BDM AE哈佛大学张宇教授在《科学》发文：生物3D打印再生细胞疗法——组织结构的原位生物制造可以促进再生医学的发展

再生医学使用活细胞，将其注射或移植到病人体内，以达到预期的治疗效果，如创伤性伤口的愈合等。然而，如何在不丧失活力和功能的情况下将治疗细胞有效地运送到靶点，并确保组织整合是细胞治疗成功的关键挑战之一。因此，为了充分释放细胞治疗在再生医学中的潜力，采用、调整或开发更好的工具，通过各种生物制造技术来生产高质量的细胞基产品是大有益处的。

传统的再生细胞疗法是将细胞悬浮在培养液中，通过注射器或导管在体内直接注射到目标部位。尽管该方法简单，但临床效果并不令人满意，部分原因是注射的细胞并不能维持在靶位。为了解决这一问题，大块含细胞组织模块，具有植入后不容易分解的优势，已经成为一种有吸引力的替代品。无定形可注射水凝胶生物材料可以说是最常见的治疗细胞载体^[1]。替代方案是预制模块化结构，包括微凝胶和多孔聚合物微球，并在其中装载细胞^[2]。

这些方法有一些缺点，包括与天然组织相比不可避免地降低了细胞密度， 相比人工引入的生物材料与天然细胞外基质(ECM)其组织结构和空间组构均有不同。这些短处也促进了无生物材料细胞密集结构的使用，例如，在临床前研究和临床试验中，以平面^[3]或三维(3D)排列方式递送的细胞，如球体^[4]，在再生靶组织方面都取得了不同程度的成功。

然而，无论是采用生物材料富集还是不含生物材料的模块化结构，它们在注射后几乎总是随机地组成不规则的结构。这对于许多细胞治疗方案可能是可以接受的，但缺乏细胞组织可能会在更多方面的应用中存在不足，其中与治疗部位的天然几何形状的构象至关重要。例如，在皮肤损伤或肌肉损失的情况下，匹配组织结构要能达到结构、功能和美学效果合一也是很重要的。

为此，以细胞和生物材料的精确时空模式为特征的生物制造方法业已出现。沿着这些思路，生物增材制造有能力生成微尺度和宏观尺度的细胞负载结构，其几何形状与其天然靶组织结构非常相似^[5]。这种方法通常被称为生物3D打印，目前它具多种模式。

一种广泛使用的模式是挤出式生物打印，它使用喷嘴将生物墨水(细胞加上其它必要的构成和活性成分)，通常是多个生物墨水，逐点，然后逐层沉积到收集板上^[6]。经常采用的其他生物打印模式是喷墨生物打印^[7]和体积生物打印^[8]。喷墨生物打印将生物墨水的微小液滴喷射成精确的图案。而体积生物打印则使用一个或几个预先装载了可光固化生物材料的容器，通过光化学(单光子和多光子) ^[8]或声化学^[9]来生产3D结构。

到目前为止，生物增材制造在很大程度上依赖于使用生物材料来实现组织结构的体积结构和成形。将生物打印与无生物材料的细胞密集模块相结合，以确保原生细胞-细胞相互作用的展示集中在扭曲多细胞球体到图案针阵列上。在这种方法的后续版本中，吸气式微喷嘴被用来一个接一个地转移球体，使它们覆盖成体积图案，而不需要倾斜的针头^[6]。

与简单地将细胞球体叠加在一起相比，最近重大的进展是允许将无生物材料的细胞聚集体精确地构建成与组织相关的模式，其分辨率和复杂性都有所提高^[6]。例如，仅由体细胞颗粒组成的生物墨水可以装入生物打印喷嘴，并挤压成细胞丝，然后通过将仅包含细胞的生物墨水挤压到支持性水凝胶浴中来赋予图案化的能力。值得注意的是，当把仅含干细胞等无其他生物材料的生物墨水与挤出生物打印相结合时，可以产生具有明确时空排布的类器官。与纯粹由细胞自组装产生的传统球形类器官相比，这些生物打印的类器官在体外表现出更好的一致性、分化效率和组织形成性能。

大多数人体实体器官具有每立方厘米几十亿细胞的高细胞密度。这种安排对其复杂的功能和结构完整性至关重要。例如，人类的肝脏具有密集的细胞结构，这是其代谢和解毒活动所必需的。同样，心脏组织也表现出紧密排列的细胞，从而确保有效的电导率和收缩力来调节血液的泵送。因此，模拟这些高细胞密度的生物打印组织有望在移植时提供协同细胞相互作用、信号传导和组织整合，从而大大提高再生细胞治疗的效果。

