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摘要：
背景：欧米伽-6/欧米伽-3（n-6/n-3）的平衡对大脑功能至关重要，因为它们具有相反的生理作用。
目标：分析西班牙北部地中海地区人群中，孕妇妊娠第一和第三孕期血清n-6/n-3比例与其子女出生后早期神经发育之间的关联。
方法：本研究为纵向研究，共纳入336对母子。测定了孕妇血清中长链多不饱和脂肪酸（LCPUFAs）、二十二碳六烯酸（DHA）、二十碳五烯酸（EPA）和花生四烯酸（ARA）的浓度。收集了社会人口学、临床、生活习惯和产科变量。使用贝利婴幼儿发展量表（BSID-III）评估婴儿神经发育。进行了调整混杂因素的多元线性回归分析。
结果：在第三孕期，孕妇较高的n-6/n-3比例与婴儿运动发育呈负相关（β = -0.124，p = 0.023）。同样，较高的ARA/DHA比例与总运动发育（β = -2.005，p = 0.002）和精细运动发育（β = -0.389，p = 0.001）呈负相关。在第一孕期或第三孕期的ARA/EPA比例中未观察到显著关联。
结论：我们的研究结果表明，妊娠第三孕期较高的n-6/n-3比例和ARA/DHA比例与婴儿运动发育结果较差相关。这些结果强调了优化孕期母体脂肪酸平衡以支持胎儿神经发育的重要性，并提示需要进一步研究来验证这些关联并阐明其潜在机制。
1 引言
孕期大脑发育深受母体营养摄入的影响，强调了孕期保持充足营养状态对促进健康发育的重要性[1]。欧米伽-6（n-6）和欧米伽-3（n-3）长链多不饱和脂肪酸（LCPUFAs）是一组含有20个或更多碳原子的必需脂肪酸[2]，在包括大脑发育和功能在内的各种生理过程中发挥着关键作用[3]。其中，二十二碳六烯酸（DHA，n-3）和花生四烯酸（ARA，n-6）对神经发育尤为重要，因为这些脂肪酸是神经元膜的主要成分，对关键的孕前神经发育过程至关重要，包括神经元膜的形成和功能、突触、神经递质的释放以及整体大脑功能和发育的调节[3]。
以往的研究主要关注n-3 LCPUFAs，特别是DHA对婴儿神经发育的影响，但研究结果存在矛盾。例如，Rioux等人[4]发现孕晚期母体DHA状态与6个月婴儿神经发育之间无相关性。同样，Shahabi等人报告，孕早期血清DHA浓度较高与生命最初几周的神经发育较差相关[5]。事实上，随机对照试验（RCTs）的Cochrane综述和其他系统评价表明，目前证据不足以明确证明孕期n-3 LCPUFA补充对后代神经发育有积极影响[6,7]。导致这些结果不明确的一个潜在因素可能是对n-6脂肪酸及其与n-3脂肪酸的相互作用关注有限。除了它们各自的贡献外，n-3和n-6 LCPUFAs在细胞膜中的掺入存在竞争[8]，并表现出相反的生理作用。虽然n-6脂肪酸，特别是ARA，是促炎性二十烷类（如前列腺素和白三烯）的前体，但n-3脂肪酸，如EPA和DHA，是抗炎性二十烷类和消退素的前体，可减轻过度炎症[9]。因此，建议膳食中n-6/n-3 LCPUFA的比例为4:1或更低[9]，尽管血清LCPUFA比例的具体目标仍未确定。
在孕期和胎儿神经发育的背景下，由于机体生长的关键时期[10]，这些脂肪酸之间的平衡尤为重要。保持适当的n-6/n-3平衡可以促进最佳神经系统发育，并减少与脂肪酸失衡相关的神经发育障碍风险[11]。然而，评估孕期母体血清n-6/n-3比例对后代神经发育影响的研究仍然稀缺，且报告结果存在矛盾。例如，在荷兰的Generation R研究中，Steenweg-de Graaff等人[12]发现较高的n-6/n-3比例与6岁儿童情绪症状风险增加相关。西班牙的ABCD研究和INMA队列中也报告了类似发现，即较高的n-6/n-3比例与5~6岁儿童的情绪、注意力和多动问题相关[13,14]。相比之下，Brouwer-Brolsma等人[15]评估了7岁儿童认知发育的研究，未发现任何显著相关性。