题目：Activation of Piezo1 Channels in Compressed Red Blood Cells Augments Platelet-Driven Contraction of Blood Clots
作者：Natalia G. Evtugina, Alina D. Peshkova, Alina I. Khabirova, Izabella A. Andrianova,Shahnoza Abdullayeva, Francis Ayombil, Taisia Shepeliuk, Ekaterina L. Grishchuk,Fazoil I. Ataullakhanov, Rustem I. Litvinov, John W. Weisel
杂志：Journal of Thrombosis and Haemostasis
发表时间：25 May 2023
DOI：https://doi.org/10.1016/j.jtha.2023.05.022
研究背景：
自从发现机械敏感受体（如PIEZO1）以来，研究这些机械转导子在各种（病理）生理过程中的功能已成为一个蓬勃发展的研究领域，目前已涉及血栓形成和止血。Piezo1是一种机械敏感的膜离子通道，由包括血细胞在内的多种细胞类型表达。Piezo1嵌入质膜中，对细胞的任何机械扰动都很敏感，在刺激时对阳离子具有选择性渗透性。个体Piezo1是一种类似螺旋桨叶片的三聚体蛋白，对膜畸变敏感，中间有一个孔，用于离子通过细胞膜响应构象激活。在细胞中，Piezo1传递各种来源的“由外而外”和“由内而外”的机械力信号，包括压缩、膜拉伸、剪切应力、细胞外基质硬度和渗透压。机械应激的细胞膜诱导Piezo1从闭合状态向开放状态的构象转变，允许Ca2+、K+和Na+阳离子通过膜的梯度依赖性扩散，并调节各种细胞功能，如蛋白质合成、分泌、迁移、增殖和凋亡，以响应机械刺激。特别重要的是Piezo1诱导钙离子流入细胞的能力。血栓的收缩或回缩是由活化血小板产生的收缩力驱动的血栓收缩过程。止血凝块或病理性阻塞性血栓形成后，血管内或伤口内的凝块收缩在体外和体内都会发生。临床研究表明，血栓形成前患者的血栓收缩能力受损，这可能反映了血栓并发症病程和结果恶化的致病机制。 在血栓收缩过程中，活化的血小板产生收缩力，通过纤维蛋白网络分布，导致血栓体积减少。除了整体体积收缩外，在收缩过程中，凝块组分在空间中重新分布，从而使收缩的血小板纤维蛋白网积聚在凝块的外围，并在内部积聚密集的红细胞。在外部压力下，核心中的RBCs紧密堆积、压缩，并呈多面体形状，因此被命名为“多面体细胞”或“压电细胞”。由于血栓的收缩伴随着血细胞的变形，因此有充分的理由假设血栓收缩涉及Piezo1的激活，主要是在红细胞和/或血小板中。Piezo1激活与经历机械扰动的RBCs的各种生物特性之间的既定关系支持了这一假设。本研究的目的是探索血细胞中Piezo1的激活是否可能包括血栓收缩的调节机制。研究结果：
1.Piezo1的化学激活和抑制对全血凝块收缩的影响由于Piezo1强烈依赖于细胞外[Ca2+]，因此用大豆胰蛋白酶抑制剂对血液进行抗凝，该抑制剂可防止血液凝固，同时将生理[Ca2+]维持在1.1-1.4m的水平。血细胞中的Piezo1通过添加特异性激动剂Yoda1而被激活，或通过添加肽拮抗剂GsMTx-4而被抑制。在用Yoda1或GsMTx-4孵育后，用凝血酶凝结血液，并与对照样品平行地光学跟踪宏观凝块大小。如图A所示,与对照组相比，Yoda1导致收缩的中值显著增加约23%，而GsMTx-4显著抑制收缩约17%。值得注意的是，Yoda1的收缩率实际上在最初~15分钟内落后于对照组(图B)，之后超过了对照组，表明收缩延迟增强，可能与凝血酶促进血小板收缩所需的时间有关。 早期的研究表明钙离子载体对血块收缩有强烈的刺激作用。为了直接比较Yoda1和钙离子载体的作用，在不存在和存在钙离子载体A23187的情况下，通过凝血酶启动含Ca2+血液样品中的凝块收缩。A23187对血块收缩程度的刺激作用（平均约23%）与Yoda1相当，表明细胞内Ca2+内流的最终功能后果不取决于Ca2+进入的机制。然而，在A23187存在下增强的凝块收缩的总体动力学特征与通过添加Yoda1获得的不同（图B），表明Yoda1的刺激作用不仅仅归因于增加细胞内[Ca2+]。总之，所获得的结果表明，RBCs或血小板中的机械敏感性Piezo1离子通道的化学刺激增强了血栓的收缩，并且这种作用是Ca2+依赖性的。![]()
图1:Piezo1通道的激活剂（Yoda1）和抑制剂（GsMTx-4）以及Ca2+离子载体（A23187）对全血凝块收缩的影响。
2.Piezo1在红细胞、血小板和白细胞中在血栓收缩中的不同作用为了区分Piezo1在红细胞和血小板中的作用，在不存在红细胞的情况下，在富含血小板的血浆中形成的凝块中评估了Piezo 1的激活和抑制对凝块收缩的影响。Piezo1拮抗剂GsMTx-4的加入显著抑制了血浆凝块的收缩（图2），就像在全血凝块中一样（图1）。令人惊讶的是，在Piezo1激动剂Yoda1存在的情况下，与对照组相比，含血小板血浆中形成的凝块的收缩程度略有下降，具有统计学意义（p=0.05，图2），这与Yoda1对全血中凝块收缩的激活作用不同（图1）。这些结果表明，至少在这些特定的实验条件下，Piezo1在RBCs中对血栓收缩至关重要。 ![]()
