我们观察到的果肉TPC值（果肉是果汁的提取部分）。然而，Menichini等人[17]报告了香橼中果皮和内果皮的TPC值分别为123.1和109.4 mg绿原酸当量（CAE）/100 g FW，这些结果与我们的结果更为接近（56.45和71.36 mg GAE/100 g），但即便如此，他们在酚类含量较高的部分上也有所不同。另一方面，Fratianni等人[9]报告称，香橼品种的外果皮TPC为1002.3 µg GAE/g FW，果肉TPC为242.73 µg GAE/g FW，这与我们的结果更为一致。
果肉的总黄酮含量（TFC）最高（432.9 µg表儿茶素当量（EE）/g果实），其次是内果皮（339.3 µg EE/g FW）、外果皮（黄色和绿色分别为149.1和146.2 µg EE/g FW），种子中的TFC最低（26.18 µg EE/g FW）。关于香橼中的这些化合物，Menichini等人[17]发现中果皮的TFC为43.1 mg槲皮素当量（QE）/100 g，这与我们果肉中的43.3 mg EE/100 g几乎相同。作者还报告了内果皮的TFC为37.5 mg QE/100 g，其黄酮类化合物浓度远高于我们在种子中检测到的浓度（2.618 mg EE/100 g）。
2.3 单个酚类化合物的测定
2.3.1 酚酸
使用超高效液相色谱结合高分辨率质谱（UHPLC-ToF–MS）对28种单个酚类化合物进行了定量，采用之前验证过的方法（表S1）。结果显示，在香橼的果肉、果皮和种子中，14种酚酸中有4种羟基肉桂酸衍生物被定量，总酚酸含量如下：内果皮（37.54 µg/g）>绿色外果皮（33.96 µg/g）>黄色外果皮（20.24 µg/g）>果肉（13.74 µg/g）>种子（1.81 µg/g），如表3所示。然而，Dadwal等人[20]发现种子是香橼中酚酸含量最高的部分，富含绿原酸和咖啡酸（分别为210.40 µg/g和155.87 µg/g），其次是内果皮、外果皮和果肉，其中鉴定出了对香豆酸、反式阿魏酸、没食子酸、绿原酸、咖啡酸和反式肉桂酸。此外，Fratianni等人[9]发现果肉中酚酸含量更丰富，其中阿魏酸（113.91 µg/g）和没食子酸（22.16 µg/g）是主要被定量的酚酸。在外果皮中，没食子酸是唯一被鉴定的酚酸（39.02 µg/g）[9]。
在所有香橼部分中，阿魏酸是主要的酚酸，内果皮中的含量最高（37.54 µg/g FW），种子中的含量最低（0.89 µg/g FW）。内果皮是香橼中最丰富的部分，且含有较高浓度的阿魏酸，这是唯一被定量的酚酸。阿魏酸和对香豆酸均在果肉、外果皮和种子中被定量。在所有柑橘部分中，阿魏酸的浓度均高于对香豆酸。唯一的例外是种子，其中阿魏酸和对香豆酸的含量相似。这些结果与最近一项关于香橼的研究结果一致，该研究在所有柑橘部分中均检测到了对香豆酸，且外果皮（28.09 µg/g）和内果皮（21.46 µg/g）中的含量较高，果肉（3.90 µg/g）和种子（3.99 µg/g）中的含量较低[20]。果肉中阿魏酸的色谱图如图2所示。
表3. 使用UHPLC-ToF-MS测定的香橼（Citrus medica L.）不同部分（包括果肉、果皮和种子）的总酚酸和单个酚酸含量（μg/g FW）
图2. 使用MultiQuant™ 3.0软件获得的香橼果肉样品中四种主要化合物的色谱图（强度与时间（分钟）的关系）：柚皮苷（保留时间=4.25分钟）、橙皮苷（保留时间=4.68分钟）、芦丁（保留时间=4.25分钟）和阿魏酸（保留时间=5.11分钟）。
在黄色外果皮中检测到的酚酸数量最多，其中阿魏酸含量较高（9.52 µg/g FW），反式阿魏酸含量较低（1.28 µg/g FW）。绿原酸仅在黄色外果皮中检测到，含量为5.54 µg/g FW。绿原酸的含量比Dadwal等人[20]描述的香橼外果皮中绿原酸的含量（109.85 µg/g）低20倍。尽管黄色外果皮中存在绿原酸而绿色外果皮中不存在，但比较绿色和黄色外果皮的总酚酸含量，我们可以得出结论，成熟过程会导致酚酸含量的降低。
2.3.2 黄酮类化合物
结果显示，在14种黄酮类化合物中，鉴定出9种化合物，如表4所示。黄烷酮和黄烷醇是香橼果肉、果皮和种子中的主要黄酮类化合物类别，总黄酮含量如下：果肉（507.58 µg/g）>内果皮（169.40 µg/g）>黄色外果皮（85.29 µg/g）>绿色外果皮（78.54 µg/g）>种子（9.16 µg/g）。
