点击上方蓝字关注我们
摘要
可溶性环氧化物水解酶（sEH）和促炎细胞因子与心血管和炎症疾病抑制剂的开发密切相关。本文报道了从香薷（Elsholtzia ciliata (Thunb.) Hyl.）地上部分分离得到的四种天然sEH抑制剂。这四种化合物，分别命名为1～4，具体为木犀草素-7-O-葡萄糖苷（1）、元胡宁（2）、芹菜素-7-O-葡萄糖苷（3）和丁香醛-4-O-葡萄糖苷（4）。其中，化合物2和4系首次从该植物中报道。在体外和计算机模拟实验中，这些化合物在微摩尔浓度下对sEH表现出抑制活性。此外，它们还能抑制聚肌胞苷酸（poly(I:C)）刺激的RAW264.7细胞中的促炎细胞因子。值得注意的是，化合物4显著下调了sEH催化反应、一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2）的产生，以及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、环氧化酶-2（COX-2）、白细胞介素-6（IL-6）mRNA和sEH mRNA的表达水平。因此，丁香醛-4-O-葡萄糖苷（4）是一种具有潜力的sEH抑制剂，可能适用于治疗由感染引起的炎症和心血管疾病。
引言
心血管疾病是全球主要的死亡原因之一。2019年，约有1700万人死于此类疾病，占全球死亡总数的32%。其中，85%的死亡是由于心脏病发作和中风引起的[1]。花生四烯酸在细胞色素P450环氧化酶的催化下转化为环氧二十碳三烯酸（EETs）[2]。EETs存在四种区域异构体（5,6-、8,9-、11,12-和14,15-EETs），是内皮细胞衍生的超极化因子[3]。这些EETs具有抗凋亡、抗炎、血管舒张和抗血管生成特性[2]，通过干扰核因子κB向细胞核的转录来抑制炎症[3,4]。可溶性环氧化物水解酶（sEH；EC: 3.3.2.10）是一种140 kDa的同源二聚体，由C端和N端水解酶组成的α/β水解酶[5]。前者是一种将二羟基二十碳三烯酸（DHETs）转化为EETs的三元氧杂环丙烷环的酶[5]。后者使异戊烯基磷酸和溶血磷脂酸磷酸化，这些物质参与细胞生长[5]；然而，磷酸酶在生物活性中的作用尚不清楚[6]。sEH由Ephx2基因编码，在肝脏、肺脏、肾脏、心脏、大脑、肠道和血管内皮等组织中广泛表达[7]。对sEH基因敲除小鼠模型的研究报告显示，收缩压和DHET水平降低，同时EETs水平和存活率提高[8]。sEH由Tyr381和Tyr465组成，它们与环氧化物的氧原子和催化口袋中的亲核残基（催化三联体Asp333-Asp495-His523）相互作用[9]。最早的sEH抑制剂来自查耳酮氧化物和苯基缩水甘油醚[9]。1999年，开发了尿素骨架抑制剂N,N'-二环己基脲（DCU）和N-环己基-N'-(3-苯基丙基)脲[9]。随后，通过在DCU中添加柔性侧链，开发出了12-(3-金刚烷-1-基-脲基)十二烷酸（AUDA）[10]。EC5026是由EicOsis Human Health Inc.开发的一种尿素型sEH抑制剂，以即释口服剂型装在明胶胶囊中，旨在治疗神经性疼痛[11, 12]。然而，这种合成sEH抑制剂在水中的溶解度低，且与异常血管生成等副作用相关[12, 13]；因此，鉴定和研究天然sEH抑制剂具有重要意义。
香薷（Elsholtzia ciliata (Thunb.) Hyl.）是唇形科的一种一年生植物，分布于韩国、中国和欧洲[14]。它含有挥发性和酚类化合物，已被用作药物和食品成分[15]。其成分包括查耳酮、苯丙素、黄酮和苯甲酸衍生物，具有神经保护作用[16]；该植物的提取物已被研究用于治疗心血管疾病、神经退行性疾病、肥胖和癌症的潜在用途[15]。在本研究中，我们从香薷中分离出了四种天然sEH抑制剂，即化合物1～4。我们还表征了它们的化学构象，并测试了它们抑制酶活性和细胞因子水平的能力。
材料与方法
一般实验程序
