杂志：Circulation
发表时间：2023,2,21
DOI：10.1161/CIRCULATIONAHA.122.058794
细胞衰老目前被认为是一个关键的生物学过程，发生在多种生理和病理条件下，包括组织重塑、癌症和衰老。它存在稳定的增殖停滞，同时获得特异性衰老相关分泌表型(SASP)。
肺动脉高压(PH)是一种主要由肺血管细胞(包括平滑肌细胞)增生引起的增生性疾病。肺内皮细胞(P-ECs)功能障碍在PH中具有明确的致病作用。衰老细胞（SCs）参与增殖性疾病，但它们在肺动脉高压中的作用仍未确定。SCs是否在健康或老化肺的血管中发挥稳态作用，以及它们是否影响PH的发生或进展，目前仍有争议。
方法与结果：
方法
特发性PAH患者的细胞衰老与肺血管重构相关。与对照肺相比，患者肺的衰老标志物p16和p21蛋白以及DNA损伤标志物γ-H2AX蛋白水平较高(图1A)。对特发性PAH患者重塑的肺血管进行的免疫荧光研究表明，在DNA损伤标志物γ-H2AX和53BP1染色的细胞中，p16染色明显(图1B和图1C)。如分别对p16和αSMA以及CD31进行的双重免疫荧光染色所示，p16蛋白的免疫荧光染色主要见于肥大的肺血管中的PA-SMCs和PECs(图1D和1E)。相反，对照组肺组织中p16免疫染色活性较弱。p16、p21、γ-H2AX水平与患者年龄无关。
慢性低氧暴露与小鼠肺细胞衰老增加相关。与常氧相比，野生型小鼠在低氧条件下，肺p16、p21和γ-H2AX蛋白水平随着时间的推移而增加(图2A)。由于在健康常氧小鼠中检测到大量肺p16水平，因此在Tabula Muris Senis lung scRNA-seq数据集中评估了p16阳性细胞的分布和数量，p16的上调在P-ECs中占主导地位，P-ECs占健康小鼠中表达p16的肺细胞的近30%(图2B)。在暴露于不同缺氧时间的小鼠中，免疫荧光研究表明p16肺染色逐渐增加，与53BP1共定位，并主要分布于肥大肺血管中ICAM -1阳性的微血管P-EC和α-SMA阳性的PA-SMCs，在缺氧21日时达到峰值(图2C)。
Result 3
为了评估衰老细胞消除的影响，该研究做了表达rapalog AP20187激活的诱导自杀基因(caspase 8)的p16-ATTAC小鼠。在p16-ATTAC小鼠中，与对照组相比，在缺氧暴露前开始的AP20187 (0.5 μg/g，每周2次)使肺p16和p21 mRNA水平以及肺p16蛋白水平降低至常氧对照值(图3A和图3B)。AP20187有效地清除了慢性低氧小鼠中的衰老细胞，包括p16染色的细胞，也染色53BP1, p16-和icam -1阳性的微血管p - ec和α- smo阳性的PA-SMCs(图3C)。
在p16-ATTAC小鼠中，与慢性缺氧和溶剂相比，同时慢性缺氧和AP20187加重了PH，增加了右心室收缩压(RVSP)、富尔顿指数(右心室重量/左心室加室间隔重量)、远端肺动脉肌化和增殖细胞核抗原(PCNA)阳性分裂的肺血管细胞(图3D)。与溶剂处理的正常氧小鼠相比，ap20187处理的常氧小鼠的RVSP和Fulton指数、肺动脉肌化和pcna染色细胞也增加(图3D)。在常氧和低氧小鼠中，AP20187均显著减少了通过ICAM-1和IB4染色确定的肺P-EC(图3C和3E)
Result 4
为了测试对野生型小鼠进行药理学衰老细胞消除是否产生与对p16-ATTAC小鼠进行遗传干预相似的效果，该研究使用了两种抗衰老药物ABT263 (navitoclax)和FOXO4- dri肽。
为了研究navitoclax对预先建立的PH的影响，我们从第15天至第30天对小鼠进行缺氧或常氧处理。与慢性缺氧的溶剂处理的野生型小鼠相比，口服Navitoclax 50 mg·kg-1·d-1可有效抑制肺血管内p16阳性细胞聚集(图4A)，降低肺p16和γ-H2AX蛋白水平(图4C)，并加重PH，显著增加RVSP、Fulton指数、肺动脉肌化和pcna染色的血管细胞(图4D)。
此外，在常氧小鼠中，navitoclax增加了RVSP，诱导了肺血管肌化，并增加了PCNA染色的细胞(图4D)。如IB4和ICAM1染色所示，在常氧和慢性低氧小鼠中，这些血流动力学变化与P-ECs丢失一致(图4A和图4D)。
Result 5