这些差异可能由多种因素导致，包括测定LCPUFA浓度的时机、组织类型和方法不同，以及评估的年龄和神经发育结果存在差异（如认知发育与心理病理问题）。对于年幼儿童，相关证据有限。Strain等人[16]的塞舌尔儿童发育研究评估了孕期母体n-6/n-3比例对早期认知结果的影响。其研究结果表明，较高的n-6/n-3比例与9个月时使用贝利婴儿发育量表（BSID-II）测量的较差心理运动发育相关。然而，在30个月时进行的随访中，这种相关性并不显著，强调需要进一步研究以阐明n-6/n-3平衡在早期神经发育中的作用，特别是在出生后环境因素尚未产生显著影响的最初几个月内。
在孕前研究中，环境因素对发育中大脑产生影响的孕期时机是一个关键考虑因素。整个孕期会发生不同的神经发育里程碑，如神经元增殖、迁移和突触形成，每个过程可能对特定因素的敏感性不同，取决于其时机。孕早期以基本的结构过程为特征，包括神经发生和神经元迁移，为后期大脑发育奠定基础[17,18]。相比之下，孕晚期以胎儿和大脑的快速生长为标志，涉及突触形成、髓鞘形成和神经元回路成熟等关键过程[19,20]。在这一阶段，为了满足发育中胎儿不断增加的营养需求，特别是DHA和其他必需脂肪酸，胎盘的营养物质转运达到高峰[21,22]。因此，研究包括脂肪酸比例在内的营养影响时，应分别考虑这些孕期阶段，以捕捉它们对神经发育的不同贡献。
综上所述，关于母体循环中n-6/n-3比例与后代神经发育关系的证据有限且结论不明确。因此，为了丰富现有知识，我们旨在分析西班牙北部地中海地区社区样本中，孕期第一和第三孕期母体血清n-6/n-3比例与婴儿早期神经发育之间的关联。
2 材料和方法
2.1. 研究设计和程序
这是一项对孕妇从孕早期至产后时期的前瞻性随访研究，参与者为ECLIPSES队列研究的一部分，这是一项在西班牙北部地中海地区开展的社区随机对照试验（RCT）[23,24]。共招募了791名参与者，在孕12周前从初级保健中心招募，并在孕12周、24周、36周和产后早期（产后6~8周）进行随访。纳入标准为年龄超过18岁、孕周小于12周、能理解西班牙语或加泰罗尼亚语。排除标准包括多胎妊娠、研究开始时贫血（Hb < 110 g/L）、对蛋白过敏以及既往有严重疾病（免疫抑制、吸收不良综合征、糖尿病、癌症和肝病）。
收集了母体血液样本、社会人口学、临床和生活习惯信息，以及婴儿神经发育信息。
在450名参与者的子样本中，于孕12周和36周测定了血清LCPUFA浓度，其中336名参与者参加了产后早期婴儿认知评估随访访视。图1为本研究的流程图。
图1. 研究设计、测量指标及研究人群的流程图。
ECLIPSES研究得到了佩雷·维尔吉利健康研究所（IISPV）伦理委员会（155/2017）和西班牙药品和医疗器械局（AEMPS）的批准。所有参与者均签署了知情同意书。本研究遵循《赫尔辛基宣言》的原则。
2.2 仪器与数据收集
2.2.1 主要测量指标
采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定孕妇血清中n-3长链多不饱和脂肪酸（如二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA））（µmol/L）以及n-6长链多不饱和脂肪酸（如花生四烯酸（ARA））（µmol/L）的浓度。血清样本在禁食一段时间后采集。血清经离心后，于-80°C保存，直至分析。将标准内标混合物与20µl甲醇中的血清混合，以沉淀蛋白质。将上清液与水、O-苄基羟胺（BHA，Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）和N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺（EDC，Sigma-Aldrich）混合，以获得多不饱和脂肪酸衍生物。通过液-液萃取使用乙醚纯化多不饱和脂肪酸衍生物，并通过超高效液相色谱-质谱法（UHPLC-MS/MS）使用UHPLC 1290 Infinity II系列耦合QqQ 6470 Series®（安捷伦科技有限公司，美国加利福尼亚州圣克拉拉）进行分析。