一维核磁信号使用AVANCE III-400光谱仪（Bruker，美国）获取。分析型薄层色谱（TLC）分别在预涂层的正相和反相（Merck，美国）板上进行。柱色谱使用硅胶（60 Å，230～400目ASTM；Merck，德国）和C-18硅胶（ODS-A，S-75 μm；YMC，日本）进行。板上的斑点在紫外光（254 nm）和10% H₂SO₄下可视化，然后在300°C下加热30秒。甲醇-d4（441384）、二甲基亚砜-d6（151874）、2-氨基-2-（羟甲基）-1,3-丙二醇（Tris，目录号T6066）、牛血清白蛋白（BSA，A7906）、Griess试剂、蛋白酶抑制剂和聚肌胞苷酸钠盐（poly(I:C)）购自Merck；人重组sEH（10011669）、3-苯基-氰基(6-甲氧基-2-萘基)甲基酯-2-氧杂环丙烷乙酸（PHOME，10009134）和AUDA（10007972）购自Cayman Chemical（美国）。胎牛血清（FBS）和Dulbecco's改良Eagle培养基（DMEM）购自Gibco（美国）。青霉素-链霉素、胰蛋白酶-EDTA（0.25%）PowerTrack SYBR Green Master Mix和RIPA裂解和提取缓冲液购自Thermo Fisher Scientific（美国）。EZ-Cytox试剂和EZ-western试剂盒购自DoGenBio（韩国）。Bio-Rad蛋白测定试剂盒购自Bio-Rad（美国）。环氧化酶-2（COX-2）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）一抗购自Cell Signaling Technology（美国）。β-肌动蛋白一抗和HRP偶联二抗购自Santa Cruz Biotechnology（美国）。PGE2和IL-6 ELISA试剂盒购自R&D Systems（美国）。GeneAll Ribospin II提取试剂盒购自GeneAll Biotechnology（韩国）。PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit购自Takara Bio Inc.（日本）[17]。
植物材料
香薷的地上部分于2023年3月采自韩国京畿道的一家草药店，并经J.H. Kim博士鉴定。凭证标本（EC2303–1）存放于韩国国立园艺与草药科学研究所药用作物研究部标本馆[17]。
提取与分离
香薷样品（5 kg）用36 L乙醇提取两次，总共提取14天。提取液在真空下浓缩，悬浮于水中，并依次用正己烷、乙酸乙酯和水层进行分配。乙酸乙酯部分通过硅胶柱色谱，使用梯度溶剂系统（CHCl₃:MeOH，20:1至1:1）进行色谱分离，得到E1～E10部分。E7部分通过C-18柱色谱，使用梯度溶剂过程（H₂O:MeOH，2:1至1:2）进行色谱分离，得到化合物1（200 mg）和E71～E75部分。化合物2（98 mg）通过C-18柱色谱，使用等度溶剂系统（60% MeOH）从E73部分中分离得到。E9部分通过C-18柱色谱，使用等度溶剂系统（55% MeOH）进行分离，得到化合物3（45 mg）和化合物4（29 mg）[15]。
sEH抑制实验
在96孔板中，将130 μl重组人sEH（100 ng/ml）溶于25 mM Tris-HCl（pH 7.2）含0.1% BSA的缓冲液中，加入20 μl甲醇中的分离化合物。然后向混合物中加入50 μl 20 μM底物（3-苯基-氰基(6-甲氧基-2-萘基)甲基酯-2-氧杂环丙烷乙酸，PHOME）。在37°C下监测反应40分钟。使用荧光光度计（发射波长：465 nm；激发波长：330 nm）测量产物相对荧光单位（RFU）。抑制百分比计算如下：
其中，ΔC和ΔI分别是40分钟后甲醇和抑制剂的RFU信号差异。
其中，y0是y轴上的最小值，“a”表示最大值和最小值之间的差异，“b”指50%时的x值。
分子对接预测