将给药navitoclax的常氧或低氧状态下的小鼠进行了肺转录组学分析。基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis)数据支持navitoclax导致整体细胞增殖增加(根据细胞周期和e2f -靶标签的早期富集，可能主要是平滑肌细胞，原因是平滑肌细胞基因标签在常氧或低氧小鼠的肺组织中富集)。
Result 6
由于衰老细胞清除对P-EC产生持续的有害影响，因此研究了navitoclax在接受VEGF受体拮抗剂Sugen治疗后是否改变了肺血流动力学，同时给予常氧和慢性低氧小鼠Sugen和navitoclax 3周。与给予溶媒(而非navitoclax)的对照组相比，两组的RVSP、Fulton指数、肺血管肌化和pcna染色细胞均增加(图6)。在常氧和缺氧期间，IB4或ICAM1染色的P-ECs均被Sugen显著抑制，并被ABT263进一步降低(图6)。
Result 7
p16失活或p16表达细胞的消除改变了老年常氧和低氧小鼠的肺血流动力学。
为了评估p16失活的长期影响，该研究将p16luc/luc小鼠与p16luc/+小鼠以及对照组p16+/+小鼠进行了比较，年龄为14至18个月。与年轻小鼠相比，年长的p16luc/+小鼠的胸腔生物发光增加，在慢性缺氧期间进一步增加。与p16+/+ 对照组小鼠相比，在常氧和缺氧期间，年长的p16luc/luc和p16luc/+小鼠表现出大量的RVSP增加，肌肉化的肺血管增加。Fulton指数在3个小鼠品系中没有差异，但暴露于慢性缺氧的p16luc/luc小鼠的Fulton指数明显高于其p16luc/+和p16+/+对应的小鼠。
Result 8
MCT-诱导的大鼠PH与细胞衰老相关，表现为肺内p21、p16和γ-H2AX蛋白水平增加(图8A)，与CD31阳性血管和微血管的P-ECs以及α- SMA阳性PA-SMCs的p16染色增加一致(图8B-8D)。大鼠分别于造模当日和MCT注射当日给予navitoclax 50 mg·kg-1·d-1重复给药。Navitoclax降低了p21、p16和γ-H2AX蛋白的上调，并加重了mct诱导的PH(图8A)。在注射MCT的大鼠中，navitoclax治疗3周增加了肺动脉压、肺血管肌化和pcna染色的细胞计数(图8D)。这些血流动力学变化这些血流动力学变化伴随着IB4或CD31染色的P-ECs减少(图8B和8D)。
讨论：
衰老细胞在正常和病理性肺循环中具有重要作用。在第3组PH的老年患者，或者年轻患者中，均在重塑的血管中发现衰老标记物增加；重塑的肺血管内的衰老细胞聚集是与人类IPAH和实验性PH相关的关键过程；通过消除衰老细胞或使p16途径失活来减轻细胞衰老，与诱导肺血管重塑、P-ECs丢失和肺动脉压力升高相关；研究发现PAH患者重塑的血管中存在大量衰老细胞，并且衰老影响PA-SMC和P-ECs。
DNA损伤是与PAH相关的细胞改变之一。DNA损伤可能与PAH进展过程中重塑的肺血管中衰老细胞的积累有关；DNA损伤应答的一个潜在后果是随着细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂p21和16INK4A(被认为是细胞衰老的可靠标志物)上调而进入细胞衰老；低氧PH的发展与衰老细胞的积累有关。肺部衰老细胞的积累与DNA损伤标记γ-H2AX和53BP1的增加以及53BP1和p16的细胞共定位相一致。
本研究的临床意义：
（1）消除衰老内皮细胞的影响可能破坏对肺血管细胞生长的控制，从而促进或加重肺动脉高压的发生或进展。
（2）在许多情况下，抗衰老干预已被证明是有益的，但由于其对内皮细胞和肺血管的潜在影响，应谨慎使用。
（1）细胞衰老越来越引起心血管领域的关注，但是在第四组慢性血栓栓塞性肺动脉高压中的研究尚匮乏，可利用CTEPH患者的组织、细胞观察细胞衰老的变化。
Born E, Lipskaia L, Breau M, et al. Eliminating Senescent Cells Can Promote Pulmonary Hypertension Development and Progression. Circulation. 2023;147(8):650-666. doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.122.058794