色谱分离采用梯度洗脱，使用含有水、甲醇和异丙醇的三元流动相（铵盐形式）在Kinetex Polar C18分析柱（2.6µm，2.1×100mm）（Phenomenex，美国加利福尼亚州托伦斯）上进行。质谱仪以多反应监测（MRM）模式运行，多不饱和脂肪酸通过正电喷雾电离。UHPLC-MS/MS系统由Agilent MassHunter®工作站（安捷伦科技有限公司，美国加利福尼亚州圣克拉拉）监控。样本一式两份进行分析，并计算两个值的平均值。总n-3多不饱和脂肪酸浓度计算为EPA和DHA的总和，而总n-6多不饱和脂肪酸浓度包括ARA。n-6/n-3比值通过总n-6多不饱和脂肪酸浓度除以总n-3多不饱和脂肪酸浓度来计算。
在产后随访访问中，大约在分娩后40天，使用《贝利婴幼儿发展量表（第三版）》（BSID-III）[25]评估婴儿的神经发育情况。BSID-III是一项个体检查，用于评估0至42个月大婴儿的发育表现。BSID-III包括三个一般量表（认知量表、语言量表和运动量表）和四个子量表（表达性语言、接受性语言、精细运动和粗大运动）。在约1.52个月大的婴儿中，认知量表评估感觉-运动发展、视觉注意力和探索能力；语言量表（包括接受性语言和表达性语言子量表）评估婴儿的接受性沟通、前语言行为能力、声音分化以及社交和物体定向；运动量表（包括精细运动和粗大运动量表）评估抓握、感知-运动整合、视觉追踪物体、对触觉信息的反应、肢体和躯干运动、静态定位和平衡。BSID-III由两名训练有素的心理学家在产后68周的访问期间进行，父母或主要照顾者在场。
2.2.2 调整测量指标
社会经济地位（SES）根据霍林斯黑德指数[26]确定，通过结合母亲及其配偶（如有）的教育和职业数据，分为三类（高、中、低）。
使用法格斯特伦问卷（Fagerström_Q）[27]评估孕期吸烟状况，将女性分为两组：吸烟者和非吸烟者。
在妊娠第12周和第36周，通过国际身体活动问卷简版（IPAQ-SF）[28]测量身体活动，该问卷询问典型一周内进行的身体活动类型、频率和持续时间，以获得每周每分钟的代谢当量消耗（MET-min/week）。
测量母亲在妊娠第12周和第36周的体重（kg）和身高（cm），计算其身体质量指数（BMI），并计算BMI的差异，以确定孕期BMI的变化。
采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定血清短链脂肪酸（SCFAs）（乙酸、丙酸和丁酸）的浓度。
通过免疫化学发光法测定血清铁蛋白（µg/L）水平。
使用化学发光免疫测定法在ADVIA Centaur分析仪上使用商业试剂盒（ADVIA Centaur IRI，西门子医疗诊断公司，美国纽约州塔里敦）测定血清维生素B12（µmol/L）水平。
从每位女性的产科临床报告中收集产科和新生儿变量数据。这些变量包括婴儿的性别、新生儿出生体重（使用精确到10g的SECA电子秤测量）和出生时的胎龄（通过产科检查中的超声波验证）。
在发育评估时记录婴儿的喂养方式（母乳喂养或配方奶喂养）。
2.3 统计分析
使用SPSS统计软件29.0版对数据进行分析。
采用科尔莫戈罗夫-斯米尔诺夫检验评估变量的正态性。定量变量的描述性统计以均值和标准差（SD）或中位数（四分位数间距，IQR）表示，而分类变量以观察数量和百分比（%）表示。参数变量之间的比较采用学生t检验，非参数变量之间的比较采用威尔科克森符号秩检验。
计算n-6/n-3、ARA/DHA和ARA/EPA比值。根据第75百分位数，将这些比值分为两类。将<75百分位数的类别定义为参考类别。
