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摘要
背景
通过有效的龈上洁治和龈下刮治（SRP）去除微生物沉积物（菌斑和牙石）是管理牙周病（牙龈炎和牙周炎）的基本步骤。此外，还以各种形式的漱口水、凝胶和牙膏作为SRP的辅助手段来管理牙周炎。近年来，枸杞（Lycium barbarum，又称枸杞子或狼莓）因其在管理慢性炎症和感染性疾病方面的作用而广受欢迎。然而，其在管理牙周炎方面的疗效尚未得到探讨。因此，本研究旨在评估枸杞子漱口水与氯己定漱口水在管理牙周炎方面的疗效。
方法
60名成年参与者通过计算机生成的随机序列随机分为两组（试验组：枸杞子漱口水（男性：16名；女性：14名）；对照组：0.2%葡萄糖酸氯己定漱口水（男性：14名；女性：16名））。在基线时、15天和一个月时，记录牙龈指数（Gi）、菌斑指数（Pi）、探诊出血（BOP）、临床附着丧失（CAL）、探诊牙周袋深度（PPD）、微生物负荷和唾液中抗氧化剂水平（蛋白质巯基）的变化。
结果
从基线到一个月，对照组（P值分别为0.006、0.027、0.000和0.036）和试验组（P值分别为0.035、0.000、0.034和0.000）的平均PPD、Pi、BOP和Gi均显著降低。然而，只有试验组的唾液抗氧化剂水平（蛋白质巯基）显著升高。
结论
枸杞子漱口水联合SRP可降低牙周炎患者的Gi、Pi、BOP和PPD。然而，枸杞子漱口水和氯己定漱口水的使用之间未观察到统计学显著差异。在提高唾液抗氧化剂水平方面，枸杞子漱口水比氯己定更有效。
引言
牙周炎被定义为一种影响牙齿周围软组织的慢性免疫炎症性多因素疾病。1 重度牙周炎和无牙症是重大的公共卫生挑战，预计未来几十年受影响的人数将大幅增加。2021年，全球有超过10亿人患有重度牙周炎，年龄标准化患病率为12.50%。南亚的患病率最高，为17.57%。有理由推测，到2050年，重度牙周炎将成为全球影响残疾生命年数最多的4级疾病/状况之一。2 男性患病率高于女性。牙周炎主要由口腔微生物与宿主（牙齿周围软组织）的相互作用引起。这种宿主-微生物相互作用会引发大量促炎介质、微生物副产物、蛋白水解酶和自由基活性氧（ROS）的涌入，从而导致牙周硬组织和软组织破坏及炎症增加。3–6 由于牙周炎期间ROS增加，因此也被称为自由基介导的组织损伤。7 一些与牙周炎相关的常见假定牙周微生物包括牙龈卟啉单胞菌、福赛坦氏菌、齿垢密螺旋体、直肠弯曲菌和具核梭杆菌。7 除了微生物病因外，其他风险因素如吸烟、糖尿病、艾滋病、营养不良、药物、口腔卫生不良和遗传因素也会影响牙周炎症的严重程度。8
为了控制牙周炎症，首要且最关键的一步是使用手动或机动器械进行有效机械清创，去除牙齿周围形成的口腔生物膜。9,10 有效的龈上洁治和龈下刮治（SRP）可以减轻牙龈炎症，从而阻止疾病进展并恢复牙龈健康。11 然而，研究表明，完全清除牙石在技术上具有挑战性，因为很多时候难以从深袋（>5 mm）和牙间隙区域去除硬组织和软组织沉积物。11,12 此外，由于深而蜿蜒的牙周袋、分叉区、牙根凹陷和不规则牙根等区域缺乏良好的可见性和可达性，因此难以完全去除这些区域的光滑或抛光牙石。12,13 因此，为了管理深而曲折的牙周袋中的生物膜，需要额外的牙周治疗和使用辅助手段。12–15
