研究目标及意义
本论文于2024年12月5日在线发表于Nature Chemical Engineering。研究目标是建立一个微生物平台用于从甘油(glycerol)生产多种芳香酯(aromatic esters)。芳香酯是一类具有风味和香味特征的化合物,在食品、医药、化妆品等行业有广泛应用。目前,芳香酯主要通过植物提取或化学合成获得,但产量低、成本高,不能满足工业化生产需求。因此,论文旨在通过构建人工生物合成途径(artificial biosynthetic pathway),利用甘油作为可再生的原料,实现芳香酯的微生物合成生产。
这个研究对产业发展具有重要意义:
提供了一条廉价、高效、环保的芳香酯生产新途径,有望替代传统的化学合成方法。 拓宽了合成生物学在精细化学品领域的应用,为从生物质原料定制生产高附加值产品提供了技术基础。 推动了发展以可再生原料为基础的生物制造产业,具有重要的战略意义。
正如论文introduction部分提到的:
Microbial production of these compounds represents an appealing alternative, but it is hampered by the incomplete understanding of their natural biosynthetic pathways and the limited biosynthetic efficiency.
微生物生产是一种有吸引力的替代方法,但由于对天然生物合成途径认识不完全以及生物合成效率有限,其应用受到限制。本研究的目标就是要突破这些瓶颈。
研究思路与方法创新
本文从以下几个方面进行了系统性的代谢工程改造:
设计人工生物合成途径。以苯丙氨酸为前体,通过多步酶促反应合成出目标产物苯甲酸苄酯(benzyl benzoate, BBZ)。关键酶包括苯丙氨酸解氨酶(PAL)、羧酸还原酶(Car)、苯甲酸辅酶A连接酶(PqsA)和O-酰基转移酶(BEBT1)等。 改造底物通道(substrate access tunnel)以提高Car酶的底物特异性。通过生物信息学分析预测底物通道结构,并进行氨基酸饱和突变,获得了对苯甲酸(BA)具有高特异性、对副产物肉桂酸(CA)活性大幅降低的Car酶突变体。 调控柠檬酸合成酶(GltA)以增强辅因子(cofactor)的供应。将乙酰辅酶A的代谢从乙酸生成分流至三羧酸循环(TCA cycle),同时引入反馈抑制不敏感的GltA*突变体,提高了三磷酸腺苷(ATP)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)等辅因子水平。 构建动态调控系统(dynamic regulation system)平衡细胞生长和产物合成。利用BA响应的转录调控器控制GltA*表达,实现了对细胞代谢的动态调控,在不影响生长的同时提高了产物合成能力。
与之前的方法相比,本文的创新之处在于:
提出了底物通道重塑这一蛋白质工程新策略,在不影响酶活性的前提下成功改变了酶的底物特异性。 创新性地调控了中心碳代谢,实现了多种辅因子水平的同步提高。传统方法往往通过过表达或敲除多个基因来增强辅因子的从头合成或再生,操作复杂且效果有限。 应用动态调控系统精准地控制了细胞代谢,在保证生长的同时将更多碳流引入产物合成。这避免了传统方法中对生长和合成的权衡,实现了二者的平衡。
正如论文中提到的:
Developing new and effective strategies or tools that precisely control cellular metabolism to fit the needs of the synthetic pathway is imperative to overcome these challenges.
开发新的有效策略或工具来精确控制细胞代谢以适应合成途径的需求,对于克服这些挑战至关重要。本研究提出的一系列创新策略为微生物细胞工厂的构建提供了新的思路和方法。
重塑酶底物通道提高底物特异性
论文利用计算机辅助的酶底物通道重塑策略,显著提高了羧酸还原酶Car对底物苯甲酸(BA)的特异性,有效抑制了副产物肉桂醇(CALC)的生成。
Using CAVER Web and CAVER Analysis 2.0 BETA to analyze the tunnel parameters for both static crystal structure and molecular dynamics (MD) snapshots, tunnel 3 consistently exhibited the highest throughput, lowest curvature and shortest length among the four tunnels (Supplementary Fig. 7b and Supplementary Table 1).
