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摘要
肾纤维化是慢性肾脏病（CKD）进展至肾衰竭过程中的一种常见表现。目前，尚无有效疗法能够阻止肾纤维化的进展。从茯苓中分离出的茯苓新酸A（PAA）显示出显著的抗纤维化作用。然而，其作用机制尚不清楚。本研究旨在评估茯苓新酸A对抗肾纤维化的作用及其潜在机制。通过单侧输尿管梗阻（UUO）建立了小鼠肾纤维化模型。我们发现，给予茯苓新酸A可显著减轻UUO小鼠的肾脏病变和胶原沉积。UUO小鼠出现了上皮-间充质转化（EMT）和内质网应激（ERS）的激活，而茯苓新酸A治疗显著抑制了EMT和ERS的激活。此外，茯苓新酸A还明显减轻了UUO小鼠中ERS介导的凋亡。分子对接结果表明，茯苓新酸A能稳定地与GRP78和ATF4结合。总之，这些结果表明茯苓新酸A具有显著的抗肾纤维化生物活性，其作用机制可能是通过抑制ERS介导的凋亡。
引言
慢性肾脏病（CKD）是全球范围内严重威胁人类健康的主要疾病之一，具有高发病率和高死亡率（1）。肾纤维化是CKD的一种常见病理特征，其特点为细胞外基质（ECM）大量积聚，导致肾脏组织结构损伤和功能丧失（2,3）。肾素-血管紧张素系统（RAS）抑制剂，包括血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）和血管紧张素II受体拮抗剂（ARB），目前是治疗CKD的一线药物。然而，它们并非肾纤维化治疗的专属靶向药物，且存在严重的不良反应（4）。因此，有必要阐明肾纤维化的分子机制并开发新药。
内质网（ER）是真核细胞中合成、加工和转运蛋白质和脂质的重要细胞器。内质网应激（ERS）是对不良刺激的一种重要保护性反应，由内质网中的未折叠蛋白反应（UPR）引起（5）。UPR通常由三种蛋白传感器激活，即蛋白激酶RNA样内质网激酶（PERK）、肌醇需求蛋白1（IRE1）和激活转录因子6（ATF6），它们分别与三条信号通路（PERK-eIF2α-ATF4-CHOP、IRE1α-XBP1s和ATF6）相关（6）。尽管ERS对机体具有重要的保护作用，但持续的ERS可能诱导细胞凋亡（7）。值得注意的是，新兴研究表明，ERS介导的凋亡与多种肾脏疾病的发病和发展相关（8,9）。
茯苓属于多孔菌科，是茯苓（Poria cocos (Schw.) Wolf）的菌核，在中国安徽、云南、湖北、河北、河南等省广泛分布（10）。作为一种知名的传统中药，茯苓（中文名：）因其利尿、滋补和镇静作用而常被使用（11）。近年来，越来越多的证据表明，茯苓含有多种四环三萜类化合物，这些化合物对肾纤维化具有显著作用（10,12）。其中，茯苓新酸A（PAA，图1）是茯苓中最具代表性的成分，显示出显著的抗纤维化作用（13）。已证实茯苓新酸A通过调节多种信号通路（如NF-κB/MAPK（14）、Wnt/β-catenin（13）和AMPK通路（15））发挥强大的肾保护作用。然而，尚无证据表明茯苓新酸A是否可以通过抑制ERS介导的凋亡来减轻肾纤维化。因此，本研究的目的是探讨茯苓新酸A在肾纤维化模型中对ERS诱导凋亡的影响。
图1. 多孔菌酸A（PAA）的化学结构。
材料与方法
化学品与药物
茯苓新酸A（PAA，纯度≥98%）采用先前描述的方法从茯苓中分离得到（16）。氯沙坦（LOS）是一种典型的血管紧张素II受体拮抗剂（ARB），购自浙江华海药业股份有限公司（中国）。其他试剂均为分析纯。
动物实验
6-8周龄（18-22g）雄性昆明小鼠购自西安交通大学动物中心（中国）。小鼠自由饮水和进食标准饲料。所有实验程序和小鼠的护理均按照机构关于动物研究使用的指南进行。