到目前为止，添加剂生物制造与无生物材料、细胞密集的生物墨水的整合依赖于台式生物打印机的使用。这意味着组织必须首先被制造出来，成熟到分化表型，然后移植。通过将传统的生物增材制造方法转换为原位生物打印，可以进一步改进这一过程。这种方法包括在患者身体的目标部位直接绘制出生物墨水的图案，允许在需要再生或修复的实际生理位置精确地构建与位点匹配的组织结构^[10]。因此，原位生物打印可能具有很高的适应性; 降低污染风险; 更精简的程序;以及提高细胞活力、功能、宿主整合和美观。因此，原位生物打印不仅可以增强医院环境中的伤口再生，而且在紧急情况下也非常有益处，例如在迫切需要快速包扎的战场环境。

原位生物打印技术已经发展到可以直接应用于外科手术。技术范围从使用喷嘴的传统台式生物打印机，如从挤出和喷墨模型，到使用光或超声波作为成形能量源的聚合方法。目前的技术使用富含生物材料的生物墨水，致使细胞浓度稀释，生理相关性降低。使用由单细胞颗粒、球体或类器官和类器官形成干细胞组成的无生物材料、富含细胞的生物墨水，可以大大提高原位生物打印在再生医学中的治疗效果和临床适用性。

 图解：原位生物打印包括几种不同的方法^[10]。一种是使用传统的生物打印机，例如在手术过程中直接应用^[8,11]；另一种方法涉及到打印头的小型化，使其可以安装到手持设备中，从而实现外科医生指导下的创面原位手动式打印^[12]。该方法将实现快速可调和用户定义的3D图案形成。另外，对机器人驱动的基于导管式生物打印机进行编程也可以实现结构良好的治疗性细胞生物墨水的输送^[13]。使用其中一些方法的临床研究已经在计划中(见图示)。

值得注意的是，先前的原位生物打印的演示完全集中在利用富含细胞的生物材料的生物墨水上。然而，整合生物墨水，包括天然组织样细胞密度与原位生物打印可以提高其性能。这种组合的一些最初的例子采用微凝胶作为高密度细胞填充的构建块。这些微凝胶被预先培养形成靶细胞密集的微型组织，然后将它们作为生物链接聚集体加载到原位生物打印机中。使用机械臂驱动的原位挤压方法可以在体内修复大鼠颅骨缺陷^[14]；而喷墨生物打印机可以在体内修复小鼠的肌肉和皮肤缺陷^[15]。这些研究还表明，与相同的细胞致密微凝胶的简单、非结构化部署相比，以预先确定的模式原位递送的高细胞密度微型组织块可以加速更好的愈合。

展望未来，预计原位生物打印将开始包含真正的无生物材料的生物墨水，只包含单个细胞或它们的聚合体(球体或类器官)，它可以释放再生医学的全部潜力。这是因为当生物材料(其组成和精细结构在某种程度上经常与天然组织不同)的使用最小化时，生物打印结构中的高密度细胞将有机会在组织成熟过程中进行更强大的细胞间相互作用。这种成熟过程还允许细胞形成自己的组织特异性、分层结构和精细结构的细胞外基质（ECM），否则无法用人工引入的生物材料精确模仿。此外，当干细胞以所需的密度在原位进行生物打印以模拟早期发育阶段组织的形态时，可增强再生的高功能替代组织可能触手可及。值得注意的是，与之前仅通过简单注射实现的随机结构相比，满足局部组织精确结构、功能和美学需求的细胞密集聚集体将成为可能。

将原位生物打印与无生物材料、细胞密集的生物墨水结合起来，用于再生医学的细胞治疗并非没有挑战。与绘制富含生物材料的生物墨水不同，细胞密集模块的生物打印需要与周围组织微环境进行适当的粘附。此外，需要保持模块内部的内聚性，这可能不简单，需要额外的设计考虑，例如纳入促进细胞相互作用形成整体组织块的生长因子。此外，尽管针头注射是微创的，但根据使用的具体方法，使用原位生物打印机可能会导致稍微更具侵入性的过程。因此，仪器的细致工程是必要的，可能要利用最先进的显微外科设备和医学成像平台。

生物原位打印的模式将需要匹配特定的组织需求，例如，肌肉的单向排列，肝脏的重复小叶单位。为此，使用原位技术实现细胞密集生物链接的精确结构可能要求很高，并且可能需要对仪器进行额外的改进，例如可能与人工智能驱动的算法集成。另一个值得探索的有趣的领域可能是包含合适的线索，如趋化因子、基因编辑工具、治疗部分或其他生物活性药物，以便在原位生物打印后在治疗部位进行定向细胞修饰或分化，否则在没有预前成熟步骤的情况下可能在体内造成风险。这种方法可以通过使用聚合纳米颗粒、合成人工干细胞或细胞外囊泡来控制这些药物的释放，同时仍然保留最小的外源生物材料。最后，考虑到该技术的早期阶段，在转化应用之前，有必要进行广泛的临床前和临床研究，以解决这些挑战和安全问题。