研究发现底物通道3的瓶颈半径最小,由疏水性氨基酸残基组成(图3b)。通过饱和突变筛选,获得了双突变体Q302Y/I303Y,其催化肉桂酸活性下降90%以上,而对苯甲酸催化效率与野生型相当(图3c,d)。动力学和分子动力学模拟证实了突变导致的空间位阻效应是底物选择性改变的原因。
将优化的Car整合到生物合成途径中,苯甲酸苄酯(BBZ)产量提高92倍,副产物CALC减少97.1%(图3e)。这突破了酶催化多样性导致副产物形成的认知瓶颈,为提高天然产物合成效率开辟了新思路。
重定向乙酰辅酶A代谢提高辅因子供应
论文创新性地调控了中心碳代谢,将乙酰辅酶A从乙酸形成分流至三羧酸循环,并过表达反馈不敏感的GltA*,从而提高多种辅因子水平。
The implementation of these strategies resulted in the generation of strains LLY26–31. Among them, strain LLY30 demonstrated superior performance, achieving the synthesis of 1,425.9 ± 22.3 mg l −1 of BA (Fig. 2a).
图2
通过柠檬酸合成酶基因gltA*的过表达,ATP、NADH、NADPH和CoA水平分别提高2.6倍、3.5倍、2.2倍和1.4倍(图4b)。应用于BBZ合成,产量提高3倍,达632.9 mg/L,且未检测到乙酸(图4c)。合成中间产物堆积量也降低60%以上。
图4
这一策略突破了辅因子供应不足限制代谢通量的技术瓶颈,避免了传统方法中复杂的基因操作和细胞负担,为优化细胞代谢提供了新思路。
构建动态控制系统平衡生长和合成
论文利用苯甲酸响应的动态调控系统,实现了gltA*表达与代谢需求的动态匹配,在不影响生长的同时将更多碳流引入产物合成。
We initially assessed the responsiveness and anti-interference ability of the dynamic regulatory circuit. As depicted in Supplementary Fig. 15, the fluorescence intensity showed a well-correlated relationship with BA concentrations within the range of 0–800 mg l −1 . In particular, the pathway intermediates CA and BALC were unable to activate P ben transcription.
研究构建了苯甲酸诱导的启动子Pben,对gltA表达进行动态控制(图5a)。与组成型表达相比,BBZ产量提高1.7倍达1091.3 mg/L,且检测到gltA呈延迟表达模式(图5b,c)。3 L发酵罐中BBZ产量进一步提高至10.4 g/L,是初始工程菌的4700倍(图5d)。
图5
这突破了生长和合成之间的权衡瓶颈,可实现高效稳定的合成生物学改造。动态调控系统的应用,为代谢工程提供了精细化控制手段,具有广阔前景。
构建底盘细胞实现多种芳香酯的生物合成
在BBZ高产菌株的基础上,研究者进一步整合乙酰基转移酶ATF2、羰基辅酶A连接酶PrpE和MseD等,构建了乙酸苄酯、丙酸苄酯和丁酸苄酯的生物合成途径(图6a)。
The host strain LLY42 yielded 624.3 ± 16.5 mg l −1 benzyl acetate (Fig. 6b and Supplementary Fig. 19), which is threefold higher than that of the previously reported benzyl-acetate-producing strain in shake-flask experiments.
工程菌LLY42、LLY43和LLY44分别生产624.3 mg/L乙酸苄酯、239.8 mg/L丙酸苄酯和45.4 mg/L丁酸苄酯(图6b),远高于文献报道水平。这展示了所构建微生物平台生产多种芳香酯的能力。
图6
该研究建立的底盘细胞和模块化合成策略,为开发新型芳香酯及其衍生物奠定了基础,极大拓展了产品谱系,具有重要工业应用价值。系统的合成生物学改造思路,对开发其他微生物细胞工厂也具有较好的指导意义。
小结
综上,本文在以下四个方面取得了创新性突破:
通过底物通道重塑提高酶催化特异性,有效抑制副产物形成。 重定向中心碳代谢,多路径提高辅因子供应水平。 引入动态控制系统,平衡生长和目标产物合成。 构建底盘细胞,实现多种芳香酯化合物的定制化生产。
研究成果的影响和应用
本研究建立的芳香酯微生物合成平台,为这类化合物的工业化生产提供了新的路线。相比于传统的植物提取和化学合成方法,其具有原料来源广泛、生产成本低、环境友好等优势。特别是利用废弃的生物质如甘油为原料,符合当前发展生物基和循环经济的理念。此外,通过整合不同的生物合成模块,该平台可以灵活地定制生产多种芳香酯产品,极大地拓展了其应用范围。正如论文中提到的:
Microbial cell factories hold great promise for generating target products from renewable carbon sources.