单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠模型的建立按照先前描述的方案进行（17）。用于UUO模型的24只小鼠随机分为四组：i) 假手术组（n=6）；ii) UUO组（n=6）；iii) UUO+10 mg/kg 茯苓新酸A组（n=6）；iv) UUO+10 mg/kg LOS组（n=6）。治疗组小鼠在UUO后连续7天通过口服灌胃给予茯苓新酸A和LOS（10 mg/kg/天），而假手术组和UUO组给予等体积的生理盐水。所有实验动物均在UUO后第7天处死。
蛋白质印迹
使用RIPA提取肾组织总蛋白。使用BCA蛋白质测定试剂盒（23227，Thermo Scientific，美国）检测蛋白质浓度，并通过α-微管蛋白表达进行标准化。通过SDS/PAGE分离总蛋白（20-30 mg），然后转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（10600023，Amersham Hybond，GE Healthcare，美国）。PVDF膜用含0.1% Tween-20的1×Tris缓冲盐水（TBST）洗涤3次。在5%脱脂牛奶中封闭1小时后，将PVDF膜在4°C下与一抗孵育过夜。膜用TBST洗涤4次，然后在二抗（山羊抗兔，1:5000，ab6721；Abcam，美国；或山羊抗小鼠，1:5000，A21010；Abbkine，美国）中孵育2小时。在TBST中洗涤6次后，使用增强型化学发光检测试剂（RPN2232，GE Healthcare）使膜显影，并使用Tanon 6600发光成像工作站（上海天能科技有限公司，中国）获取图像。使用ImageJ软件（版本1.48v，NIH，美国）对免疫印迹的信号强度进行定量，并以α-微管蛋白（1:1000，11224-1-AP，Proteintech，中国）的表达水平进行标准化。每种蛋白质的定量重复3次。一抗包括：胶原I（1:5000，ab34710，Abcam）、纤连蛋白（1:1000，ab2413，Abcam）、波形蛋白（1:2000，ab92547，Abcam）、平滑肌肌动蛋白（α-SMA，1:300，ab7817，Abcam）、E-钙粘蛋白（1:2000，ab76055，Abcam）、CHOP（1:1000，2895，CST）、GRP78（1:1000，ab108615，Abcam）、eIF-2α（1:1000，9722，CST）、P-eIF-2α（1:1000，9721，CST）、ATF4（1:1000，AF2560，Beyotime）和α-微管蛋白（Proteintech）。
实时荧光定量PCR
根据制造商的说明，使用TRIzol试剂（Servicebio，中国）从肾脏中提取总RNA。然后，使用cDNA合成试剂盒（Servicebio）将mRNA合成为cDNA。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）使用SYBR Premix Ex Taq II（Takara Bio，日本）进行。本研究中使用的正向和反向引物列于表1。在PCR仪上进行40个循环后，使用2^(-ΔΔCt)方法计算mRNA的相对表达量。
组织学分析
肾脏组织在4%甲醛中固定24小时，然后嵌入石蜡中。5 mm厚的肾脏切片用苏木精-伊红（HE）和Masson三色试剂按照标准方案（18）进行染色。免疫组织化学（IHC）染色按照常规方案（19）进行和评估。染色切片的图像由上海光学仪器厂的LIRI-2006显微镜和CMOS相机拍摄。使用Image-Pro Plus 6.0软件进行图像分析。HE染色结果通过四个指标评估：肾小管上皮细胞丢失（评分：0-5）、肾小管扩张（评分：0-5）、炎性细胞浸润（评分：0-5）和近端肾小管萎缩（评分：0-5）。Masson三色染色的分析通过胶原面积（评分：0-10）和染色强度（评分：0-10）进行评估。
