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关于线性研究实验设计，七个掏心掏肺的建议

文摘 2024-09-30 08:00 广东

在前面的系列文章当中，我给你介绍了如何解决线性参考品的规划、原料选择和制备等问题。

好，现在，我们终于获得了所需要的线性参考品，那么，接下来，就是用它去评估定量试剂了。

实验过程，是保证实验结果可靠的关键步骤，在我过去的工作当中，就遇到很多实验，因为对实验过程考虑不全面、控制不严格，给出了很多错误的信息，最后引发不少问题。

所以，我今天就来和你谈谈如何进行线性验证实验。

熟悉操作流程

对于我们IVD产品，往往是由试剂和仪器两部分组成，而且整个操作流程，都比较复杂，对于定量试剂来说，就更是如此。

所以，在开始之前，我们要保证负责实验的操作员是接受了操作培训，并且考核合格。

但光有这个恐怕还不够，验证实验实际上是一个评价试验，所以它比普通探索性质的实验要更加严格，所以，我们最好选择那些已经在实验室当中独自设置和操作过试剂盒一段时间的实验员来进行操作，这样才能尽可能的减少人为误差。

最后，在开始试验之前，要检查整个测量系统（试剂+设备），保证它在受控的状态下（比如，试剂在效期内，设备在保养期内），同时要确认，校准溯源链是没有问题的。

线性参考品的数量

对于一些比较成熟的技术，或者原料来说，我们可以使用一个高值样品来制备线性参考品，当然，线性参考品包括的浓度水平，需要覆盖整个线性范围。

但在其他情况下，嗯，其实也就是一般来说，我还是推荐使用两个高值样品来分别制备线性参考品，也就是说，对线性范围验证两次。这样做的目的，是避免单个患者样品当中，可能存在一些潜在的随机干扰，而如果我们只做一次的话，就没办法分辨出来。

有的时候，对于那些比较复杂，而且比较新的被测量或者检验技术来说，可能需要三个或者三个以上的高值样品来分别制备线性参考品，这个就要对自身产品的情况进行分析了，最好做一个风险评估。

另外，我还要强调一点，在进行线性研究的时候，最好还包括一个用零值校准品稀释的高值校准品，这份样本可以作为一个外部质控，来保证验证实验当中的赋值过程是没有问题的。

仪器和试剂的数量

线性研究实际上只需要在一个实验室当中进行就可以了，所以，如果我们想进行一个最小化的线性研究，那么就只需要一个测量系统（一台仪器+一批试剂）和一个溯源链（一批校准品）就可以了。

当然，如果你真的是想对自己的产品线性进行验证的话，这个数量肯定是不太够的，最好还是能够使用两批或者更多批次的试剂和校准品来对线性范围进行验证。

考虑到试生产的时候，我们会生产三批试剂，所以三批可能是一个不错的选择。

重复次数

对于验证来说，每个样品是否要做重复，重复次数又是几次，是需要非常严肃考虑的问题。

实际上，每个样品的重复次数，是根据定量试剂本身的精密度情况来确定的，我们可以参考下面这个确定方案。

首先，我们需要绘制出重复性曲线，也就是对线性参考品所在的浓度水平，测量其重复性，也就是运行内精密度的CV值，然后就可以绘制出一条重复性曲线。

如果，这条重复性曲线是一条直线，也就是说这个定量试剂呈现完全线性的关系，我们就可以根据表1，查询所需要的重复次数。

表1 | 确定线性研究中的重复次数要求

缩略语：%CV，以百分比表示的变异系数；ADL，允许线性偏差。

符号：δ，允许线性偏差。

[a]当根据本表的重复次数为两个或三个时，在可能的情况下，至少应测量四个重复次数。如果使用两个或三个重复，计算出的SD不应直接用于加权。

如果你在表当中查不到试剂对应的ADL值和CV值的话，那我们也可以利用公式来直接进行计算，具体如下：

再把公式变形一下，就可以得出重复次数R的公式：

当我们按照上面的方法确定了重复次数后，对于一个完全线性的定量试剂来说，也就意味着一个样品R次重复的均值与真实均值的偏倚不超过±δ的概率，不低于99%。

在这个情况下，如果我们选择线性参考品的浓度水平是9个的话，所有9个浓度水平的偏倚在±δ以内的概率是0.99^9 = 0.91；那么如果选择的浓度水平是11个的话，这个概率是0.99^11 = 0.895。

这也就是说，对于一个完全线性的定量试剂而言，当它使用9至11个浓度水平的线性参考品进行评价时，其线性范围超过±δ的概率，大概在10%左右，这也满足了I型错误的要求。