还应注意到，SRP的疗效取决于患者遵循细致口腔卫生方案和在家有效控制牙菌斑的依从性和积极性。16 如果患者依从性差，不能有效遵循口腔卫生指导，仅靠SRP可能不足以维持所需的牙菌斑控制。此外，研究表明，即使在良好的牙菌斑控制方案下，牙齿的后部、腭侧和舌侧表面仍会残留一定量的牙菌斑。因此，对于许多患者，建议使用漱口水和凝胶等辅助手段配合常规刷牙。11,17–24 各种具有抗菌和抗炎作用的化学牙菌斑控制剂以漱口水、凝胶、牙龈涂料、纤维、清漆、微球、芯片、片剂、粉末和胶囊等形式用于管理牙龈炎和牙周炎。在这些制剂中，葡萄糖酸氯己定是最受欢迎且常规用于管理牙周炎的制剂。此外，最近的报告显示，使用氯己定没有额外益处，并且许多口腔细菌对氯己定分子产生了抗药性。25–29 由于味觉改变、牙齿和软组织（如舌头和黏膜）染色、牙石形成增加和腮腺肿胀等各种副作用，长期使用氯己定是禁忌的。25 氯己定还对牙龈成纤维细胞、26 牙周韧带27 和成骨细胞28 具有细胞毒性作用。
因此，使用具有抗氧化和抗菌特性的天然和草本提取物来治疗牙周疾病已成为一种新兴趋势。已经尝试使用来自苦楝、罗勒、番石榴、绿茶、姜黄、姜黄素、石榴和许多其他植物的草本提取物来有效治疗牙龈炎和牙周炎。30–34 由于牙周病会导致大量ROS释放和氧化应激增加，因此常与SRP配合使用具有抗氧化潜力的辅助手段来控制牙龈和牙周组织局部的氧化应激。最近，枸杞子（俗称狼莓、喜马拉雅枸杞或西藏枸杞）因其强大的抗氧化和抗炎特性而广受欢迎。35–46
枸杞子，学名为Lycium barbarum（L. barbarum），是原产于东南欧、中国和亚洲的一种水果。35 该水果属于茄科，可新鲜或干燥食用。它具有强大的抗氧化、抗菌、免疫调节和抗癌特性。36–46 它被用于治疗许多炎症性和感染性疾病，包括口腔疾病。36–46 Soesanto等人（2021年）的研究表明，L. barbarum的乙醇提取物在100 μg/mL时对口腔细菌（变异链球菌和牙龈卟啉单胞菌）有效。47 先前的体外研究也报告称，L. barbarum的最小抑菌浓度（MIC）在抑制口腔细菌方面与氯己定相当，但其疗效低于抗生素多西环素。在50 μg/mL时，枸杞子的乙醇提取物可以抑制大多数牙周病原菌。48,49 然而，尚未有临床研究评估枸杞子漱口水作为SRP的辅助手段在管理牙周炎方面的有效性。因此，本临床研究首次旨在评估L. barbarum漱口水联合SRP对牙周炎患者的疗效，并与氯己定进行比较。
研究目的包括：
与0.2%葡萄糖酸氯己定漱口水相比，评估L. barbarum（枸杞子）漱口水在基线时、15天和一个月时对菌斑指数（Pi）、牙龈指数（Gi）、探诊出血（BOP）、探诊牙周袋深度（PPD）和临床附着丧失（CAL）的影响。
评估和比较使用枸杞子漱口水和氯己定漱口水的受试者在15天和一个月时与基线相比唾液中蛋白质巯基水平的变化。
评估和比较使用L. barbarum漱口水的受试者与使用氯己定漱口水的受试者在一个月结束时与基线相比微生物数量的减少情况。
方法
试验设计
本研究设计为随机、双盲、单中心、平行臂临床试验，分配比例为1:1。本研究于2019年至2020年在“Manipal”进行，遵循“1975年赫尔辛基宣言（2000年修订）”。在获得Kasturba医学医院机构伦理委员会的伦理批准（IEC编号117/2019）后，启动了本试验。本试验在“临床试验注册中心（CTRI/2019/05/019042）”注册，并遵循CONSORT和SAGER指南（图1和图2）。48 临床试验的步骤如下所述：
漱口水配制