对于IHC染色，结果通过阳性细胞的百分比和染色强度进行评估。阳性细胞百分比的评分范围为0到20（评分=0：阴性；评分=5：少于10%的阳性细胞；评分=10：10-50%的阳性细胞；评分=15：51-75%的阳性细胞；评分=20：超过75%的阳性细胞）。阳性反应的染色强度分为0到15（评分=0：无色；评分=5：淡黄色；评分=10：棕黄色；评分=15：棕褐色）。
TUNEL染色
TUNEL染色用于检测肾小管细胞凋亡。简言之，肾脏组织切片脱蜡并用蛋白酶K（20 mg/L）孵育20分钟。在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤3次后，肾脏切片用3%过氧化氢处理20分钟。然后，洗涤切片并与含有TDT酶-dUTP的TUNEL反应混合物在37°C下孵育1小时。在LIRI-2006显微镜（上海光学仪器厂）和CMOS相机下观察并拍摄染色切片。由两位独立的病理学家对TUNEL阳性细胞进行定量分析，并确定凋亡细胞的百分比。
分子对接和分子动力学模拟
茯苓新酸A的三维（3D）结构从PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取。GRP78（PDB：6asy）和ATF4（PDB：1ci6）的晶体结构从RCSB蛋白质数据库（https://www.rcsb.org）获取。分子对接实验使用AutoDock 4.2.6按照标准程序（20）进行。蛋白质与配体相互作用的结果通过PyMOL程序进行可视化。
分子动力学模拟（MDS）使用Gromacs 2020.6软件结合Charmm 36力场进行。将PAA-GRP78/ATF4复合物置于充满TIP3P水的立方体盒子中心。在MDS过程中，使用LINCS算法以2 fs的时间步长约束氢键。静电相互作用在1.2 nm的截断距离下通过PME方法计算。我们使用Berendsen算法进行100 ps的NVT平衡，温度设置为300 K，压力设置为1 bar。最后，进行50 ns的MDS。基于结果，通过均方根偏差（RMSD）、均方根波动（RMSF）、回旋半径（Rg）和氢键分布评估PAA-GRP78/ATF4复合物的稳定性。
统计分析
数据以均值±标准差（SD）表示。多组结果使用GraphPad Prism软件（GraphPad Software，美国）进行单因素方差分析（ANOVA），随后在两组之间进行双尾Student's t检验。P<0.05认为具有统计学意义。
结果
茯苓新酸A抑制UUO小鼠的肾纤维化和上皮-间质转化（EMT）
如图2A和B所示，HE和Masson三色染色显示UUO小鼠出现肾损伤和肾小管间质纤维化（TIF）。茯苓新酸A治疗显著减轻了病理病变、炎性细胞浸润和胶原沉积。EMT在肾纤维化的发展中发挥重要作用（21）。通过测量胶原I、纤连蛋白、α-SMA、波形蛋白和E-钙粘蛋白的蛋白质和mRNA表达，检查了茯苓新酸A对EMT的抑制作用。与假手术组相比，UUO小鼠的胶原I、纤连蛋白、α-SMA和波形蛋白表达显著上调。经茯苓新酸A治疗后，胶原I、纤连蛋白、α-SMA和波形蛋白的表达降低。E-钙粘蛋白在UUO小鼠肾组织中的蛋白质表达增加，而在茯苓新酸A治疗的UUO小鼠中降低。LOS表现出与茯苓新酸A相似的效果（图3A-C）。同样，IHC染色显示UUO小鼠肾组织中α-SMA和纤连蛋白的过度表达，并且在茯苓新酸A治疗后表达恢复（图3D）。综上所述，这些发现证实茯苓新酸A治疗可以减轻肾损伤并抑制EMT。
表1. qRT-PCR引物。