使用Chem3D Pro（CambridgeSoft，美国）绘制并优化了抑制剂木犀草素-7-O-葡萄糖苷（1）、元胡宁（2）、芹菜素-7-O-葡萄糖苷（3）和丁烯-4-O-葡萄糖苷（4）的三维结构。从RCSB蛋白质数据库下载了3ANS pdb文件，并去除了数据中的非酶底物。使用AutoDockTools（Scripps Research，美国）为其添加氢原子，随后添加Gasteiger电荷。对于分子对接，通过检测配体的扭转根和可旋转键来分配扭转树。对于盲对接，将网格框设置为包含整个酶的大小（126 × 126 × 126，网格间距0.375 Å）。作为对接条件，使用了最大评估次数，并采用了拉马克遗传算法。使用LigPlot（欧洲生物信息学研究所，英国）来可视化结果[17, 18]。
预测对接的分子动力学
使用Gromacs软件模拟可溶性环氧化物水解酶（sEH）与丁烯-4-O-葡萄糖苷的对接结果。为sEH分配了CHARMM全原子力场。在GGenFF服务器上，将丁烯-4-O-葡萄糖苷创建为STR文件，然后使用CHARMM36-ff将其转换为.gro和.itp文件。将sEH-丁烯-4-O-葡萄糖苷复合物置于含有H2O和钠离子的立方盒中，采用简单点填充法。模拟按照之前报道的方法进行[18]。最后，进行了100 ns的分子动力学计算。使用SigmaPlot（美国）和Chimera（美国）记录结果[17, 18]。
细胞培养
RAW264.7细胞系购自ATCC（美国）。细胞在补充有10%胎牛血清（FB）和1%抗生素（100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素）的DMEM溶液中培养，并在37°C、5% CO2的培养箱中维持。
细胞活力
使用EZ-Cytox试剂分析细胞活力。将RAW264.7细胞（2 × 10^5细胞/ml）接种到96孔板中，并在37°C下培养24小时。然后，用抑制剂（0–50 μM）处理细胞，并在37°C下继续培养。孵育24小时后，向每孔加入10 μl EZ-Cytox试剂。随后，使用分光光度计（Tecan Group，瑞士）在4小时后测量每孔的吸光度（450 nm）。吸光度与活细胞数量相关。
抑制剂对一氧化氮产生的抑制活性
将RAW264.7细胞（2 × 10^5细胞/ml）接种到48孔板中培养24小时，并用50 μM浓度的抑制剂预处理1小时。然后，用50 μg/ml的poly(I:C)刺激细胞。再孵育24小时后，将100 μl细胞上清液和100 μl Griess试剂混合到96孔板中。混合物在室温下孵育10分钟，然后在540 nm处测定吸光度以量化一氧化氮（NO）的产生。根据实验中绘制的亚硝酸钠标准曲线确定NO的浓度。
抑制剂对PGE2和IL-6产生的抑制活性
将RAW264.7细胞（2 × 10^5细胞/ml）接种到48孔板中培养24小时，并用50 μM浓度的抑制剂预处理1小时。然后，用50 μg/ml的poly(I:C)刺激细胞，并继续培养24小时。收集细胞培养上清液，并使用ELISA试剂盒根据制造商的协议测量PGE2和IL-6的产生。
对iNOS和COX-2蛋白的抑制活性
将RAW264.7细胞（2 × 10^5细胞/ml）接种到6孔细胞培养板中培养24小时，并用50 μM的抑制剂预处理。1小时后，用50 μg/ml的poly(I:C)刺激细胞24小时。收获细胞并使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解。量化蛋白质浓度后，将30 μg蛋白质在120 V下于SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离1小时。然后，将蛋白质在100 V下转移到PVDF膜上1小时。随后，用5%脱脂牛奶封闭膜，用TBS-T缓冲液洗涤，并在4°C下与COX-2和iNOS抗体孵育过夜。用TBS-T缓冲液洗涤五次，每次5分钟，然后在室温下与HRP偶联的二抗孵育2小时。再次用TBS-T缓冲液洗涤五次，每次5分钟，并使用成像系统（Alliance版本15.11；UVITEC）和EZ-western试剂盒进行检测。使用ImageJ凝胶分析软件（美国国家卫生研究院，美国）分析条带密度。