漱口水在“Manipal药学院”配制。L. barbarum漱口水通过Soxhlet法制备干燥枸杞子的乙醇提取物，并将50 μg/ml的称重枸杞子提取物溶解以配制漱口水，如之前所述。49 将50 μg/ml的浓度与1.15的100%酒精（乙醇）混合，然后使用15%甘油进行均质化。向其中加入约15%的丙二醇和1%的Tween溶液以配制漱口水。加入0.1%的薄荷醇以调整漱口水的口味。使用蒸馏水将体积调整至100%。加入100%酒精既作为防腐剂又作为溶剂。
漱口水稳定性评估
根据ICH指南测量漱口水的保质期，并在三种不同条件下对样品进行为期三个月的测试：“35°C ± 2°C，相对湿度60% ± 5%；25°C ± 2°C，相对湿度60% ± 5%；以及40°C ± 2°C，相对湿度75% ± 5%”。漱口水装在不透明的塑料瓶中，其中一瓶放在稳定性隔间（Thermo lab，印度）中。在基线时、一个月、两个月和三个月时，通过目视观察和紫外光谱分析（Shimadzu UV-1601PC，日本）对样品进行物理参数和稳定性分析。
临床研究设计
对90名20至50岁（男性和女性）的门诊患者进行筛查，根据2017年牙周病分类标准确定其是否存在局限性/广泛性牙周炎，并根据以下排除和纳入标准进行选择：50
图1. 研究设计的示意图（使用Biorender.com创建）。
图2. 受试者流程图。
纳入标准：
年龄在20-50岁之间，被诊断为Ⅰ期至Ⅱ期局限性/广泛性牙周炎（A级至B级）的受试者。
至少有24颗功能牙的受试者。
排除标准：
对氯己定有任何过敏反应的受试者。
患有任何系统性疾病的受试者，如高血压、糖尿病、心血管疾病、肾脏疾病和神经系统疾病。
在过去六个月内使用过任何抗炎药物、抗生素或止痛药的受试者。
孕妇或哺乳期母亲。
有任何口腔不良习惯的受试者，如吸烟、饮酒、嚼槟榔、古特卡（一种混合烟草和槟榔的制品）、嚼帕安（一种含有槟榔叶的混合物）、苏帕里（槟榔果的一种制品）和嚼食槟榔果。
在过去六个月内接受过任何牙周治疗/手术的受试者。
正在接受正畸治疗的受试者。
使用任何其他口腔卫生产品（漱口水或凝胶）的受试者被排除，以消除因菌斑控制措施差异引起的混杂偏倚。
所有符合上述标准的受试者在获得口头和书面知情同意后被纳入研究。
随机化、分配隐藏和盲法
筛选受试者后，共纳入了60名受试者。使用计算机生成的随机序列将受试者随机分配到试验组和对照组，具体如下：试验组（枸杞组，n=30）或对照组（0.2%氯己定葡萄糖酸盐漱口水（Hexidinie，ICPA健康产品，印度）组，n=30）。此样本量基于p值<0.05、双侧α值=0.05、功效=0.8和临床附着丧失（CAL）的效应量=0.7确定。
将受试者分为两组的工作由一名不参与生物样本收集、分析、牙周治疗（龈下刮治和根面平整，SRP）或临床或牙周检查的研究人员完成。分配隐藏通过将两种漱口水分装到大小相同的不透明琥珀色瓶子中给所有受试者使用来实现。给受试者分发瓶子的研究人员不知道漱口水的内容和性质。受试者也被对其所在组别及漱口水的内容保持盲态，尽管漱口水的味道无法匹配。分析临床数据的研究人员和统计学家不知道分组情况。分组后，在基线时收集以下生物样本：
a. 微生物菌斑样本收集
“使用无菌、特定位点的Gracey刮治器，从每个象限探诊深度最深的牙周袋中收集龈下区域的菌斑。收集后，立即将刮治器浸入减量运输培养基（添加了血红素和维生素K的硫乙醇酸盐培养基）中，以进行微生物学分析。对每个样本进行涡旋处理，并在不同稀释度（1:10、1:100、1:1000和1:10000）下进行定量培养。将每个稀释度中的10 μl样本接种到预还原的5%羊血琼脂（BD，Becton Dickinson，德国海德堡）上，并在厌氧室（Whitley A35厌氧工作站，Don Whitley Scientific，英国Shipley）中于37°C孵育48小时。使用以下公式分析每个样本的菌落形成单位：CFU/mL =（菌落数 × 稀释倍数）/培养板中的样本体积。”