图2. 茯苓新酸A（PAA）改善了单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠的病理损伤和胶原沉积。
A，UUO小鼠的苏木精-伊红（HE）染色和肾损伤评分。B，UUO小鼠的Masson三色染色和肾小管间质纤维化（TIF）评分。比例尺为100毫米。数据以均值±标准差表示。P<0.05，P<0.01，和P<0.001。采用单因素方差分析，随后进行双尾学生t检验。LOS：氯沙坦。
图3. 茯苓新酸A（PAA）抑制了单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠肾脏中的上皮-间质转化（EMT）。A和B，胶原I、纤连蛋白、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、波形蛋白和E-钙粘蛋白的蛋白质表达及定量分析。C，胶原I、纤连蛋白、α-SMA、波形蛋白和E-钙粘蛋白的mRNA表达。D，α-SMA和纤连蛋白的免疫组织化学染色及相对定量分析。比例尺为25毫米。数据以均值±标准差表示。P<0.05，P<0.01，P<0.001，ns：无统计学差异。采用单因素方差分析，随后进行双尾学生t检验。LOS：氯沙坦。
茯苓新酸A（PAA）抑制了单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠的内质网应激（ERS）激活
内质网应激是肾纤维化发病和发展过程中的主要促成因素（8）。为了探究茯苓新酸A对ERS激活的影响，我们进行了蛋白质印迹分析和实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR），以检测ERS标志物，包括CHOP、GRP78、p-PERK、p-eif-2a和ATF4。如图4A-C所示，UUO小鼠中CHOP、GRP78、p-PERK、p-eif-2a和ATF4的蛋白质和mRNA表达均显著增加，而在给予茯苓新酸A后显著降低。免疫组化（IHC）染色显示，UUO小鼠中CHOP和GRP78的上调在茯苓新酸A治疗后被显著抑制（图4D）。这些结果表明，茯苓新酸A抗肾纤维化的作用可能是通过抑制ERS激活来介导的。
茯苓新酸A改善了UUO小鼠中ERS介导的细胞凋亡
通过TUNEL试验评估UUO小鼠肾脏组织中的细胞凋亡情况。UUO小鼠中凋亡的肾小管上皮细胞数量显著高于假手术小鼠，而茯苓新酸A治疗显著降低了这一数量（图5A）。蛋白质印迹和qRT-PCR结果显示，UUO小鼠肾脏组织中促凋亡蛋白Bax和caspase 12的表达增加，同时抗凋亡蛋白Bcl-2的表达减少。茯苓新酸A治疗显著减轻了Bax、Bcl-2和caspase 12的异常表达（图5B）。这些结果表明，茯苓新酸A可能通过缓解ERS介导的细胞凋亡来发挥肾保护作用。
茯苓新酸A与GRP78和ATF4的分子对接和分子动力学模拟（MDS）分析
为了进一步阐明茯苓新酸A与ERS相关蛋白之间的相互作用，我们进行了分子对接研究。茯苓新酸A与GRP78（–6.675 kcal/mol）和ATF4（–5.133 kcal/mol）的亲和力均小于–5 kcal/mol，表明它们的结合是稳定的。如图6A和B所示，茯苓新酸A与GRP78的氨基酸残基ARGA 101和HISA 252表现出疏水相互作用，同时与ATF4的ARGA 296、ARGA 300和ARGB 240形成氢键。此外，茯苓新酸A可以通过不同的机制（包括烷基、Pi-烷基和Pi-西格玛）与GRP78和ATF4结合。