对IL-6和sEH mRNA表达的抑制活性
将RAW264.7细胞（4 × 10^5细胞/ml）接种到60 mm细胞培养皿中，在37°C、5% CO2的加湿培养箱中培养24小时。用50 μM的抑制剂预处理细胞1小时，然后继续培养3小时，同时用50 μg/ml的poly(I:C)刺激。使用GeneAll Ribospin II提取试剂盒提取总RNA，并在T100 Bio-Rad热循环仪中使用PrimeScript II第一链cDNA合成试剂盒进行反转录。使用StepOne实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific）和SYBR，在以下条件下对IL-6、sEH和GAPDH进行实时PCR扩增：95°C 1分钟，然后40个循环的扩增（95°C 30秒，60°C 30秒，72°C 30秒）。用于PCR分析的IL-6引物为5’-TCCAGTTGCCTTCTTGGGAC-3’（正向）和5’-ACAGGTCTGTTGGGAGTGGT-3’（反向）；sEH的引物为5’-GGACGACGGAGACAAGAGAG-3’（正向）和5’-CTGTGTTGTGGACCAGGATG-3’（反向）；GAPDH的引物为5’-GGCTACACTGAGGACCAGGT-3’（正向）和5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’（反向）。使用2-ΔΔCt方法将表达水平归一化为GAPDH。
统计分析
结果以均值±标准差（SD）表示。使用IBM SPSS Statistics 23（IBM，美国）进行统计比较。组间统计学显著差异通过单因素方差分析（ANOVA）确定，随后进行Tukey检验。p值<0.05认为具有统计学意义。
图1. 从E. ciliata的地上部分提取的化合物1-4的结构。
结果
E. ciliata地上部分的提取与分离
采用乙醇、正己烷、乙酸乙酯和水对E. ciliata样品进行提取。乙酸乙酯部分在硅胶基C-18柱上进行纯化，最终分离得到四种化合物：木犀草素-7-O-葡萄糖苷（1）[19]、元胡宁（2）[20]、芹菜素-7-O-葡萄糖苷（3）[19]和丁烯-4-O-葡萄糖苷（4）[21]。
通过与之前报道的对比，阐明了这些化合物的结构（图S1–S4）。
图2. 化合物1-4对sEH的抑制活性（A）、Lineweaver-Burk图（B-E）和Dixon图（F-I）。
表1. 来自E. ciliata地上部分的抑制剂对sEH的抑制活性。
sEH的抑制活性及酶动力学研究
化合物1-4使用PHOME评估其阻断sEH催化反应的能力。根据方程1计算其抑制率。乙醇提取物显示出100%的抑制活性。根据方程2计算IC50值，结果表明抑制作用呈剂量依赖性。在12.5至50 μM的浓度范围内研究了化合物1-3的酶动力学，而化合物4则在1.25至12.5 μM的浓度范围内进行研究（图2A）。在3.1至50 μM的底物浓度范围内，测定了化合物的底物-酶初始速度(v0)。如图2B-2I和表1所示，结果表明这些化合物为非竞争性抑制剂，其抑制常数(ki)分别为98.2、56.9、34.1和14.3 μM。
分子模拟
使用盲对接方法对非竞争性抑制剂进行模拟，以确定其结合位点。如图3A-3D和表2所示，化合物1-4的AutoDock得分分别为-10.22、-10.00、-9.14和-9.14 kcal/mol。
图3. 抑制剂1-4（A-D）与sEH之间的氢键。抑制剂4（E）与sEH在100 ns内的重叠构象（红色：0 ns，橙色：10 ns，黄色：20 ns，绿色：30 ns，青色：40 ns，蓝色：50 ns，浅蓝色：60 ns，紫色：70 ns，洋红色：80 ns，白色：90 ns，黑色：100 ns）。模拟的均方根偏差（RMSD）（F）、均方根涨落（RMSF）（G）、势能（H）和氢键（I）。