b. 唾液收集
菌斑收集后，遵循严格的唾液收集方法。要求所有受试者以舒适的直立姿势坐好。随后，采用“吐唾法”在无刺激的情况下收集约2ml唾液。51要求所有受试者将唾液吐入Eppendorf离心管中。收集到的唾液立即存储在-80°C的冰箱中。用于存储唾液样本的Eppendorf离心管根据受试者编号进行数字标记。收集的唾液被送往进行生化分析，使用Ellman试剂评估蛋白质巯基水平。在室温下孵育约五分钟后，测量试剂的吸光度（412 nm），并根据谷胱甘肽的标准曲线确定蛋白质巯基的浓度。
c. 临床牙周参数检查
唾液样本收集后，对所有受试者的所有六个区段进行牙周检查。记录以下牙周参数：Loe & Silness 1963年的牙龈指数（Gi）；探诊出血（BOP）位点的百分比；Silness & Loe 1964年的菌斑指数（Pi）；探诊深度（PD）和临床附着丧失（CAL）。所有临床评估均由对受试者分组情况保持盲态的研究人员完成。使用Williams牙周探针（Hu-Friedy，美国）记录BOP、PPD和CAL。通过检查所有牙齿的四个表面（颊面、舌面、近中和远中）的出血情况来确定BOP位点。BOP位点的百分比通过计算有BOP的牙齿数量占总牙齿数量的百分比来得出。在颊面、近中、远中和舌面计算PPD和CAL。在牙间隙（近中和远中）区域，从颊面和舌面进行探诊。记录每个表面的最深牙周袋深度。将牙间隙每侧的牙周袋平均深度以及颊面和舌面的探诊深度视为该牙齿的最终PD。通过将所有牙齿的读数相加并除以总牙齿数量来评估平均PPD和CAL。
在所有受试者完成牙周检查和样本收集后，开始进行全面的龈下刮治和根面平整（SRP）。一名经过培训的研究人员对所有患者的基线和随访访视进行检查。主管评估刮治情况，以确保完全去除菌斑和牙石。指导所有患者采用改良Bass刷牙法，每日两次，每次两分钟，以消除因口腔卫生措施差异引起的任何混杂效应。给所有受试者发放编码的（AX或BX）不透明琥珀色瓶子。这是为了使受试者和研究人员对给予受试者的漱口水类型保持盲态。指示所有患者每日两次使用10ml枸杞漱口水（用10ml水稀释）漱口30-45秒，持续一个月。对于氯己定漱口水（印度Hexidine漱口水），要求受试者使用未稀释的漱口水。在15天和一个月后召回患者进行重新评估。在每次召回访视时，临床记录Pi、Gi、BOP位点的百分比、CAL和PPD。在每次召回访视时，还从相同位点收集菌斑和唾液样本。每次召回访视时，对每位受试者的检查均由同一研究人员完成。
统计分析
使用“SPSS 26.0版，IBM”分析获得的数据。对于描述性数据频率和分类数据，使用“Kolmogorov-Smirnov检验”分析所有数值数据的均值和标准差。检查所有变量的分布正态性。使用“独立样本t检验”对所有评估结果进行组间比较。比较枸杞漱口水和氯己定漱口水，使用“重复测量ANOVA（带Geisser校正）”测量从基线到15天和一个月的任何显著增加/减少，随后进行“Bonferroni调整的事后分析”。在调整相应基线评分后，使用ANCOVA进行随访时所有变量减少的组间比较。p值小于0.05被认为具有显著性。
结果