图4. 茯苓新酸A（PAA）抑制了单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠肾脏中的内质网应激（ERS）激活。A和B，Chop、GRP78、p-PERK、p-eif-2a和ATF4的蛋白质表达及定量分析。C，Chop、GRP78和ATF4的mRNA表达。D，Chop和GRP78的免疫组织化学染色及相对定量分析。比例尺为25毫米。数据以均值±标准差表示。P<0.05，P<0.01，P<0.001，ns：无统计学差异。采用单因素方差分析，随后进行双尾学生t检验。LOS：氯沙坦。
图5. 茯苓新酸A（PAA）抑制了单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠肾脏中的细胞凋亡。A，肾脏组织的TUNEL染色。B和C，Bax、Bcl-2和caspase 12的蛋白质表达及定量分析。比例尺为25毫米。数据以均值±标准差表示。P<0.01，*P<0.001，ns：无统计学差异。采用单因素方差分析，随后进行双尾学生t检验。LOS：氯沙坦。
通过均方根偏差（RMSD）、均方根涨落（RMSF）、回旋半径（Rg）和氢键分布，我们探索了PAA-GRP78/ATF4复合物的结构稳定性。如图6C所示，PAA-ATF4复合物的RMSD在0.75纳米左右波动，在50纳秒的分子动力学模拟（MDS）过程中保持稳定。PAA-GRP78复合物的RMSD在25纳秒后趋于稳定。PAA-ATF4和PAA-GRP78均形成了稳定的复合物。GRP78显示出更高的平均半径和波动，表明PAA可能对GRP78的紧凑性产生一定影响（图6D）。此外，与PAA-ATF4复合物相比，茯苓新酸A与GRP78之间形成的氢键数量随模拟时间变化较大（图6E）。此外，结合位点的大多数氨基酸残基表现出较小的灵活性，RMSF小于0.4纳米（图6F和G），表明这些蛋白质结构域与茯苓新酸A的结合更好。
讨论
肾纤维化的发生和发展导致了内质网应激（ERS）的激活（22）。在本研究中，我们证实，来自茯苓的强效抗纤维化小分子茯苓新酸A，通过抑制ERS介导的细胞凋亡，显著减轻了肾间质纤维化（图7）。我们的结果显示，茯苓新酸A对UUO小鼠肾损伤的改善作用与氯沙坦（LOS）相似，后者是临床治疗慢性肾脏病（CKD）的一线药物。此外，茯苓新酸A显著减少了UUO小鼠肾组织中的胶原沉积，其效果甚至优于LOS。这些发现表明了茯苓新酸A作为治疗CKD新型药物的潜力。
UUO诱导了肾内ERS的激活以及CHOP、GRP78、eif-2a、p-eif-2a和ATF4的表达。在UUO小鼠的肾组织中，ERS的激活与异常的上皮-间质转化（EMT）相关，表现为胶原I、纤连蛋白、α-平滑肌肌动蛋白（a-SMA）和波形蛋白的上调以及E-钙黏蛋白的下调。茯苓新酸A和LOS的治疗抑制了ERS的激活，并减轻了UUO小鼠肾组织中的异常EMT。分子对接和MDS结果表明，茯苓新酸A与GRP78和ATF4形成了稳定的复合物，这进一步表明ERS可能是茯苓新酸A发挥抗纤维化作用的潜在信号通路。
广泛认为，ERS响应时CHOP的表达会上调，CHOP通过抑制Bcl-2的表达来触发细胞凋亡（23）。在我们的研究中，蛋白质印迹和免疫组化结果显示，模型组中CHOP的表达显著上调，提示ERS的凋亡通路被激活。TUNEL试验结果表明，UUO诱导了UUO小鼠肾小管上皮细胞的凋亡，而茯苓新酸A的治疗显著逆转了这一效应。GRP78是ERS相关的标志性蛋白，当ERS被激活时，GRP78显著增加（24）。当内质网（ER）处于正常生理状态时，三个感应因子ATF6、PERK和IRE1通过与GRP78结合而失活。当ERS被激活时，GRP78与未折叠蛋白的结合增加，导致PERK、I/RE1和ATF6从GRP78上解离，从而启动未折叠蛋白反应（UPR）并激活下游通路，如PERK轴（25,26）。随后，PERK的激活促进了eif-2a的磷酸化，并增强了ATF4的翻译。ATF4的上调诱导了CHOP的表达，从而导致细胞凋亡（26,27）。在本研究中，GRP78、ATF4、p-PERK和p-eif-2a的表达显著增加，这证实了之前的结果，表明UUO小鼠中发生了ERS。