表2. 来自E. ciliata地上部分的抑制剂与sEH的分子对接。
化合物1的糖苷配基中的羟基分别与Leu408（2.72和2.91 Å）、Arg410（2.87和3.14 Å）、Lys495（2.74 Å）、Phe497（2.77 Å）和Trp525（2.98 Å）形成了氢键。化合物2的羟基则与Phe267（2.44, 3.35 Å）、Leu408（2.64 Å）、Arg410（2.77, 3.31 Å）、Ser415（2.80 Å）、Tyr466（2.60 Å）、Lys495（3.03 Å）、Phe497（3.25 Å）、His524（2.77 Å）和Trp525（3.20 Å）形成了氢键。化合物3的羟基与Leu408（2.69 Å）、Arg410（2.58, 2.83和3.24 Å）、Lys495（3.14 Å）、Phe497（2.89 Å）、His524（2.61 Å）和Trp525（2.82 Å）形成了氢键。化合物4的苷元中的酮基和羟基与Tyr466（3.03 Å）、Leu408（2.77和2.88 Å）、Arg410（2.80和3.25 Å）、Lys495（2.73 Å）和Phe497（2.74 Å）相互作用。化合物4被证实为一种非竞争性抑制剂，能稳定地与sEH结合。接下来，通过分子动力学分析4-sEH复合物，以深入了解抑制剂与sEH之间的相互作用。结果如图3E-3I所示。潜在抑制剂4在视觉上被证实能在Asp496-Leu499和Phe409-Met419环，以及Pro379-Phe381 α-螺旋之间保持稳定的结合。在该抑制剂的作用下，sEH的势能为-5.3 × 10^4 kJ/mol，均方根偏差（RMSD）值在3.2 Å以内，均方根涨落（RMSF）值在3.3 Å以内。在100 ns的模拟过程中，4和sEH主要形成1-3个氢键，有时为0个，或4-7个氢键。在模拟开始时，可以确认抑制剂4结合在活性位点及其附近。从30 ns开始，确认其稳定地结合在活性位点旁边的所有腔隙中（图3E）。
图4. 抑制剂对RAW264.7细胞的细胞活力影响（A）。抑制剂1-4对多聚肌苷酸-多聚胞苷酸[poly(I.C.)]刺激的RAW264.7细胞中一氧化氮（NO）（B）和前列腺素E2（PGE2）（C）产生的抑制活性。Western blot分析中的诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧化酶-2（COX-2）蛋白水平（D）以及抑制剂对iNOS（E）和COX-2（F）的相对密度影响。白细胞介素-6（IL-6）（G）蛋白水平，以及IL-6（H）和sEH（I）的mRNA表达水平。
一氧化氮（NO）产生的抑制
进行了细胞毒性测试，以确定化合物1-4在不影响RAW264.7细胞活性的浓度。结果显示了细胞活力（图4A）。正常细胞分泌0.93 ± 0.19 μM NO和0.38 ± 0.01 ng/ml前列腺素E2（PGE2），而多聚肌苷酸-多聚胞苷酸[poly(I:C)]刺激的细胞产生18.83 ± 0.24 μM NO和2.10 ± 0.03 ng/ml PGE2。用50 μM化合物1-4处理poly(I:C)刺激的细胞后，NO水平分别为3.30 ± 0.04、10.45 ± 0.39、6.89 ± 0.24和2.36 ± 0.07 μM，PGE2水平分别为0.38 ± 0.02、1.48 ± 0.04、0.65 ± 0.04和0.31 ± 0.02 ng/ml（图4B和4C）。Western blot分析显示，经抑制剂处理的细胞混合物中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧化酶-2（COX-2）蛋白水平降低（图4D）。正常细胞、poly(I:C)刺激的细胞以及经化合物1-4处理的细胞中iNOS蛋白水平的相对密度分别为0.10 ± 0.00、0.86 ± 0.02、0.58 ± 0.03、0.75 ± 0.01、0.71 ± 0.01和0.41 ± 0.03（图4E）。更多详细信息见图4F-4I。值得注意的是，化合物1-4下调了poly(I:C)刺激细胞中的COX-2蛋白、IL-6蛋白、IL-6 mRNA和sEH mRNA水平。