图2:Piezo1通道的激活剂（Yoda1）和抑制剂（GsMTx-4）对富血小板血浆中形成的凝块收缩的影响。
3.Yoda1诱导红细胞体积收缩作为增强血栓收缩的机制Piezo1阳离子通道的激活与红细胞脱水和单个红细胞的体积收缩有关[29]。为了直接解决Yoda1是否在血块收缩过程中降低红细胞大小的问题，通过在不存在和存在Yoda1的情况下对含Ca2+的全血样本（用玉米胰蛋白酶抑制剂稳定）中形成的收缩血块进行扫描电子显微镜测量了红细胞大小。两个凝块的内部都含有紧密堆积的压缩多面体RBCs（多面体细胞）（图A、B）。单个RBCs的精确形态计量显示，在Yoda1存在的情况下，RBCs的中值尺寸减小了约25%（图C），表明Yoda1诱导的RBCs脱水和体积收缩，其包括通过激活RBCs中的Piezo1增强整个血栓收缩的结构机制。 ![]()
图3:Piezo1激活剂Yoda1对由含Ca2+的全血样本制成的收缩凝块内RBCs大小的影响。
4.Yoda1诱导RBCs和血小板上磷脂酰丝氨酸的外化和内源性凝血酶的产生为了验证Yoda1诱导的RBCs上的磷脂酰丝氨酸暴露增强凝血酶生成，在补充有对照（DMSO处理）或Yoda1激活的RBCs的无血小板血浆中进行凝血酶生成测定和血栓弹性成像（TEG）（图4、5）。RBCs与Yoda1在Ca2+存在下孵育导致凝血酶峰值浓度、内源性凝血酶电位显著增加，并缩短凝血酶生成测定中达到峰值的时间（图4）。此外，TEG显示，在Yoda1激活的RBCs存在的情况下，血浆凝固时间（R）显著缩短，凝块强化率（α）增加（图5），反映出凝血酶活性增加。总之，这些结果证实Yoda1对凝块收缩的影响是由于磷脂酰丝氨酸的过表达导致的RBC介导的内源性凝血酶产生。测试Piezo1介导的RBCs刺激、内源性凝血酶形成和血小板收缩性刺激之间关系的一种独立方法是使用利伐沙班，这是因子Xa的直接抑制剂，在添加Yoda1之前添加到血液中。如图6所示，利伐沙班消除了Yoda1对血栓收缩的激活作用，这再次证实了内源性凝血酶作为RBCs中Piezo1激活的介质和血小板收缩性的刺激因子的作用。 ![]()
图4:凝血酶生成测定显示Yoda1激活的RBCs诱导的凝血酶形成增加。
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图5:Yoda1激活的RBCs的促凝血活性增强。
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图6:在不存在和存在内源性凝血酶生成抑制剂利伐沙班（1µM）的情况下，Yoda1（5µM）对血栓收缩的影响。
5.血块收缩导致RBCs中的Piezo1激活，随后Ca2+流入和磷脂酰丝氨酸暴露 为了直接说明血凝块收缩过程中Piezo1的激活，研究使用了含有预先负载Ca2+敏感荧光染料Fluo-4 AM的分离的人红细胞的重组血液样本。将这些染料填充的RBC添加到新鲜的富含血小板的血浆中，血细胞比容高达30%，然后再进行再钙化和凝血酶诱导的宏观凝块的形成和收缩。洗涤、分解和溶血在各种实验条件下形成的凝块，以释放RBCs的细胞内细胞质含量，包括Fluo-4。结果如图所示7显示，与在latrunculin a存在下形成的未收缩凝块相比，无约束的血块收缩的特征在于嵌入凝块的RBCs中的细胞内[Ca2+]i显著更高，尽管GsMTx-4对细胞内Ca2+含量的抑制作用较弱。用作阳性对照的钙离子载体A23187显著增强了Ca2+进入收缩的血块内的压缩RBCs。![]()
图7:在凝块收缩过程中，Piezo1介导Ca2+流入压缩的RBCs。
研究结论：
RBCs中的Piezo1激活导致内源性凝血酶的产生，内源性凝血酶是血小板收缩功能的强大生理刺激因子。所提出的通过激活变形RBCs中的Piezo1通道导致血栓收缩的自扩增反应序列如图所示。 ![]()
未来研究思考：
许多已发表的报告清楚地表明，体内血细胞中Piezo1的激活是真实的。在血细胞（主要是红细胞和血小板）中表达的机械敏感性Piezo1离子通道是血细胞生物力学和凝血之间的新分子介质。与任何新认识和研究不足的具有相关病理生理机制的结构一样，Piezo1阳离子通道是潜在的治疗靶点。参考文献：
Evtugina NG, Peshkova AD, Khabirova AI, Andrianova IA, Abdullayeva S, Ayombil F, Shepeliuk T, Grishchuk EL, Ataullakhanov FI, Litvinov RI, Weisel JW. Activation of Piezo1 channels in compressed red blood cells augments platelet-driven contraction of blood clots. J Thromb Haemost. 2023 Sep;21(9):2418-2429. doi: 10.1016/j.jtha.2023.05.022IF10.4Q1 . Epub 2023 Jun 1. PMID: 37268065.
