《自然生物技术》杂志发表了一篇题为“不依赖模板的 RNA 寡核苷酸酶合成”的新论文，详细介绍了一种单链 RNA 合成方法，该方法由哈佛大学 Wyss 生物启发工程研究所和哈佛医学院 (HMS) 的科学家开发。该技术正在由 EnPlusOne Biosciences 商业化，它生产的单链 RNA 的效率和纯度可与使用水和酶的传统化学合成相媲美，并且无需使用模板序列。
继成功对抗 COVID-19 感染后，人们对基于 RNA 的疗法的兴趣正在迅速增长。随着对 RNA 药物的需求不断增长以及“更多产品进入市场，我们将超过目前全球乙腈（用于化学 RNA 合成方法的有机溶剂）的供应量。
除了减少有毒合成副产物的产生外，研究者开发的技术还结合了当今 RNA 药物中常见的分子修饰，可与新型 RNA 化学反应一起使用来开发新疗法。以这种规模向世界提供 RNA 药物需要实现向可再生水合成的范式转变，有可能这种专有酶技术将实现这一转变。
a , 进行酶促延伸需要三个主要成分：3′-阻断的可逆终止核苷酸、能够进行稳健且无差别掺入的酶和启动寡核苷酸。可逆终止基团可阻止酶进行不受控制的聚合并将延伸限制为单个掺入事件。启动寡核苷酸的序列和长度可能有所不同。它还可以与固体支持物结合或具有其他修饰，例如 5′-荧光团或功能性手柄。
b ,典型的酶促合成循环始于 (1) 在 RT-NTP 和酶存在下延伸启动寡核苷酸。然后发生解阻断步骤 (2) 以从延伸的寡核苷酸中去除可逆终止基团，从而开始下一个合成循环。当达到所需的长度和组成时，分离最终的寡核苷酸产物。
该技术的起点是裂殖酵母（一种酵母菌株）中的一种酶，该酶用于形成 RNA 链。科学家们设计了一种更有效的酶，它还可以将非标准核苷酸整合到 RNA 中——这是一项必要的改进，因为每种 FDA 批准的 RNA 药物都含有经过修饰的核苷酸，可以提高其在体内的稳定性或赋予其新功能。他们的方法还使用更温和的方法来去除在合成过程中添加到核苷酸上以保护它们的保护基团。
此外，研究人员还通过添加一种称为“阻断剂”的化学基团来修改核苷酸，以确保每次将一个核苷酸添加到 RNA 链中。一旦所需的核苷酸被添加到链接中，阻断剂就会被移除，以允许序列中的下一个核苷酸结合。
与典型的四步化学合成相比，这个两步过程更简单，使用的试剂更少。据科学家介绍，他们的工艺效率也高达 95%，可以构建长达 23 个核苷酸的 RNA 分子。然而，他们指出，“本体阶段的总产量低于标准 RNA 寡核苷酸合成的产量”，这可能是由于“延伸和解阻断后经过多轮纯化”。
该方法的优势：
★更简单、更高效：该方法只需要两步，使用的试剂更少，效率更高，可以构建长达23个核苷酸的RNA分子。
★更高纯度：该方法产生的RNA纯度可与化学合成方法媲美，减少了对有毒溶剂的使用和合成副产物的产生。
★更大灵活性：该方法可以整合非标准核苷酸，为开发新型RNA疗法提供更大的可能性。
这项技术有望解决RNA药物生产面临的诸多挑战，包括：
★乙腈供应不足：传统的化学合成方法需要大量的乙腈，而乙腈是一种有毒的有机溶剂，其供应量正在日益减少。
★生产成本高：传统的化学合成方法需要昂贵的设备和材料，导致生产成本高昂。
★环境污染：传统的化学合成方法会产生大量的有毒废物，造成环境污染。
在一份声明中表示：“酶促核苷酸合成技术作为化学方法的替代方案具有许多优势。该平台可以帮助以可持续的方式释放 RNA 疗法的巨大潜力，尤其是制造用于 CRISPR/Cas 基因编辑的高质量向导 RNA 分子。
文章来源：Nature Biotechnology
https://doi.org/10.1038/s41587-024-02244-w
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