进行多元线性回归分析，以检查新生儿早期神经发育的每项测量指标（认知、语言、接受性语言、表达性语言、运动、精细运动和粗大运动）作为连续结果变量，与孕妇在孕早期和孕晚期分别测量的必需脂肪酸比值（根据第75百分位数作为分类变量和定量变量）之间的关系。计算未调整和调整的模型。考虑的调整变量包括家庭社会经济地位（高、中或低）、烟草消费（是或否）、BMI变化（Kg/m²）、身体活动（MET-min/week）、维生素B12（µmol/L）、血清铁蛋白（µg/L）、乙酸（µmol/L）、丙酸（µmol/L）、丁酸（µmol/L）、随机对照试验（RCT）中的铁补充剂（20、40和80mg/d）、出生时的胎龄（周）、婴儿性别（男孩或女孩）以及喂养类型（配方奶或母乳喂养）。p<0.05认为具有统计学意义。
3 结果
3.1 样本的描述性特征
参与者的描述性特征见表1。
本研究共纳入336名孕妇，平均年龄为38.9岁（标准差=5.0）。家庭的社会经济地位分布如下：41.1%属于低社会经济水平，43.8%属于中等水平，15.2%属于高水平。在生活习惯方面，85.1%的孕妇报告孕期未吸烟，而14.9%的孕妇有吸烟行为。新生儿的平均孕周为39.8周（标准差=1.2），并在出生后47天（标准差=13）进行评估。婴儿的性别分布相对均衡，男孩占52.7%，女孩占47.3%。
表1. 母亲和子女的描述性数据：社会人口学、生活方式、营养和心理状况（n = 336）。
3.2. 母体n-6/n-3、ARA/DHA和ARA/EPA比值与婴儿发展领域关联的多元线性回归模型
表2至表4展示了多元未调整和调整后线性回归模型的结果，这些模型用于分析孕期第一和第三期母体血清中n-6/n-3、ARA/DHA和ARA/EPA比值与婴儿神经发育领域之间的关联。
表2. 多元调整后线性回归模型，用于分析孕期第一和第三期母体血清n-6/n-3比值与婴儿神经发育之间的关联。
表3. 多元调整后线性回归模型，用于分析孕期第一和第三期母体血清ARA/DHA比值与婴儿神经发育之间的关联。
表4. 多元调整后线性回归模型，用于分析孕期第一和第三期母体血清ARA/EPA比值与婴儿神经发育之间的关联。
关于孕期第一期母体血清n-6/n-3比值（表2）、ARA/DHA比值（表3）和ARA/EPA比值（表4）浓度，无论这些比值是作为连续变量考虑还是按第75百分位数分类，均未发现与婴儿神经发育领域存在显著关联。
当考虑孕期第三期的比值时，观察到母体血清n-6/n-3比值（作为连续变量考虑时，β = -0.124，p = 0.023；按第75百分位数分类时，β = -2.963，p = 0.035）与婴儿总运动量表之间存在显著负相关关系（表2）。关于血清ARA/DHA比值浓度，无论比值作为连续变量考虑（β = -2.005，p = 0.002；β = -0.389，p = 0.001，分别对应总运动量表和精细运动量表）还是按第75百分位数分类（β = -3.736，p = 0.009；β = -0.625，p = 0.013，分别对应总运动量表和精细运动量表），均观察到与婴儿总运动量表和精细运动量表存在负相关关系（表3）。
孕期第三期母体血清ARA/EPA比值浓度与婴儿发育量表结果之间未观察到显著关联（表4）。
4 讨论
这项基于发达国家孕妇社区样本的队列研究，为孕期n-6和n-3长链多不饱和脂肪酸（LCPUFAs）血清水平与婴儿神经发育关联的有限证据做出了贡献。我们观察到，孕期第三期n-6/n-3和ARA/DHA比值较高与产后早期婴儿运动发育较差存在关联。孕期第一期这些比值以及孕期第三期ARA/EPA比值均未发现此类关联。这强调了孕晚期脂肪酸状况对早期神经发育结果影响的潜在作用。