在《制定线性范围的目标：要是当年开发产品的时候，有人告诉我这些就好了》这篇文章当中，我指出过，在低浓度水平，ADL有的时候是用绝对值存在的，在这种情况下，我们就不能用CV来计算重复次数了，得用SD值，具体公式如下：

接下来我们可以这样计算：

所以，对于那些不完全线性的定量试剂，也就是%CV会随着浓度水平变化的实际来说，我们可以考虑，对于不同浓度水平的线性参考品，进行不同次数的重复。

这其实是一种更合理评价产品线性的做法，比如，在低浓度水平上，因为%CV比较大，而你的重复次数不够，导致线性验证通不过，那么这并不是试剂盒性能的问题，而是你验证实验设计本身不合理的问题。

从上面的计算当中，我们也可以发现看得出来，浓度水平越多，I型错误就会越大，所以，如果我们想要进一步增加浓度水平，但是呢，又希望I型错误风险不超过10%的时候，就要采用下面的公式来计算重复的次数：

那么，对于那些采用相对ADL，也就是%CV的定量试剂来说，就可以使用下面这个公式计算重复次数：

对于那些采用绝对ADL，也就是SD的定量试剂来说，就可以使用下面这个公式计算重复次数：

在这些公式当中，L是线性研究中浓度水平数量，X是线性验证失败的风险，α是单个浓度水平处于ADL之外的风险，Zα是标准正态分布的第α个四分位数。

当然，还有一种情况我们需要特别注意，那就是定量试剂本身和线性之间存在一个较小的偏倚，也就是线性拟合公式的截距不为0。

在这种情况下，我们就需要考虑更多的重复次数。

由于预期的真实线性偏差是DLTrue，那么在建立相关R的所有公式和表格中，就需要用%δ - %DLTrue（相对ADL）替换%δ，用δ - DLTrue（绝对ADL）替换δ。

比如，一个完全线性定量试剂的ADL为15%，CV为10%，这个时候我们去查表1，就可以得出它的最小重复次数是3次（表1当中ADL栏15%），但如果DLTrue为5%，那么重复次数就得是7次了（表1当中ADL栏10%，15% - 5% = 10%）。

运行次数

好了，当我们有了样品的重复次数之后，就能计算出本次线性验证实验当中，总共要运行多少次。

假设线性参考品当中包含M个浓度水平，每个浓度要重复R次，那么，我们总共需要测试的数量就是R×M次。

接下来，我们要确定定量试剂一次能够运行多少个测试（J）。

最好能够在一次运行当中，就能把整个线性研究验证做完，这是最好的方案。

这主要是因为我们计算重复次数的时候，采用的不精密度系数是重复性（运行内精密度），所以，如果必须要进行多次运行的话，那么情况就会变得比较复杂，我们要分几种情况来进行讨论。

如果定量试剂每次运行的测试量是超过线性参考品浓度水平数量的时候，也就是J ≥ M，那么，只需要保证每次运行当中，每个线性参考品浓度水平都至少测了一次就可以了，也就是说，每次运行都能够至少完整的跑一次线性参考品。

如果定量试剂每次运行的测试量是低于线性参考品浓度水平数量的时候，也就是J < M，这种情况就更复杂了，我们需要将线性范围分为几段，保证每次运行的时候，都能把这一段线性范围当中所包含的线性参考品都做完，然后再计算所需要的运行次数。

但要注意，无论是哪种多次运行的方案，都要对整个测量程序的精密度进行调整，并且可能需要重新计算重复次数，因为这个时候至少带入了一个新的随机误差来源——运行间精密度，当然，还有可能会带入一些其他变异来源，比如说，更换试剂盒带来的盒间差。

实验时间要求

既然都希望能够在一次运行当中，完成整个实验，所以对于实验时间来说，肯定是越快越好，理想情况下，对于单个线性参考品的所有实验结果，需要在同一天内获得，也就是在同一次运行或几次运行中完成。

其需要考虑的因素

由于线性参考品的浓度是梯度递增或者递减的，所以需要特别注意携带污染的问题。

面对这个问题，我有两个解决方案。

第一个，就是可以在每个线性参考品之间加入一个空白样品，或者执行一个冲洗程序，这样可以清洗掉枪上面可能带有的污染。

第二个，就是可以按照浓度递增的方案去设计线性参考品的检测顺序，而不是按照随机的顺序进行，因为携带污染是对那些先测了高值样本，然后再测低值样本的结果影响比较大。

关注我，降低产品上市认知门槛。

*个人观点，仅供参考。

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诊断科学，产品和合规咨询顾问，打造了《IVD上市课》等系列课程，曾为多家国内外诊断公司提供战略咨询服务，提倡“从概念到市场”的理念，为诊断厂家提供产品和合规规划的参考方向，一起更早看到未来。使命：降低产品上市认知门槛。

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