表4. 使用UHPLC-ToF-MS测定的香橼（Citrus medica L.）不同部分（包括果肉、果皮和种子）的总黄酮和单个黄酮含量（µg/g FW）
3. 材料与方法
3.1 果实样品及制备
从葡萄牙北部（米尼奥地区）的一个果园采集香橼果实样品，并将其分为五个部分：种子、果肉、内果皮以及外果皮（黄色和绿色部分）。比较了两种不同成熟状态的果实（每种5千克），一种是绿色外果皮，另一种是更成熟的黄色外果皮。将五个部分分别用研磨机均质化。将2克均质化样品称入50毫升Falcon管中，并与20毫升95%乙醇在Ultra Turrax® T25（Janke and Kunkel IKA，斯塔芬，德国）中混合。将试管在20°C下以2250×g离心10分钟，分离上清液以进行抗氧化能力测定。对于UHPLC酚类化合物分析，将2克相同的均质化样品与10毫升甲醇：超纯水：甲酸（49.95:49.95:0.10 v/v/v）混合，并超声处理10分钟。将溶液振荡15分钟后，在20°C下以2250×g离心10分钟。将上清液转移到另一个Falcon管中，并用额外的10毫升溶剂重复提取。将第二次提取物与第一次提取物合并。
3.2 化学品与试剂
酚类化合物标准品（4-羟基苯甲酸、芹菜素、咖啡酸、儿茶素、绿原酸、鞣花酸、表儿茶素、柚皮苷、圣草酚、没食子酸、龙胆酸、橙皮苷、木犀草素、柚皮素、新绿原酸、阿魏酸、对香豆酸、根皮苷、没食子酸丙酯、槲皮素、槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷、芦丁、樱草素、芥子酸、丁香酸、反式阿魏酸和香草酸）以及其他试剂（2,2-二苯基-1-苦基肼基自由基（DPPH）、（±）-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）、福林-肖卡试剂、碳酸钠、亚硝酸钠、氯化铝、氢氧化钠、β-胡萝卜素、氯仿、Tween® 40和亚油酸）均购自Sigma-Aldrich（圣路易斯，密苏里州，美国）。乙醇和甲醇溶剂购自霍尼韦尔（夏洛特，北卡罗来纳州，美国）。水通过Millipore（伯灵顿，马萨诸塞州，美国）的Milli-Q plus系统纯化，电阻率为18.2 MΩ×cm。
3.3 抗氧化能力测定
3.3.1 β-胡萝卜素漂白测定法
按照Miller[22]开发的方法，研究了各部分提取物的抗氧化能力，该方法基于底物（β-胡萝卜素/亚油酸）的共氧化模型。首先，制备了0.2 mg/mL的β-胡萝卜素氯仿溶液。然后，将2毫升该溶液与20毫克亚油酸和200毫克Tween® 40乳化剂混合。随后，使用旋转蒸发器蒸发溶剂。同时，将一定量的超纯水氧化约30分钟。将100毫升这种氧化水与蒸发的混合物彻底混合，制备出用于本测定的β-胡萝卜素乳液。将5毫升乳液加入200微升每个样品中，并在55°C水浴中保持120分钟。在此过程开始时，使用分光光度计（U-2810，日立，迪吉拉布，悉尼，新南威尔士州，澳大利亚）在470纳米处读取对照空白样品的吸光度。在此时间结束时，读取样品和对照的吸光度。抗氧化活性系数（AAC）通过以下公式计算：
其中，A0对照是初始时间对照的吸光度，A120对照是120分钟后对照的吸光度，A样本是样品在120分钟水浴后的吸光度。所有实验均重复三次。
3.3.2 DPPH自由基清除测定法
按照Moure等人[23]的方法进行本实验。简而言之，将50微升样品加入到2毫升DPPH自由基溶液（14.2 g/mL）中，并在15毫升Falcon管中避光放置30分钟。使用分光光度计（U-2810，日立，迪吉拉布，悉尼，新南威尔士州，澳大利亚）在515纳米处测量吸光度。以Trolox（6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸）为标准品绘制校准曲线（y = 0.8457x - 3.2621，r² = 0.9980），浓度范围为5至100 µg/mL。结果表示为每克果实中的微克Trolox当量（TE）。抑制百分比使用以下公式估算：
其中，A对照代表对照吸光度，A样本代表样品吸光度。所有实验均重复三次。
3.4 酚类特性评估
3.4.1 总酚含量（TPC）评估测定法