漱口水稳定性结果显示，在三个月内，颜色、气味、一致性或相分离均无变化。在274nm下进行紫外线分析时，样本未显示任何变化。这表明漱口水在三个月结束时仍然稳定（表1）。
临床试验结果：在评估的90名受试者中，30名因不符合纳入标准而被排除。其余60名受试者被分配到试验组（n=30）和对照组（n=30）。试验组受试者的平均年龄为35.42 ± 11.79岁，对照组为32.12 ± 12.85岁。试验组的性别分布为男性：16人；女性：14人，对照组为男性：14人；女性：16人（表2）。每组30名患者中，试验组有14名患者、对照组有16名患者因COVID-19突然实施的封锁而未前来接受随访访视。此外，试验组中有1名患者报告枸杞漱口水味道苦涩，并停止使用漱口水。因此，分析中纳入了试验组的15名患者和对照组的14名患者。枸杞漱口水和氯己定漱口水之间的比较显示，Pi（p=0.470）、Gi（p=0.239）、BOP（p=0.450）、PPD（p=0.216）、CAL（p=0.220）和微生物水平（p=0.251）的均值无显著差异（表3）。
组内比较显示，从基线到一个月，对照组和试验组的平均PPD、Pi、BOP和Gi以及抗氧化能力均显著降低。与枸杞组相比，仅氯己定组的CAL显著降低（表3，表4）。试验组的BOP位点百分比从基线的84.8 ± 0.32降低到六个月结束时的09.0 ± 0.32。这些结果与对照组相当，试验组和对照组之间无统计学显著差异。仅在枸杞组，一个月结束时唾液中的抗氧化剂水平（蛋白质巯基）有显著差异。氯己定组的唾液抗氧化剂水平未发生变化。在任何给定时间，两组的对数转换微生物CFU计数均未报告显著差异。在试验组中，平均Pi从基线的1.6 ± 0.38降低到一个月的0.89 ± 0.17。然而，在枸杞漱口水的情况下，15天随访时的平均PPD（1.73 ± 0.45）相较于基线（2.76 ± 1.06）有所降低。
在调整相应基线评分后，使用ANCOVA对一个月随访（15天和一个月）时的组间比较进行分析。两组之间的Pi（p=0.791）、Gi（p=0.594）、PPD（p=0.134）、蛋白质巯基水平（p=0.211）和微生物水平（p=0.188）的均值无差异（表4）。未报告任何患者出现不良反应。
表1. 漱口水的物理性质及稳定性评估。
表2. 各组的人口统计学数据。
表3. 组间和组内基线、15天及1个月随访评分的比较。
表4. 调整基线值后一个月随访的组间比较。
讨论
本研究是首项评估枸杞漱口水在牙周炎管理中的作用的临床试验。
本研究比较了枸杞漱口水与0.2%氯己定漱口水在控制牙龈炎症、菌斑形成、探诊出血（BOP）、探诊深度（PPD）、临床附着丧失（CAL）、微生物谱和唾液抗氧化剂水平（蛋白质巯基）方面的疗效。我们发现，使用枸杞漱口水后，牙龈指数（Gi）、菌斑指数（Pi）、BOP和PPD的平均减少程度与氯己定漱口水相当。在减少CAL方面，氯己定漱口水的效果优于枸杞漱口水。然而，在一个月结束时，我们未发现枸杞漱口水与氯己定漱口水在Gi、Pi、BOP和PPD方面存在统计学上的显著差异。我们将枸杞漱口水与氯己定进行比较，因为氯己定被认为是管理牙周炎患者的金标准漱口水。然而，在当前口腔细菌对氯己定产生耐药性的时代，有必要寻找氯己定的可行替代品来管理牙周炎。51–54此外，由于不建议长期使用氯己定超过一个月，且口腔细菌可能在10天内产生耐药性，因此本初步研究仅采用了较小的试点样本量，并进行了一个月的回访。55,56为避免各种副作用（如味觉改变、着色和牙石增多）的发生，禁止长期和连续使用氯己定，因此氯己定的替代品变得尤为重要。Costa等（2017）在一项系统评价和荟萃分析中也得出结论，与仅使用龈下刮治和根面平整（SRP）相比，氯己定作为SRP的辅助用药仅能使PPD轻微减少。因此，临床医生在给患者开具氯己定处方时，应考虑其PPD减少的微小额外获益、对CAL的忽略不计的影响以及潜在的副作用。52–54