讨论
可溶性环氧水解酶（sEH）存在于肝脏、肾脏、肺、心脏、大脑、脾脏、肾上腺和肠道组织的胞质和过氧化物酶体中[9]。据报道，sEH的底物环氧脂肪酸（EpFAs）在改善心血管疾病、炎症、癌症和炎性疼痛方面有效[22]。在完全弗氏佐剂诱导的热痛觉过敏大鼠中，已知TPPU通过降低12,13-二羟基-9Z-十八碳烯酸的浓度来改善炎性疼痛[24]。在sEH抑制剂中，AR9281和GSK2256294A已分别进入治疗高血压和肺部疾病的I期临床试验[23]。已发现EpFAs具有抑制促炎细胞因子的功能[24]。亚洲植物香薷用作蔬菜、香料、草药茶和传统药物，用于治疗感冒、发烧和哮喘[25]。其提取物在RAW264.7细胞中表现出抗炎活性，并可能下调间质纤维化[19]；它还能提高HT22小鼠海马细胞的细胞活力[16]。该植物的乙醇提取物含有多酚，并显示出抗炎作用[17]。提取物通常含有绿原酸、芦丁、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、7-金丝桃苷、8-芹菜素-7-O-葡萄糖苷和槲皮苷。在本研究中，我们从该植物中分离出四种糖苷（1-4）；它们被鉴定为木犀草素-7-O-葡萄糖苷（1）、元胡宁（2）、芹菜素-7-O-葡萄糖苷（3）和丁烯-4-O-葡萄糖苷（4）。其中，化合物2和4首次被报道为该植物的成分。
sEH抑制剂在提高环氧二十碳三烯酸（EETs）水平方面的作用对于治疗心血管和炎症性疾病至关重要[3]。研究重点一直在于从合成或天然来源中发现sEH抑制剂[9]。这四种化合物作为非竞争性抑制剂对sEH表现出抑制活性。化合物1-4的糖苷配基区域与氨基酸残基Leu408、Arg410、Lys495和Phe497相互作用，而苷元区域则位于sEH催化位点附近。值得注意的是，在分子动力学模拟中，化合物4在保持与这些氨基酸残基的葡糖苷键的同时，保持了稳定的结合运动。糖苷（4）的抑制效果优于类似的苷元形式，如异甘草素和2'-甲氧基异甘草素[26]。查尔酮氧化物最初是作为sEH抑制剂开发的[27]。
在之前对sEH基因缺失小鼠的研究中，由高氧性急性肺损伤引起的肺水肿和炎症有所减轻[28]。此外，这些小鼠中核因子红细胞2相关因子、血红素加氧酶-1和超氧化物歧化酶的水平高于正常小鼠。sEH抑制剂（t-TUCB）可减少炎症细胞向气道和肺部的浸润，并增加抗炎介质（如EETs、二羟基十八碳烯酸和LTB4）的水平[29]。化合物1-4在50 μM浓度下表现出降低RAW264.7细胞中抗炎剂（包括NO、PGE2、iNOS、COX-2、IL-6以及IL-6和sEH的mRNA水平）的产生和表达的能力。它们不仅抑制了sEH的催化反应，还抑制了sEH的mRNA水平，其中化合物4的效果最为显著。Poly(I:C)与Toll样受体3和视黄酸诱导基因I样受体相互作用，促进细胞因子、趋化因子和共刺激因子的分泌，犹如病毒感染[30]。
结论
从香薷中纯化出四种化合物（1-4），它们被鉴定为木犀草素-7-O-葡萄糖苷（1）、元胡宁（2）、芹菜素-7-O-葡萄糖苷（3）和丁烯-4-O-葡萄糖苷（4）。化合物2和4首次被鉴定为该植物的成分。这些化合物作为非竞争性抑制剂对sEH表现出抑制活性，并与sEH具有相似的结合能力。此外，它们下调了poly(I:C)刺激的RAW264.7细胞中NO、PGE2、iNOS、COX-2、IL-6以及IL-6和sEH的mRNA水平。最终，化合物4表现出对sEH和细胞因子的最有效抑制，并被验证为完全合格的先导化合物和潜在抑制剂，可用于开发与感染相关的抗炎药物。
点个在看你最好看