为了评估香橼提取物的酚类含量，采用了Singleton等人[24]描述的方法。简而言之，将1毫升样品与7.5毫升Folin-Cioucalteu试剂（10% v/v）混合，放置5分钟，然后加入7.5毫升Na₂CO₃（60 mg/mL）。120分钟后，在725纳米处读取吸光度。使用不同浓度的没食子酸（5–150 µg/mL）获得校准曲线（y = 0.0065x - 0.0057，r² = 0.9997）。结果表示为每克果实中的微克没食子酸当量（GAE）。所有实验均重复三次。
3.4.2 总黄酮含量（TFC）评估测定法
为了估算香橼各部分提取物中的总黄酮含量，采用了Yoo等人[25]开发的方法。简而言之，将1毫升样品提取物和4毫升超纯水与0.3毫升亚硝酸钠（50 mg/mL）混合，并涡旋几秒钟。5分钟后，向混合物中加入0.6毫升氯化铝（100 mg/mL），并再次涡旋。6分钟后，向混合物中加入2毫升氢氧化钠（40 mg/mL）和2.1毫升超纯水。立即在510纳米处读取吸光度。使用不同浓度的表儿茶素溶液（5至150 µg/mL）分析校准曲线（y = 0.0017x + 0.0165，r² = 0.9986）。结果表示为每克果实中的微克表儿茶素当量（EE）。所有实验均重复三次。
3.5 UHPLC-ToF-MS条件及酚类化合物检测
使用Nexera X2 Shimadzu UHPLC与5600+ ToF-MS检测器（SCIEX，福斯特市，加利福尼亚州，美国）联用，配备Turbo Ion Spray电喷雾电离源，在正离子模式下（ESI+）运行，对单个酚类化合物进行检测和定量。在这些过程中，使用了Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm × 100 mm，1.7 µm）分析柱。柱子和自动进样器均保持在20°C。色谱分离在梯度模式下进行，使用0.1%甲酸水溶液（洗脱液A）和含有0.1%甲酸的乙腈（洗脱液B）作为流动相。梯度程序如下：0–0.5分钟90% [A]；0.5–8分钟，从90%降至20% [A]；8–8.1分钟20% [A]，总运行时间为8.1分钟，进样体积为20微升。在质谱方面，使用Analyst® TF 1.7软件（SCIEX，福斯特市，加利福尼亚州，美国）在全扫描模式下从100到750 Da进行采集，并使用了以下参数：离子源电压为5500 V；源温度为575°C；幕帘气（CUR）为30 psi；Gas 1和Gas 2为55 psi；去簇电压（DP）为100 V。为了提供准确的质谱分辨率，ToF-MS检测器在方法的质谱范围内每六次注射校准一次。
使用PeakView™ 2.2和MultiQuant™ 3.0软件（SCIEX，福斯特市，加利福尼亚州，美国）进行酚类化合物的鉴定和数据处理。PeakView™ 2.2软件会自动呈现同位素匹配。为了鉴定酚类化合物，使用了两个参数及其相应的方程：（1）最大保留时间偏差（∆RT）为0.1分钟（方程（3））；（2）精确质量偏差（∆m）为5 ppm（方程（4））。
其中，RT为保留时间。
3.6 统计分析
使用IBM® SPSS® Statistics版本28.0.1.1（芝加哥，伊利诺伊州，美国）对数据进行统计分析，采用单因素方差分析（ANOVA）。显著性定义为p < 0.05。当数据正态性和方差齐性通过适当的统计检验得到验证时，应用ANOVA比较均值。使用Tukey检验检查平均值之间的差异。关于统计评估的结果表示为三个重复的平均值加上标准差（SD）。
4. 结论
综上所述，香橼（Citrus medica L.）的果肉和果皮是柑橘类水果中抗氧化能力和酚类化合物含量最高的部分。比较抗氧化能力和单个酚类化合物，结果表明黄酮类化合物是负责抗氧化能力的主要酚类化合物，因为果肉是黄酮类化合物含量最高且抗氧化能力最强的部分。黄烷酮是黄果肉和内果皮中黄酮类化合物的主要类别。此外，成熟状态影响外果皮中酚类化合物的组成，导致酚酸含量降低，并且主要黄酮类化合物从芦丁转变为樱草素。
本研究为这种古老水果的抗氧化特性提供了有价值的信息，强调香橼具有作为天然抗氧化剂优秀来源的潜力。在食品工业中，香橼可用于开发功能性食品，促进人类健康，延缓食品氧化。此外，香橼赋予柑橘风味，因此可用于化妆品和香料工业。除了柚皮苷、橙皮苷、樱草素和芦丁的抗氧化活性外，这些香橼中的主要酚类化合物还表现出抗炎、抗糖尿病和抗癌活性[26–28]；因此，香橼可用于制药工业制备新配方和食品补充剂。香橼的价值提升对于强化其在柑橘类水果使用中的地位至关重要，因为其数量的减少可能会导致其所在生态系统运作出现问题。
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