根据我们的研究结果，枸杞漱口水增加了唾液中的蛋白质巯基水平，而氯己定则没有这一效果。这一积极发现表明，与氯己定相比，枸杞在增加牙周炎患者唾液中的抗氧化剂水平方面具有优势。由于牙周炎与氧化应激增加和自由基介导的组织损伤有关，因此使用具有抗氧化特性的化合物（如枸杞）将有助于控制并减少氧化应激和牙周炎症。唾液中抗氧化剂水平的增加可归因于枸杞中存在的枸杞多糖（LBPs）、儿茶素、表儿茶素、槲皮素、绿原酸、柠檬酸、香豆酸、东莨菪亭、亚油酸、山奈酚和香豆酸。51–58枸杞中的黄酮类化合物已被证明具有良好的抗菌效果，这解释了使用枸杞漱口水后Pi的减少和牙龈炎症的控制。59牙龈炎症的减轻还可以归因于枸杞抑制促炎细胞因子、自由基清除活性和与其他抗氧化剂的相互作用的能力。先前的研究表明，枸杞可以促进成纤维细胞的愈合并增加胶原蛋白的形成，这可能有助于牙周袋的愈合和临床附着水平的改善。41,60–63
Sanghavi等（2022）的另一项研究也指出，枸杞对牙周病原菌（牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌、具核梭杆菌、中间普氏菌、福赛坦氏菌）具有良好的抗菌、抗粘附和抗生物膜特性。枸杞提取物可以抑制所有这些关键牙周病原菌的生长，但与多西环素和氯己定相比，其抑菌圈较小。枸杞的抗粘附特性（96%）与氯己定（96.3%）相当。然而，氯己定的抗生物膜活性（96%）略优于枸杞提取物（91.6%）。49
Du等（2014）和Ren等（2012）的研究还发现，补充枸杞可以促进感染部位中性粒细胞和单核细胞的成熟和募集。64,65枸杞调节免疫细胞的能力也证明了其控制炎症的能力，这将有助于降低微生物负荷和控制牙周炎症。Lai等（2022）进行了一项体外和动物研究，以评估枸杞处理后人牙周韧带干细胞的碱性磷酸酶活性和成骨潜能，并发现枸杞可以促进干细胞的增殖和迁移。这可以促进更好的愈合和控制牙龈炎症。该研究还注意到牙槽骨吸收减少。66
因此，根据我们的研究结果和现有证据，可以认为枸杞漱口水具有良好的抗菌和抗氧化特性，可用于管理牙周炎，并可作为SRP的辅助手段。然而，也应注意到，本研究仅评估了枸杞在一个月的短期回访时间内的作用，并避免了长时间暴露于氯己定漱口水以防止副作用。同时还应注意到，尽管使用了编码的琥珀色瓶子来掩盖漱口水的颜色以使患者保持盲态，但每种漱口水的味道是不同的。漱口水未进行校准。本研究是在轻度至中度牙周炎患者中进行的。因此，未来的研究应评估枸杞漱口水在更长时间随访内管理牙周炎的疗效。未来的研究还应评估枸杞对特定牙周病原菌或牙周炎的局部和全身炎症标志物的影响。
结论
枸杞漱口水联合SRP可有效减少牙周炎患者的Gi、Pi、BOP和PPD。使用枸杞漱口水与氯己定漱口水之间未观察到统计学上的显著差异。然而，枸杞漱口水在增加唾液抗氧化剂水平（蛋白质巯基）方面比氯己定更有效。
伦理声明
本研究在获得卡斯图尔巴医学院和卡斯图尔巴医院伦理委员会的伦理批准后进行，伦理委员会编号为：IEC no: 117/2019。本试验已在“临床试验注册表（CTRI/2019/05/019042）”中注册。