微生物细胞工厂在从可再生碳源生产目标产品方面具有巨大的应用前景。本研究为今后工业化应用奠定了良好的基础。
潜在的商业化机会包括:
开发芳香酯的微生物发酵生产工艺,替代当前的石化路线。 利用生物催化技术定制化合物结构,创制新型芳香化合物。 开发基于微生物的芳香酯香料制备技术,应用于食品、化妆品等日用消费品领域。 利用芳香酯作为化工原料,开发高值聚合物或医药中间体。
作为科研人员,后续还可关注:
提高关键酶的催化活性、稳定性和底物特异性,减少副产物形成。 进一步优化发酵工艺,放大到工业规模,提高产品的收率和经济性。 采用非食用碳源底物,如半纤维素、木糖等,降低原料成本。 探索新的芳香酯种类,开发差异化产品。
研究展望与投资机会
本文在芳香酯的微生物合成方面取得了重要突破,但要实现工业应用仍有不少问题亟待解决,其中包括:
提高生物合成效率。目前的产量仍不够高,距离经济可行的水平尚有差距。需要进一步提高关键酶的催化效率,优化代谢途径,减少副产物积累。 降低发酵成本。培养基和产物提取纯化过程是主要的成本来源。探索利用低成本原料,以及发展高效、低耗的分离提取新工艺,对于提高经济性至关重要。 开发更多功能化的芳香酯产品。引入修饰基团,合成新的衍生物,拓展产品的功能和应用,将极大提升产品附加值。 实现规模化生产。目前的发酵规模仍较小,放大过程中如何维持高水平的产量和稳定性,是工业化应用必须解决的问题。
未来的研究方向可能集中在:
采用组合生物合成、酶进化等新方法,创制结构新颖的非天然芳香酯化合物。 开发原料适应性强、遗传稳定性好的工业菌株,实现长周期、高效稳定的发酵生产。 发展基于人工智能和机器学习的代谢工程策略,加速新产品开发周期。 建立基于合成生物学的智能发酵装备和过程控制系统,实现高通量筛选和自动化生产。
这些研究方向可能催生出一系列新的技术成果和投资机会,如:
开发新型酶制剂,应用于芳香化合物合成、聚合物改性等领域。 开发面向终端应用的微生物发酵产品,如新型芳香酯香精香料、生物基增塑剂等。 开发基于人工智能的合成生物学实验云平台,提供菌株设计、工艺开发等定制化服务。
Biosyn导师：袁其朋
https://life.buct.edu.cn/2019/1031/c708a5662/page.htm
发布时间：2021-06-21
姓名：袁其朋
职称：教授
邮箱：yuanqp@mail.buct.edu.cn
办公地址：科技大厦西配楼314 |
教育背景：
1994.9-1997.6 天津大学化工工程与技术 博士研究生
1992.9-1994.6 天津大学化工工程与技术 硕士研究生
1987.9-1992.6 清华大学化学工程 学士
工作经历：
1997-1999 北京化工大学化学工程与技术博士后流动站，博士后
1999-2003 北京化工大学化学工程学院，副教授, 教授
2003-2017 北京化工大学生命科学与技术学院，院长
2017-2019 北京化工大学人才引进办公室，主任
2019-至今 北京化工大学 规划与学科建设办公室，主任
学术**：
化工资源有效利用国家重点实验室副主任、中国化工学会生物化工专业委员会副主任委员、中国纺织工程学会化纤专业委员会副主任委员、中国药学会制药工程专业委员会委员、中国工业生化与分子生物学分会理事会委员。
主要研究领域：
袁其朋教授是北京化工大学天然药物科学与工程学科的学术带头人，其研究主要集中于天然活性成分分离、生物合成及合成生物学等科学领域。围绕当前人民对健康的需求，聚焦于天然活性成分规模制备中的关键科学与技术问题，开展生物合成及分离领域的创新研究。有扎实的理论基础和丰富的实践经验，并且组建了一支综合素质良好的科研团队。在应用基础、技术创新及成果转化等方面成果突出，提升了国内植提行业的水平，发展了合成生物学领域构建高效细胞工厂的新方法，具有较高的国际影响力，形成了创新型基础研究与成果转化并重的特色。
1.天然活性成分分离
2.生物合成及合成生物学等
获奖及荣誉：
2018 全国商业科学技术进步奖特等奖
2017 中国石油和化学工业优秀出版教材奖一等奖
2016 科技北京百名领军人才培养工程
2015 教育部科学技术发明二等奖
2012 全国商业科学技术进步一等奖
2010 第十一届中国青年科技奖
2009 长江学者奖励计划特聘教授
2007 政府特殊津贴
2006 “新世纪优秀人才支持计划”
2006 教育创新标兵（北京市教育创新工程教育创新标兵）
2005 国家科学技术进步二等奖
2005 北京市科学技术二等奖
2002 北京地区产学研工作先进个人