ERS和UPR被认为是细胞和生物体的保护机制，而过度的ERS会破坏UPR的稳态，引起炎症、凋亡和氧化应激（27）。值得注意的是，UPR的三条通路可能不会同时被激活（28），PERK-eIF2a-ATF4-CHOP（15）和IRE1a-XBP1s通路（22）与多种疾病的相关性已被广泛研究。然而，本研究证明，茯苓新酸A抗肾纤维化的作用仅与PERK-eIF2a-ATF4-CHOP信号通路相关，这与之前报道的UUO小鼠中肾素的作用机制一致（29）。此外，Chen等（30）报道，连翘苷A可以通过PERK-eIF2a-ATF4-CHOP通路介导的凋亡和炎症减轻脓毒症诱导的急性肾损伤，这与我们的结果一致。这些发现表明，ERS通过PERK-eIF2a-ATF4-CHOP信号通路在肾脏疾病的发生和发展中发挥着重要作用。
目前有大量研究表明，中药可以预防多种肾脏疾病，且副作用较少（31）。越来越多含有茯苓的方剂显示出肾脏保护作用，如五苓散和金匮肾气丸（32,33）。我们之前的研究也表明，茯苓表皮可以改善慢性肾损伤大鼠的肾功能，其肾脏保护作用的机制涉及脂肪酸代谢、磷脂代谢、色氨酸代谢和嘌呤代谢（34）。四环三萜类化合物被认为是茯苓的活性化学成分，其中茯苓新酸A是主要成分（34,35）。茯苓新酸A在多种疾病中显示出有前景的药理活性，如肾纤维化（36）、糖尿病肾病（37）、心肌梗死（38）和急性淋巴细胞白血病（39）。尽管之前的研究已经证明，茯苓新酸A的抗肾纤维化作用与Sirt3/β-catenin（36）和AMPK信号通路（15）相关，但其抗纤维化活性与ERS的关系仍不清楚。
在本研究中，我们首先证明了肾间质纤维化的发展伴随着ERS的激活，并且茯苓新酸A可以通过抑制ERS激活介导的细胞凋亡来减轻肾纤维化。然而，目前关于茯苓新酸A抗纤维化活性的研究大多集中在细胞和动物模型上，需要进一步的临床试验来证实其对人类的实际效果。此外，由于疾病发生的复杂性和研究方法的局限性，茯苓新酸A的抗纤维化机制尚未完全揭示。未来应应用多种有效的新测序技术，如代谢组学、转录组学和微生物组学，进一步探索茯苓新酸A的机制。这一方向将为茯苓新酸A的临床应用提供坚实基础。
图6. 茯苓新酸A（PAA）与GRP78（A）和ATF4（B）的分子对接和分子动力学模拟（MDS）分析。（C）PAA-GRP78/ATF4复合物的均方根偏差和（D）回旋半径分析。（E）PAA与GRP78或ATF4之间形成的氢键数量。（F）PAA-GRP78复合物和（G）PAA-ATF4复合物的均方根涨落分析。
图7. 茯苓新酸A（PAA）通过抑制内质网应激（ERS）介导的凋亡来对抗肾纤维化的机制图。PAA对抗肾纤维化的潜在机制与抑制PERK-eIF2α-ATF4-CHOP信号通路以及随后发生的ERS相关凋亡有关。ER：内质网。
结论
综上所述，本研究表明，茯苓新酸A可以通过抑制ERS介导的细胞凋亡来减轻UUO小鼠的肾纤维化。靶向ERS通路可能提供一种潜在的治疗策略，以抑制肾间质纤维化的进展并改善肾功能。
资助
本研究得到陕西省科学基础研究计划（项目编号：2022-JQ-920和2023-JC-QN-0966）、西安市卫生健康委员会基础研究计划（项目编号：2022yb41）、西安市科技局医学研究计划（项目编号：23YXYJ0106）和西安国际医学中心医院基金会（项目编号：2023QN04和2021QN026）的支持。
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