我们的研究结果部分与以往研究一致。关于孕期母体血清n-6/n-3比值对婴儿神经发育影响的研究，据我们所知，仅在塞舌尔儿童发展营养研究[16]中进行过，该研究涉及225对母子。他们评估了孕期第三期的n-6/n-3比值以及9个月和30个月大婴儿的神经发育，观察到该比值与9个月时的心理运动发育较差相关，但与30个月时无关。有一些研究通过孕妇饮食评估了孕期这一比值，如首尔进行的母婴环境健康（MOCEH）研究，涉及960名参与者。该研究也观察到孕期膳食n-6/n-3比值与6个月大婴儿的精神和心理运动发育存在负相关，同样使用贝利婴儿发展量表（BSID）第二版进行评估[29]。在学龄儿童中，结果仍不明确，一些研究观察到n-6/n-3比值较高与情绪[12]和注意力问题[14]存在直接关系，而评估认知功能的研究未发现任何关系[15]。研究结果之间的差异可能归因于脂肪酸测定时的孕期时机、儿童神经发育评估的年龄和/或评估的具体神经发育领域不同，以及分析中对潜在混杂因素的调整不同。该领域的大多数研究仅在孕期结束时对母体多不饱和脂肪酸（PUFA）水平进行了一次测定[16,30]。第三期评估占主导地位与证据一致，即在此期间，脂肪酸（特别是DHA）向胎儿转运大幅增加。这一激增可能支持孕晚期发生的快速突触形成、髓鞘形成和其他神经发育里程碑[3,31]。我们的结果支持这一观点，因为孕期第三期n-6/n-3比值较高与心理运动发育较差相关，而孕期第一期未发现显著关联。这一发现表明，早期神经发育轨迹可能对孕期大脑快速生长和结构重组期间的脂肪酸环境特别敏感。
我们的结果可以从多个方面解释。尽管一些研究观察到n-3 LCPUFAs对儿童和成人大脑形态和功能的有益影响[32]，但关于孕期母体n-6/n-3 LCPUFA比值浓度对早期神经发育影响的研究有限。Dec等人的体外研究等实验证据表明，n-6/n-3比值升高可能通过促炎机制破坏早期神经元分化和突触活性[33]。此外，n-6脂肪酸（如ARA）和n-3脂肪酸（如EPA和DHA）是产生二十烷酸的母化合物，二十烷酸是参与各种生理过程的信号分子。然而，n-6与n-3脂肪酸的比率远高于最佳比率1:1至4:1。当n-6脂肪酸摄入过多且n-3脂肪酸缺乏时，身体会从n-6脂肪酸中产生比从n-3脂肪酸中更多的二十烷酸。n-6脂肪酸衍生的促炎二十烷酸占主导地位可能放大炎症反应，对突触修剪和神经发生等下游过程产生影响。这尤其令人担忧，因为神经炎症已与婴儿早期神经元连接改变以及运动和认知结果受损有关[34]。
早期中枢神经系统发育是一个极其复杂的过程，受多种遗传、生物、代谢和环境因素的影响。这些因素包括母体生活习惯、环境毒素暴露、营养状况、情绪症状、药物使用，甚至母体微生物群[35]。在我们的研究中，我们调整了回归模型，考虑了其中的一些因素，如社会人口学特征（家庭社会经济地位）；临床方面（孕期体重指数）；营养因素（母体血清铁蛋白和维生素B12水平）；生活习惯（烟草消费和体育活动）；产科结果（出生孕周、分娩方式和婴儿性别）；母体微生物群指标（乙酸、丙酸和丁酸水平）；以及发育评估时婴儿的喂养类型。这一调整使我们能够独立于其他效应评估n-6/n-3比值的关联。
解释我们的结果时应考虑研究的优势和局限性。关键优势之一是对婴儿神经发育的早期评估，这使我们能够在出生后变量产生影响之前更好地隔离孕期母体n-6/n-3比值的影响。这项研究在大量社区孕妇样本中进行，测定了孕期第一期和第三期的血清LCPUFA水平，使我们能够确定实际状况，而不受补充剂或饮食的影响。此外，使用贝利婴儿发展量表第三版（BSID-III）评估婴儿神经发育，该工具专为评估早期认知发展而设计，且在国际上广泛使用，便于我们的结果与其他研究获得的结果进行比较[36,37]。然而，我们的结果仅适用于具有南欧类似社会和环境特征的地中海血统群体，不包括饮食模式和遗传背景不同的群体。此外，我们承认其他心理社会因素的相关性，如父母心理健康、家庭功能、感知到的社会支持和依恋等，这些因素可能与产前因素相互作用，并在儿童后期影响神经发育结果。未来研究应考虑这些因素，以更好地理解产前和产后因素在长期随访研究中的相互作用。
5 结论
总之，我们的研究结果表明，孕期第三期估计的母体n-6/n-3比值较高与出生后几天内婴儿神经系统发育较差相关。这些结果突出了平衡母体长链多不饱和脂肪酸状况以优化胎儿神经发育的潜在重要性，并有助于理解对早期神经发育的潜在营养影响，可能为旨在优化母婴健康的饮食建议或公共卫生策略的未来研究提供信息。需要进一步研究来扩展和验证当前的知识状态。
